MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam nằm ở vùng trung tâm Đông Nam Á hàng năm có lượng mưa và nhiệt độ trung bình tương đối cao. Với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng, ẩm đã cho rừng Việt Nam một hệ thực vật đa dạng và phong phú. Nấm ký sinh côn trùng không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh học cao mà còn có vai trò quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng và trong y - dược tạo các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Trên thế giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó có hơn 400 nghìn loài nấm ký sinh côn trùng đã được biết ở trên thế giới. Nghệ An là tỉnh có Vườn Quốc gia Pù Mát, khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt. Đây là những vùng được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao. Tại đây chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho công nghệ sinh học nấm - côn trùng tạo chế phẩm sinh học trong phòng trừ sâu hại cây trồng và tạo sản phẩm có hoạt tính sinh học cao trong y - dược. Cho đến nay, nấm ký sinh côn trùng là nhóm duy nhất chưa nhận được sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học công nghệ nghiên cứu về nấm và côn trùng ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Từ lâu, Đông trùng hạ thảo vẫn được xem là bài thuốc quý cho y học phương Đông. Cho tới bây giờ, người Việt Nam và cả thế giới cũng còn chưa biết nhiều về loài dược liệu này nhưng ở Trung Quốc, các danh y đã sử 1 dụng Đông trùng hạ thảo trong các bài thuốc của mình từ hơn 2.000 năm trước. Mặc dù Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sp1) có giá trị kinh tế cao cũng như có các hoạt tính sinh học quý được sử dụng rộng rãi trong thực tế song việc nghiên cứu về thành phần hoá học của nó chưa được tiến hành nhiều ở Việt Nam. Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học của Đông trùng hạ thảo(Cordyceps sp1) một loại thực phẩm chức năng ở Việt Nam” từ đó góp phần xác định thành phần hoá học của các hợp chất và tìm ra hướng mới cho thực phẩm chức năng ở nước ta. 2. Nhiệm vụ nghiên cứu Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ: - Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sp1). - Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất Đông trùng hạ thảo(Cordyceps sp1). 3. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là dịch chiết Đông trùng hạ thảo(Cordyceps sp1). ở Việt Nam. 2 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Thực phẩm chức năng (Nutraceuticals hay Functional foods)[6] 1.1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng. Thực phẩm chức năng (Functional foods), có khi còn được gọi là thực phẩm bổ sung (Dietary supplement), thực ra không phải là một sản phẩm gì mới. Nó đang được các chuyên gia đánh giá là một xu thế dinh dưỡng của thế kỷ 21, đáp ứng một phần quan trọng về nhu cầu dinh dưỡng và sức khỏe con người trong cuộc sống hiện đại. Bên cạnh nhiệm vụ cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cho cơ thể, một số thực phẩm còn có vai trò “chức năng”, nghĩa là chức năng phòng chống bệnh tật và tăng cường sức khỏe chủ yếu nhờ vào những thành phần có tác dụng chống oxy hóa (β-caroten, lycopen, lutein, vitamin C, vitamin E .), chất xơ và một số hoạt chất khác. Thông tư số 08 (2004) của Bộ Y tế định nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh”. Do đó, TPCN khác với thực phẩm thông thường ở chỗ được sản xuất, chế biến theo công thức: bổ sung một số thành phần có lợi hoặc loại bỏ một số thành phần bất lợi của thực phẩm. Việc bổ sung hay loại bớt phải được chứng minh và cân nhắc một cách khoa học và được cơ quan nhà nước có thẩm quyền cho phép. Do đó, TPCN có tác dụng với sức khỏe nhiều hơn các chất dinh dưỡng thông thường và liều sử dụng thường nhỏ, thậm chí được tính bằng miligram hoặc gram. 3 Một hội nghị quốc tế về TPCN đã khuyến cáo không chấp nhận việc công bố khả năng chữa trị bệnh của TPCN, trên nhãn sản phẩm TPCN không được phép ghi chỉ định điều trị bất kỳ một bệnh cụ thể nào. Trong bảng phân loại thực phẩm hiện nay của Mỹ, được kể đến đầu tiên là những thực phẩm ở dạng tự nhiên đã có những hoạt chất có lợi với lượng nhiều; tiếp đó là nhóm thực phẩm chỉ có những hoạt chất với lượng ít và được bổ sung thêm, hoặc tinh chế cô đặc lại ở dạng dễ sử dụng, hoặc gây biến đổi gen để tăng hàm lượng một số chất có lợi. 1.1.2 Cách nhận biết các thực phẩm chức năng Có thể dễ dàng nhận biết những thực phẩm ở dạng tự nhiên sử dụng hàng ngày. Nhưng với những thực phẩm có bổ sung và biến đổi, đòi hỏi chúng ta phải biết cách đọc nhãn bao bì thực phẩm, với điều kiện chúng phải qua kiểm duyệt một cách nghiêm túc và được sản xuất bởi những công ty uy tín. Hiện nay, thực phẩm chức năng được quan tâm là loại đóng gói giống như những thực phẩm thông thường và trên bao bì cung cấp 2 loại thông tin. Thông tin thứ nhất có nội dung là “xác nhận có lợi cho sức khỏe” (health claims) và thứ hai là “xác nhận về cấu trúc/ chức năng” (structure/function claims). Những thực phẩm được xác nhận có lợi cho sức khỏe phải được Cơ quan Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận trước khi đưa ra thị trường tiêu thụ. Còn những thực phẩm có xác nhận về cấu trúc/ chức năng dùng để chuyển tải những lợi ích tiềm tàng (chứ chưa chắc chắn) của loại thực phẩm đó đối với sức khỏe con người. Ví dụ “có thể giúp hỗ trợ tiêu hóa” là nội dung thuộc dạng thứ hai, không đòi hỏi có xác nhận của FDA, nhưng nhà sản xuất phải xuất trình đầy đủ tài liệu để chứng minh khi đăng ký sản phẩm. 4 Hiện nay, các nước tiên tiến như Nhật, Anh và Mỹ vẫn đang nỗ lực để ngày càng hoàn thiện hệ thống phân loại, quản lý và phân phối thực phẩm chức năng đến người tiêu dùng. Tuy nhiên đến nay, thế giới vẫn chưa có một định nghĩa chung về thực phẩm chức năng vì còn một số thực phẩm muốn dán nhãn với định danh này nhưng không trải qua một thử nghiệm hoặc tuân theo tiêu chuẩn nào. Mặt khác, cũng có một số kiểu “luồn lách”, ví dụ như các thực phẩm chức năng được gắn tên “thực phẩm chữa bệnh” (medical foods) sẽ tránh được quy định của FDA, hoặc có trường hợp nhà sản xuất bổ sung thêm một số chất có lợi cho sức khỏe vào các sản phẩm giàu chất béo, cholesterol, đường . để bán ở dạng thực phẩm chức năng. Thực tế, mỗi năm vẫn có hàng ngàn người tiêu dùng than phiền về chất lượng và tính an toàn của chủng loại thực phẩm này. Do đó, điều quan trọng là chúng ta cần nhận biết những thực phẩm chức năng có ích đã được khoa học chứng minh khá đầy đủ với những loại thực phẩm chức năng cần phải nghiên cứu thêm, để không vội vàng sử dụng khi mới chỉ có kết quả của một vài nghiên cứu ban đầu. 1.1.3 Phân biệt thực phẩm chức năng với thực phẩm truyền thống Có rất nhiều các định nghĩa về thực phẩm chức năng; song tất cả đều thống nhất cho rằng: Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm nằm giới hạn giữa thực phẩm (truyền thống - Food) và thuốc (Drug). Thực phẩm chức năng thuộc khoảng giao thoa (còn gọi là vùng xám) giữa thực phẩm và thuốc. Vì thế người ta còn gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm - thuốc (Food-Drug). Các nhà chuyên môn đưa ra một số tiêu chí để phân biệt hai loại thực phẩm này như sau: Thực phẩm chức năng (Functional Food) khác với thực phẩm truyền thống (Food) ở chỗ: 5 * Được sản xuất, chế biến theo công thức: bổ sung một số thành phần có lợi hoặc loại bớt một số thành phần bất lợi (để kiêng). Việc bổ sung hay loại bớt phải được chứng minh và cân nhắc một cách khoa học và được cơ quan nhà nước có thẩm quyền cho phép (thường là phải theo tiêu chuẩn). * Có tác dụng với sức khỏe nhiều hơn (tác dụng với một hay một số chức năng sinh lý của cơ thể) hơn là các chất dinh dưỡng thông thường. Nghĩa là, thực phẩm chức năng ít tạo ra năng lượng (calorie) cho cơ thể như các loại thực phẩm truyền thống (cơ bản) như các loại thực phẩm gạo, thịt, cá… * Liều sử dụng thường nhỏ, thậm chí tính bằng miligram, gram như là thuốc. * Đối tượng sử dụng có chỉ định rõ rệt như người già, trẻ em, phụ nữ tuổi mãn kinh, người có hội chứng thiếu vi chất, rối loạn chức năng sinh lý nào đó… Thực phẩm chức năng khác với thuốc ở chỗ: * Nhà sản xuất công bố trên nhãn sản phẩm là thực phẩm, đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn sức khỏe, phù hợp với các quy định về thực phẩm. Đối với thuốc, nhà sản xuất công bố trên nhãn là sản phẩm thuốc, có tác dụng chữa bệnh, phòng bệnh với công dụng, chỉ định, liều dùng, chống chỉ định. Thuốc là những sản phẩm để điều trị và phòng bệnh, được chỉ định để nhằm tái lập, điều chỉnh hoặc sửa đổi chức năng sinh lý của cơ thể. Ví dụ: Trà bạc hà. Nếu ghi trên nhãn: Nước uống giải nhiệt, thì là Thực phẩm. Nếu ghi trên nhãn: Chỉ định điều trị rối loạn dạ dày, thì là Thuốc. * Có thể sử dụng thường xuyên, lâu dài nhằm nuôi dưỡng (thức ăn qua sonde), bổ dưỡng hoặc phòng ngừa các nguy cơ gây bệnh… mà vẫn an toàn, không có độc hại, không có phản ứng phụ. 6 * Người tiêu dùng có thể tự sử dụng theo “hướng dẫn cách sử dụng” của nhà sản xuất mà không cần khám bệnh, hoặc thầy thuốc phải kê đơn… 1.2. Chi Cordyceps 1.2.1. Phân loại Đông trùng hạ thảo còn gọi là trùng thảo, hạ thảo đông trùng hay đông trùng thảo là một giống nấm túi có tên khoa học là Cordyceps sinensis thuộc nhóm Ascomycetes mọc ký sinh trên sâu non (ấu trùng) của một loại sâu thuộc họ sâu Cánh bướm thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus. Ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh. Chi nấm Cordyceps có tới 350 loài khác nhau, chỉ riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy 60 loài. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất được về 2 loài Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris Link. Loài thứ hai được gọi là Nhộng trùng thảo [5]. 7 Hình 1: Ảnh của một số loài nấm ký sinh Cordyceps Nấm và sâu hợp sinh với nhau. Vào mùa đông, con sâu non nằm ở dưới đất, nấm phát triển trên toàn thân con sâu để hút chất dinh dưỡng làm cho con sâu chết. Đến mùa hạ, nấm sinh cơ chất (stroma) mọc chồi khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào đầu sâu. Người ta thường đào lấy tất cả xác sâu và nấm mà dùng làm thuốc. Vì mùa đông là con sâu, mùa hạ lại thành cây cỏ nên vị thuốc này có tên là đông trùng - hạ thảo. Chỉ phát hiện 8 được Đông trùng hạ thảovào mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000m. Hàng nghìn năm nay, Đông trùng hạ thảođược coi là thần dược trong y học cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc. Theo y học, Đông trùng hạ thảo có 2 loài: Sacc Link (dài từ 4 đến 11 cm) và Cordiceps ophiglossoides Her- Fr (dài từ 2 đến 6cm). Các nhà y học cổ truyền mô tả sự hình thành của Đông trùng hạ thảo như sau: Bộ nấm nang Ascomyces sống ký sinh trên vật chủ là sâu non của một loài bướm (Caterpillar) họ cánh vẩy, đặc biệt ở loài bướm đêm Hepialus armoricanus. Ban đêm bướm đẻ trứng, trứng nở thành ấu trùng rồi thành sâu non. Mùa đông sâu non chui xuống đất sinh sống. Trong môi trường ẩm, bào tử nấm Ascomyces phát triển trên thân sâu nở thành các sợi nấm, lan dần vào thịt sâu, phá hủy thân sâu non. Các sợi nấm phát triển thành một khối dày, chắc, thân sâu chỉ còn là một cái vỏ bao bọc các sợi nấm. Sang mùa hạ, từ miệng sâu, cuống nấm mọc ra, đội đất nhô lên, giữa cuống phình ra, trên bề mặt cuống có những mầm nhọn. Các mầm nhọn này nẩy ra một số hạt tròn, trong chứa các bào tử nấm. Thân nấm cao gần 10cm. Khi đào nấm lên làm thuốc, người ta thấy gốc nấm còn dính liền với đầu của xác sâu. Sau đây là vài chi tiết mô tả của sâu và cây nấm thực sự: Ấu trùng của bướm dài khoảng từ 3-6 cm, dày độ 0,4 - 0,7, sắc nâu vàng, mình nhám với nhiều vạch chạy ngang. Sâu có 8 cặp chân cụt ở khúc bụng và 4 cặp chân hơi dài ở khúc trên. Cắt ngang mình sâu thì thịt sâu ở ruột màu trắng hơi ngả vàng vàng, còn chung quanh có màu vàng sẫm. Cây nấm mọc từ đầu con sâu trông nhưng một cái cọng cắm vào, đầu cọng phình ra như cái chùy rồi thuôn nhỏ lại. Cây mầu nâu hay sẫm đen lại, 9 dài 4 - 8 cm, kính đo 0.3 cm, chót đầu há ra cho thấy ruột trắng ở trong và một hốc rỗng, đây là phần mang bào tử thường bị gẫy khi phơi khô. 1.2.2. Thành phần hoá học của chi Cordyceps Về thành phần hóa học, đông trùng hạ thảo chứa 25-32% protit (gần đây có thông báo cho rằng tỷ lệ này đạt tới 44,26%), khi thủy phân cho tới 14 - 19 axit amin khác nhau. Ngoài ra, còn có chứa nhiều loại vitamin như A, B1, B 2 , B 12 , C, E, K (trong 100g đông trùng hạ thảo có 0,12 g vitamin B 12 ; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, .) và các nguyên tố vi lượng như Na, K, Ca, Mg, Al, Mn, Cu, Zn, Bo, Fe . trong đó cao nhất là phosphor, một lượng đáng kể nước, chất béo, protein, chất sợi thô, carbohydrat tro khoáng chống oxy hóa, chống virus, chống ung bướu, axit glutamic [5], [45]. Mười một bioxanthracen (1-11) và 2 đồng phân (12 và 13), được phân lập từ nấm ký sinh trên côn trùng Cordyceps pseudomilitaris BCC1620 [25]. H CO 3 3 3 H CO 3 H CO O OH CH 3 OH H CO O CH 3 OH OH H CO 3 3 3 H CO 3 H CO O OH CH 3 OAc H CO O CH 3 OH OH (1) (2) 10 . Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học của Đông trùng hạ thảo( Cordyceps sp1) một loại thực phẩm chức năng ở Việt Nam từ đó góp phần xác định thành phần. Cordyceps 1.2.1. Phân loại Đông trùng hạ thảo còn gọi là trùng thảo, hạ thảo đông trùng hay đông trùng thảo là một giống nấm túi có tên khoa học là Cordyceps