1 MỤC LỤC GIỚI THIỆU CHUNG 5 CHƯƠNG I . 8 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐỀ TÀI 8 1/ Giới thiệu tổng quan về cá basa 8 1.1/ Tên khoa học của cá basa . 8 1.2/ Đặc điểm sinh học 8 1.3/ Tình hình phát triển cá basa ở Việt Nam 8 1.4/ Thành phần hóa học của cá 9 2. Tính chất hoá học của collagen 10 2.1/ Thành phần acid amin của collagen . 10 2.2/ Cấu tạo phân tử 12 2.2.1/ Đặc điểm cấu trúc phân tử của collagen (kiểu I) 12 2.2.2/ Đặc điểm cấu trúc sợi của collagen . 13 2.3/ Kiểu liên kết và tính chất của các liên kết ngang trong chuỗi . 13 2.3.1/ Liên kết hydro . 13 2.3.2/ Các liên kết kỵ nước . 16 2.3.3/ Các liên kết ion . 16 2.3.4/ Các liên kết cộng hoá trị . 16 3/ Các tính chất chức năng của collagen [7], [9] 22 3.1/ Sự liên kết với nước của collagen . 22 3.2/ Sự trương nở . 24 3.3/ Khả năng tạo nhũ tương . 24 3.4/ Sự tạo bọt 24 3.5/ Tính tạo nhớt 25 4/ Ứng dụng của collagen 25 4.1/ Ứng dụng collagen trong thực phẩm 25 4.2/ Ứng dụng collagen trong y dược . 26 4.3/ Ứng dụng collagen trong mỹ phẩm 27 5. Lịch sử nghiên cứu và tách chiết collagen 28 6. Quy trình tách chiết collagen . 29 CHƯƠNG II . 30 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 30 1/ Nguyên vật liệu nghiên cứu . 30 2 2/ Phương pháp nghiên cứu . 30 CHƯƠNG III 32 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN . 32 1/ Phân tích nguyên liệu . 32 2/ Xử lý da cá bằng NaOH 32 3. Xử lý da cá bằng LasNa 33 4. Xử lý da cá bằng H 2 O 2 33 5. Chiết bằng acid acetic . 35 6. Chiết bằng acid acetic và pepsin . 38 7/ Xác định đặc tính lý hoá của dịch collagen thu được . 41 7.1/ Kết quả phân tích collagen ở dạng tủa . 41 7.2/ Xác định phân tử lượng collagen bằng phương pháp điện di . 42 7.3/ Phân tích tính chất nhiệt của collagen dạng tủa 42 CHƯƠNG IV 44 KẾT LUẬN . 44 3 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng I.1. Các thành phần cơ bản (tính theo % căn bản ướt) của cá và thịt bò 10 Bảng I.2. Thành phần hóa học của cá (%) . 10 Bảng I.3: Thành phần các acid amin trong collagen . 10 Bảng I.4: Các loại collagen 11 Bảng III.1: Thành phần da cá Basa nguyên liệu 32 Bảng III.2: Kết quả xử lý da cá bằng NaOH . 33 Bảng III.3: Kết quả xử lý da cá bằng LasNa 0.1M (1%) 34 Bảng III.4: Kết quả xử lý da cá bằng H 2 O 2 . 33 4 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình I.1: Sự hình thành tropocollagen và sự kết hợp các tropocollagen thành sợi collagen. 12 Hình I.2: Sự hình thành sợi collagen 13 Hình I.3: Liên kết hydro giữa hai chuỗi gần nhau (A và B) của collagen 14 Hình I.4: Các tương tác liên kết ngang của lysine xảy ra trong môi trường . 19 Hình I.5: Các tương tác liên kết ngang của hydroxylysine xảy ra trong môi trường20 Hình I. 6 Ảnh hưởng của các anion đơn, đôi và đa hoá trị lên đường cong hydrat hoá theo pH 23 Hình III.1: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất béo theo thời gian xử lý LasNa0.1M (1%) 34 Hình III.2: Kết quả chiết collagen ở 3 o C, tỷ lệ R/L = 1/50 . 35 Hình III.3: Kết quả chiết collagen ở 3oC, tỷ lệ R/L = 1/100 35 Hình III.4: Kết quả chiết collagen ở 10oC, tỷ lệ R/L = 1/50 36 Hình III.5: Kết quả chiết collagen ở 10oC, tỷ lệ R/L = 1/100 36 Hình III.6: Kết quả chiết collagen ở 15oC, tỷ lệ R/L = 1/50 37 Hình III.7: Kết quả chiết collagen ở 15oC, tỷ lệ R/L = 1/100 37 Hình III.8: Kết quả chiết collagen ở 3 o C, tỷ lệ R/L = 1/20 . 39 Hình III.9: Kết quả chiết collagen ở 3 o C, tỷ lệ R/L = 1/80 . 39 Hình III.10: Kết quả chiết collagen ở 17 o C, tỷ lệ R/L = 1/20 . 40 Hình III.11: Kết quả chiết collagen ở 17 o C, tỷ lệ R/L = 1/80 . 40 Hình III.12: Kết quả chiết collagen ở 10 o C, tỷ lệ R/L = 1/50 . 41 Hình III.13:Hình chụp điện di collagen trên SDS-PAGE . 42 Hình III.14: đồ thị nhiệt của collagen dạng tủa chụp bằng máy DSC1. . 43 5 GIỚI THIỆU CHUNG Thủy sản là một trong những ngành kinh tế quan trọng nhất của Việt Nam, một nước có đường bờ biển dài trên 3.200 km và một Vùng Đặc quyền Kinh tế (EEZ) có diện tích trên 1 triệu km 2 và 1,4 triệu héc-ta diện tích đánh bắt nội đồng gồm sông ngòi, hồ đầm và ruộng cá có thể sử dụng để nuôi trồng thủy sản. 600.000 héc-ta tập trung ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long. 800.000 héc-ta còn lại nằm ở vùng Đồng bằng sông Hồng phía Bắc và vùng duyên hải. Theo số liệu của ngành thủy sản, trên hải phận Việt Nam có khoảng 2.000 loài cá biển trong đó xấp xỉ 130 loài có giá trị thương mại. Lượng cá biể n ước tính khoảng 4,2 triệu tấn và tổng nguồn tài nguyên có thể phục hồi ước tính khoảng 1,73 triệu tấn. Ngành chế biến thủy sản nói chung và ngành sản xuất cá, đặc biệt là sản xuất philê cá thải ra một lượng phế phụ phẩm rất lớn (Ở Việt Nam, chỉ tính riêng phế phụ phẩm từ sản xuất philê cá basa năm 2008 đã lên tới 700.000 tấn). Lượng phế phụ phẩm này ở nước ta từ trước đến nay chưa được quan tâm sử dụng đúng mức, thậm chí còn bị xem là chất thải. Tuy nhiên, ngày nay cùng với sự gia tăng dân số toàn cầu đã kéo theo nguy cơ về cạn kiệt các nguồn tài nguyên, cạn kiệt nguồn nguyên liệu, nhiên liệu cho sản xuất; chính vì vậy cả thế giới đang quan tâm đến vấn đề phát triển bền vững, sử dụng chất thải c ủa ngành sản xuất này làm nguyên liệu cho ngành sản xuất khác. Theo hướng này, chất thải thủy sản có thể dùng để làm phân bón, chế biến thức ăn gia súc, làm bao bì sinh học, làm môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp các chế phẩm sinh học, là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất cần thiết cho ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm,… Colagen được xem như một loại dược liệu quý giúp kéo dài tuổi thanh xuân cho con người. Việc sản xu ất colagen có nhiều ý nghĩa lớn đối với ngành thực phẩm, y học và ngành sản xuất mỹ phẩm + Trong sản xuất thực phẩm : collagen được dùng để làm vỏ bao xúc xích, kẹo, ., là nguyên liệu sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng. + Trong y học: collagen được ứng dụng rộng rãi trong việc chế tạo da nhân tạo để điều tr ị những vết bỏng sâu, ứng dụng trong nha khoa, phẫu thuật chỉnh hình, làm vỏ bọc thuốc,… + Trong mỹ phẩm: colagen chứa các tác nhân làm ẩm tự nhiên đối với cơ thể, có vai trò chống nhăn, giữ cho da mềm và sáng; hơn nữa colagen còn dùng làm nguyên 6 liệu để sản xuất các sản phẩm như: mặt nạ, kem dưỡng da cao cấp, dầu gội,các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa tắm,… Trên thế giới, việc nghiên cứu về collagen đã tiến hành từ năm 1930 bởi người Đức; thời kỳ đó người ta tách chiết colagen chủ yếu từ da và xương của trâu, bò, lợn. Tuy nhiên đến năm 1990 đã bắt đầ u một hướng chuyển biến mới: bắt đầu “tách chiết collagen từ da cá” phát minh này của các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học Gdansk (Ba Lan) đã gây tiếng vang mạnh mẽ trên toàn cầu. Trong những năm gần đây nhiều quốc gia như: Mỹ, Đức, Pháp, Ba Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc đã đầu tư hàng triệu đôla vào nghiên cứu thu nhận collagen để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng, da nhân tạo, chỉ t ự tiêu, thuốc mỡ điều trị bỏng và các sản phẩm làm đẹp như mặt nạ, kem dưỡng da, dầu dưỡng tóc,… Nhận thấy nhu cầu rất lớn về collagen trên thế giới cũng như ở Việt Nam trong những năm gần đây, đồng thời việc nghiên cứu tách chiết, sản xuất collagen ở Việt Nam hầu như chưa có, trong khi nguồn nguyên liệu da và xương cá để sả n xuất collagen ở nước ta khá dồi dào, ổn định, giá rẻ và có tiềm năng phát triển nên chúng tôi chọn đề tài “Tách collagen từ da cá basa bằng phương pháp hoá sinh” với mong muốn tạo ra nguồn nguyên liệu collagen có giá cả phù hợp cung cấp cho các nhà sản xuất trong nước; nâng cao hiệu quả kinh tế cho các ngư dân và nhà sản xuất thủy sản; đồng thời cũng góp phần vào việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứ u công nghệ tách collagen từ da cá basa - Thu được collagen thô ở dạng dịch chiết Nội dung nghiên cứu - Thu thập tài liệu, tìm hiểu về cấu tạo, cấu trúc, tính chất, chức năng của collagen cá; các phương pháp tách chiết collagen. Các phương pháp xác định đặc tính hoá lý của collagen. - Phân tích nguyên liệu (da cá basa): xác định độ ẩm, độ tro, lipid, hàm lượng collagen,… - Xử lý da cá và chiết collagen từ da cá basa + Xử lý da cá bằng NaOH + Tách béo bằng LasNa + Xử lý da cá bằng H 2 O 2 7 + Chiết collagen bằng acid acetic + Chiết collagen bằng phương pháp kết hợp enzym pepsin và acid acetic - Xác định một số đặc tính hoá lý của dịch chiết collagen: xác định phân tử lượng bằng SDS-PAGE, xác định nhiệt độ biến tính, hàm lượng tro, hàm lương béo, hàm lượng collagen 8 CHƯƠNG I CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐỀ TÀI 1/ Giới thiệu tổng quan về cá basa 1.1/ Tên khoa học của cá basa Theo hệ thống phân loại Tyson Roberts, cá ba sa thuộc họ Pangasiidae, giống Pangasius, loài P. bocourti. Trước đây cá Basa được định danh là Pangasius pangasius (Hamilton) (Mai Đình Yên et al., 1992; Trương Thủ Khoa, Trần Thị Thu Hương, 1993), Pangasius nasutus (Blecker) (Kawamoto và cộng sự., 1972). 1.2/ Đặc điểm sinh học - Về ngoại hình, cá basa rất dễ phân biệt đối với các loài khác trong họ Cá tra. Thân ngắn hình thoi, hơi dẹp bên, l ườn tròn, bụng to tích lũy nhiều mỡ, chiều dài tiêu chuẩn bằng 2,5 lần chiều cao thân. Đầu cá basa ngắn hơi tròn, dẹp đứng. Miệng hẹp, chiều rộng của miệng ít hơn 10% chiều dài chuẩn, miệng nằm hơi lệch dưới mõm. Dải răng hàm trên to rộng và có thể nhìn thấy được khi miệng khép lại, có 2 đôi râu, râu hàm tren bằng ½ chiều dài đầu; râu hàm dưới bằng 1/3 chiều dài đầu. Răng trên xương khẩu cái là mộ t đám có vết lõm sâu ở giữa và hai đám răng trên xương lá mía nằm hai bên. Có 40-46 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 31-36 tia vây. Răng vòm miệng với dải răng trên xương khẩu cái ở giữa và răng trên xương lá mía ở 2 bên. Chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn. Mặt lưng có màu nâu, mặt bụng có màu trắng. - Phân bố: Cá Basa phân bố rộng ở Miến Điện, Java, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam. 1.3/ Tình hình phát triển cá basa ở Vi ệt Nam Ở Việt Nam 2 họ chính trong bộ cá trơn được nghiên cứu là họ Pangasiidae và Clariidae. 9 Họ Pangasiidae có 21 loài thuộc 2 giống: giống Pangasius có 19 loài và giống Helicophagus có 2 loài. Có một loài sống trong nước lợ, 2 loài sống ở biển. Tính ăn của các loài trong họ Pangasiidae thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển của cá thể. Trong họ Pangasiidae 2 loài cá basa và cá tra là cá nuôi kinh tế của đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt trong hình thức nuôi tăng sản. Đồng bằng sông Cửu Long vốn có truyền thống nuôi cá tra và cá ba sa từ lâu đời. Cá tra được phổ biến trong ao, đăng quầng, bãi bồi và nuôi lồng bè; cá ba sa chủ yếu được nuôi lồng bè trên các con sông lớn thuộc các tỉnh An Giang, Đồng Tháp. Hiện nay cá tra và cá ba sa đã được nơi ở hầu hết các tỉnh trong vùng. Những năm gần đây , Việc nuôi các loài cá này phát triển mạnh nhằm phục vụ tiêu thụ nội địa và cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu. Đặc biệt từ khi chúng ta hoàn toàn chủ động về giống nhân tạo thì nghề nuôi càng ổn, định và có những bước phát triển vượt bậc. Thế nhưng do phát triển một cách tự phát nên khủng hoảng thừa cá nguyên liệu, cả người nuôi lẫn doanh nghiệp chế biến xuất khẩu đều gặp khó khăn. Đến 6 tháng đầu năm 2008 nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL đều tăng cả về diện tích, sản lượng và năng suất bình quân/ha. (Nguồn VOH, 29/06/2008) 1.4/ Thành phần hóa học của cá [5] Thành phần hóa học gồm: nước, protein lipid, muối vô cơ , vitamin . Các thành phần này khác nhau rất nhiều, thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện sinh sống, . Ngoài ra, các yếu tố như thành phần thức ăn, môi trường sống, kích cỡ cá và các đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học, đặc biệt là ở cá nuôi. Các yếu tố này có thể kiểm soát được trong chừng mực nào đó. Các thành phần cơ bản của cá và động vật có vú có thể chia thành những nhóm có cùng tính ch ất. 10 Bảng I.1. Các thành phần cơ bản (tính theo % căn bản ướt) của cá và thịt bò Sự khác nhau về thành phần hóa học của cá và sự biến đổi của chúng có ảnh hưởng đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, việc bảo quản tươi nguyên liệu và qui trình chế biến. Thành phần hóa học của cá ở từng cơ quan, bộ phận có sự khác nhau Bảng I.2. Thành phần hóa học của cá (%) Thành phầnChỉ tiêu Nước Protein Lipid Muối vô cơ Thịt cá 48 – 85,1 10,3 – 24,4 0,1 – 5,4 0,5 – 5,6 Trứng cá 60 - 70 20 - 30 1 - 11 1 – 2 Gan cá 40 - 75 8 - 18 3 - 5 0,5 – 1,5 Da cá 60 - 70 7 - 15 5 - 10 1 - 3 2/ Tính chất hoá học của collagen 2.1/ Thành phần acid amin của collagen Bảng I.3: Thành phần các acid amin trong collagen [7] Thành phần Cá (phi lê) Tối thiểu Thông thường Tối đa Thịt nạc bò Protein 6 16 – 21 28 20 Lipid 0,1 0,2 – 25 67 3 Carbohydrate - < 0,5 - 1 Tro 0,4 1,2 – 1,5 1,5 1 Nước 28 66 – 81 96 75 . collagen, … - Xử lý da cá và chiết collagen từ da cá basa + Xử lý da cá bằng NaOH + Tách béo bằng LasNa + Xử lý da cá bằng H 2 O 2 7 + Chiết collagen bằng. năng của collagen cá; các phương pháp tách chiết collagen. Các phương pháp xác định đặc tính hoá lý của collagen. - Phân tích nguyên liệu (da cá basa) : xác