i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến: * Ban Giám hiệu trường Đại học Lạc Hồng, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học và Môi trường – trường Đại học Lạc Hồng. * PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân, giảng viên Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường ĐHNL. TP. HCM. * TS. Hồ Thị Kim Hoa, giảng viên Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường ĐHNL. TP. HCM. * Quý cán bộ công chức tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - trường Đ HNL. TP. HCM đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện để hoàn thành đề tài. * Các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn, Đoàn Thị Tuyết Lê ii TÓM TẮT Đề tài “Phân biệt thịt trâu và thịt bò bằng kỹ thuật PCR” được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM từ ngày 15/10/2010 đến ngày 1/5/2011. Mục tiêu nghiên cứu là: xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt trâu, thịt bò sử dụng primer tự thiết kế; ứng dụng quy trình PCR-trâu và PCR-bò để phát hiện thịt trâu và thịt bò đối với hỗn hợp DNA, hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt, có có xử lý nhiệt và m ẫu bột thịt trên thị trường nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc. Kết quả đạt được như sau: Quy trình PCR phát hiện thịt trâu với forward primer và reverse primer có trình tự như sau 5’- CTACACATCCGA CACAACAACAGC-3’, 5’- ATGTAGCAGGGGCAT GAGAA-3’. Mẫu DNA được biến tính ở 94 o C trong 4 phút sau đó được khuếch đại qua 35 chu kỳ nhiệt: biến tính 94 o C/1’, ủ bắt cặp ở 56 o C/ 45’’, kéo dài ở 72 o C/1’ và kết thúc ở 72 o C/5’. Nồng độ DNA trâu thấp nhất mà PCR-trâu có thể phát hiện là 0,001 ng/μl. Tỷ lệ DNA thịt trâu thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò, dê, cừu mà PCR-trâu có thể phát hiện là 0,1%. Tỷ lệ thịt trâu thấp nhất mà PCR-trâu có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò, dê, cừu là 0,1%. Quy trình PCR-trâu có khả năng phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý ở 80 o C/15’, 120 o C/15’, 130 o C/15’, 180 o C/15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt trâu với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120 o C/30’ và 130 o C/30’. Quy trình PCR phát hiện thịt bò với forward primer là 5’-CTACACATCCGA CACAACAACAGC-3’, reverse primer là 5’-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC -3’. Quy trình nhiệt như sau: tiền biến tính 94 o C/4’; 35 chu kỳ: biến tính ở 94 o C/1’, bắt cặp ở 54 o C/ 45’’, kéo dài ở 72 o C/1’; kéo dài cuối cùng ở 72 o C/5’. Nồng độ DNA bò thấp nhất mà PCR-bò có thể phát hiện là 0,001 ng/μl. Tỷ lệ DNA bò thấp nhất trong hỗn hợp DNA giảm dần của trâu, bò, dê, cừu mà PCR-bò có thể phát hiện là 0,05%. Tỷ lệ thịt bò thấp nhất mà PCR-bò có thể phát hiện trong hỗn hợp thịt giảm dần của trâu, bò, dê, cừu là 0,1%. PCR-bò có khả năng phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý ở 80 o C/15’, 180 o C/15’ nhưng không có khả năng phát hiện thịt bò với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt xử lý ở 120 o C/15’, 120 o C/30’, 130 o C/15’ và 130 o C/30’. iii SUMMARY Research project “Differentiation of meat species of buffalo, cattle by PCR techniques” was carried out at Institute of Biotechnology & Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from October 15, 2010 to May 1, 2011. The project was aimed: (i) to establish PCR reactions for identification of beef and buffalo meat; (ii) consequently, to apply these reactions in identification of meat species in raw and processed meat mixtures. The results were summarized as follows: PCR protocol for detection of buffalo meat (buffalo-PCR) using specific primers was accomplished. A new set of primers for buffalo meat were designed and tested (Forward primer, 5'-CTACACATCCGACACAACAACAGC-3' and reverse primer, 5'-ATGTAGCAGGGGCATGAGAA-3'). Amplification reaction was started with pre- denaturation step at 94 o C/4', followed by 35 cycles including 94 o C/1', 56 o C/45'', 72 o C/1’ and final extension at 72 o C/5'. The lowest concentration of buffalo DNA that could be detected by buffalo-PCR was 0.001 ng/μl. The lowest rate of buffalo DNA in the DNA mixture reduced ratio of DNA from raw meat of buffalo, cattle, goat, sheep that buffalo-PCR could detect was 0.1%, which is the same as the lowest rate of buffalo meat that buffalo-PCR could detect in the meat mixture with reduced ratio of buffalo, beef, goat, sheep. The PCR was successfully applied to detect buffalo meat in mixtures having been processed at 80 o C/15’, 120 o C/15’, 130 o C/15’, 180 o C/15’ but was not in the case of meat mixtures that had ≤ 10% buffalo meat and had been heated at 120 o C/30’ and 130 o C/30’. PCR protocol for detection of beef (cattle-PCR) was set up. The new set of primers for the PCR to detect beef were: forward primer, 5'-CTACACATCCGACAC AACAACAGC-3’, and reverse primer, 5'-TCAGTAGGTCTGCTACTAGGGC-3'. The thermal process was as follows: 94 o C/4' for initial denaturation, 35 cycles of denaturation at 94 o C/1’, annealing at 54 o C/45'', enlongation at 72 o C/1’ and final extension at 72 o C/5’. The cattle-PCR could detect cattle DNA with the concentration as low as 0.001 ng/μl. The lowest rate of cattle DNA in the mixture reduced ratio of DNA from the raw meat of the buffalo, cattle, goat, sheep that cattle-PCR could detect was 0.05%. The lowest rate of cattle meat that cattle-PCR could detect in the reduced ratio mixture of buffalo, goats, sheep meat was 0.1%. This PCR protocol was successfully to detect beef in meat mixtures which was processed at 80 o C/15', 180 o C/15' but was not to identify the meat in those had ≤ 10% buffalo meat and had been processed at 120 o C/15’, 120 o C/30’, 130 o C/15’, and 130 o C/30’. iv MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG LỜI CẢM ƠN .i TÓM TẮT . ii SUMMARY . iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT . vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii DANH SÁCH SƠ ĐỒ . viii DANH SÁCH CÁC BẢNG .ix Chương 1 .1 MỞ ĐẦU .1 1.1. Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu 2 1.3 Mục đích 2 Chương 2 .3 TỔNG QUAN 3 2.1. Sơ lược về thịt và thịt chế biến .3 2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt 3 2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến 4 2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam .4 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới 4 2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam 5 2.2. Các phương pháp phát hiện thịt 6 2.2.1 Phương pháp dựa vào protein .6 2.2.1.1 Phương pháp điện di .6 2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch 8 2.2.1.3. Phương pháp sắc ký .8 2.2.2. Phương pháp dựa vào DNA .9 2.2.2.1 Phương pháp lai DNA 9 2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR 11 2.3 DNA ty thể và gen cytochrome b trong việc phát hiện loài 21 2.3.1 DNA ty thể 21 2.3.2 Di truyền của ty thể .25 2.3.3 Sử dụng gen cytochrome b để phát hiện nguồn gốc loài trong các sản phẩm thịt chế biến 25 2.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu về phát hiện loài của thịt bằng phương pháp PCR 26 Chương 3 .29 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 29 3.2 Nội dung nghiên cứu .29 3.3 Vật liệu .29 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA 29 3.3.2 Primer 29 3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ .29 v 3.4 Phương pháp tiến hành 30 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 30 3.4.2 Tách chiết DNA 30 3.4.3 Thiết kế và kiểm tra primer phát hiện thịt trâu và thịt bò .31 3.4.3.1 Thiết kế primer .31 3.4.3.3 Kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC 32 3.4.4 Xác định quy trình PCR- trâu và PCR-bò .33 3.4.5 Ứng dụng PCR-trâu, PCR-bò để phát hiện thịt trâu, bò .33 3.4.5.1 Ứng dụng PCR-trâu 33 a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-trâu .33 b. PCR-trâu với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 33 c. PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .34 d. PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 34 e. PCR-trâu với bột thịt trên thị trường .34 3.4.5.2 Ứng dụng PCR-bò 36 a. Xác định giới hạn phát hiện của PCR-bò 36 b. PCR-bò với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 36 c. PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 36 d. PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 36 e. PCR-bò với bột thịt trên thị trường .36 Chương 4 .38 KẾT QUẢ THẢO LUẬN .38 4.1 Kết quả thiết kế và tổng hợp primer phát hiện thịt trâu, thịt bò 38 4.2 Kết quả kiểm tra lý thuyết độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC .38 4.2.1 Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR .38 4.2.2 Kết quả kiểm tra bằng Clustal W 39 4.2.3 Kết quả BLAST 39 4.3 Kết quả kiểm tra trên thực tế độ đặc hiệu các cặp primer F&RB, F&RC .40 4.3.1 Bằng PCR .40 4.3.1.1 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A và B 40 4.3.1.2 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C và D 41 4.3.1.3 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E và F .41 4.3.1.4 Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G và H 41 4.3.1.5 Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua .43 4.3.2 Giải trình tự sản phẩm PCR của cặp F&RB; F&RC đặc hiệu 43 4.3.3 Xác nhận sản phẩm khuếch đại là của thịt trâu và bò .44 4.3.3.1 BLAST .44 4.3.3.2 Gởi mã số lên NCBI cho trình tự đoạn DNA của thịt trâu và bò .44 4.4 Xác định quy trình PCR-trâu .45 4.5 Xác định quy trình PCR-bò .45 4.6 Ứng dụng PCR-trâu, PCR-bò .45 4.6.1 Ứng dụng PCR-trâu 45 vi 4.6.1.1 Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu .45 4.6.1.2 PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 46 4.6.1.3 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 46 4.6.1.4 PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt .47 4.6.1.5 PCR-trâu với bột thịt trên thị trường 48 4.6.2 Ứng dụng PCR-bò .49 4.6.2.1 Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCR-bò .49 4.6.2.2 PCR-bò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 49 4.6.2.3 PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt 50 4.6.2.4 PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt .50 4.6.2.5 PCR-bò với bột thịt trên thị trường 53 Chương 5 .54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .54 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .55 PHỤ LỤC 65 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSE : bovine spongiform encephalophathy GC : gas chromatography HPLC : high performance liquid chromatography IEF : isoelectric focusing LC : liquid chromatography LTRs : long terminal repeats MT-ATP6 : mitochondrially encoded ATP synthase 6 mtDNA : mitochondrial deoxyribonucleic acid MT-ND1 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 1 MT-ND4 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4 MT-ND4L : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4L MT-ND5 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 5 MT-ND6 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 6 MT-RNR1 : mitochondrially encoded 12S RNA MT-TH : mitochondrially encoded tRNA histidine MT-TL1 : mitochondrially encoded tRNA leucine 1 (UUA/G) MT-TS1 : mitochondrially encoded tRNA serine 1 (UCN) MT-TV : mitochondrially encoded tRNA valine NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide PCR : polymerase chain reaction Prion : proteinaceous infectious particle RCB : reverse primer cattle &/ buffalo (theo Matsunaga & ctv, 1999) RP- HPLC : reverse phase high performance liquid chromatography SSRs : simple sequence repeats viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Mô hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA 10 Hình 2.2: Genome của ty thể .24 Hình 4.1: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer A (F1-RBU1) và B (F1-RBU2) 41 Hình 4.2: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer C (F1-RC1) và D (F1-RC2) 41 Hình 4.3: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer E (F2-RBU1)và F (F2-RBU2) 42 Hình 4.4: Kết quả kiểm tra tổ hợp primer G ((F2-RC1) và H (F2-RC2) 42 Hình 4.5: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2 &RBU2 (Ta=56 o C) 42 Hình 4.6: Kiểm tra độ đặc hiệu primer F2&RBU2 và F2&RC2 với các DNA template của lúa, đậu phộng, đậu nành, mè, cà chua .43 Hình 4.7: Giới hạn nồng độ DNA trâu có thể phát hiện được của PCR-trâu 45 Hình 4.8: PCR-trâu đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu .46 Hình 4.9: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .46 Hình 4.10: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80 o C/15’(M2.1-M2.7) và 180 o C/15’ (M7.1-M7.7) .47 Hình 4.11: PCR-trâu phát hiện thịt trâu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130 o C/30’(M6.1-M6.7) và 120 o C/15’ (M3.1-M3.7) .47 Hình 4.12: PCR-trâu phát hiện thịt trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130 o C/15’(M5.1-M5.7) và 120 o C/30’ (M4.1-M4.7) .48 Hình 4.13: PCR-trâu với bột thịt .48 Hình 4.14: Giới hạn nồng độ DNA bò có thể phát hiện được của PCR-bò 49 Hình 4.15: PCR-bò đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu .49 Hình 4.16: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .50 Hình 4.17: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80 o C/15’(M2.1-M2.7) và 120 o C/15’ (M3.1-M3.7) .51 Hình 4.18: PCR-bò phát hiện thịt bòtrong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 120 o C/30’(M4.1-M4.7) và 130 o C/15’ (M5.1-M5.7) .52 Hình 4.19: PCR-bò phát hiện thịt bò trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130 o C/30’(M6.1-M6.7) và 180 o C/15’ (M7.1-M7.7) .52 Hình 4.20: PCR-bò với bột thịt trên thị trường .53 DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Các phương pháp phân biệt loài của thịt 20 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu .37 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mô trong các loại thịt (tính theo khối lượng thịt xẻ) .3 Bảng 2.2: 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển 21 Bảng 2.3: 22 gen mã hóa tRNA .23 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất phản ứng PCR kiểm tra độ đặc hiệu primer .32 Bảng 3.2: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp 34 Bảng 3.3: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt .35 Bảng 4.1: Các primer thiết kế 38 Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra bằng FASTPCR .39 Bảng 4.3: Kết quả sắp gióng cột bằng Clustal W của các primer với trình tự cytochrome b các loài trâu, bò, heo, gà, dê, cừu .39 Bảng 4.4: Các tổ hợp primer .40 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, khi nhu cầu về lương thực thực phẩm tăng cao thì việc đảm bảo chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm là điều cần thiết. Trong đó, các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt đã và đang là mối quan tâm của xã hội. Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ một hay nhiều loại thịt khác nhau. Do sự đa dạng về hình thức, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt chế biến đã gây ra vấn đề gian lận thương mại. Trên thị trường có nhiều sản phẩm thịt ghi thành phần trên nhãn hiệu, công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản phẩm. Đặc biệt, sự gian lận này có thể ảnh hưởng đến việc kiêng sử dụng một hay một vài loài th ịt nào đó vì lý do sức khỏe (ví dụ bị dị ứng) hay vì lý do tôn giáo (ví dụ, đạo Hindu không ăn thịt bò). Thịt chế biến thường xử lý ở nhiệt độ cao trên 100 0 C (khoảng 120 0 C đối với thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…). Đặc biệt đối với bột xương thịt làm thức ăn cho gia súc tuy xử lý ở nhiệt độ khoảng 130 0 C nhưng được sản xuất từ những phụ phế phẩm trong công nghiệp giết mổ heo, trâu, bò, cừu, gà, dê,…nên một số mầm bệnh nguy hiểm vẫn tồn tại và có khả năng gây bệnh. Ví dụ bệnh BSE (Bovine spongiform encephalopathy) - bệnh bò điên - gây hại gia súc và có khả năng lây lan sang người. Vì lý do này, các nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam không cho nhập bột xuơng thịt có nguồn gốc từ thịt bò . của các vùng lãnh thổ có mầm bệnh BSE. Vì thế, việc phát triển và ứng dụng các phương pháp phát hiện chính xác và nhanh chóng các loại thịt trong những sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm khác nhau là nhu cầu cần thiết của thị trường và xã hội. Có nhiều phương pháp để xác định nguồn gốc thịt như phương pháp phát hiện dựa vào protein (ví dụ điện di, miễn dịch, sắc ký), phương pháp phát hiện dựa vào DNA (lai DNA, RAPD-PCR, PCR đặc tr ưng cho loài như standard-PCR, multiplex-PCR, Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP.) Các phương pháp phát hiện dựa vào protein hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý nhiệt. Do đó, các phương pháp dựa vào DNA