i TÓM TẮT Đề tài “Phân biệt các loại thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà bằng kỹ thuật multiplex - PCR” được tiến hành tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm TP. HCM từ ngày 15/10/2009 đến ngày 1/5/2010. Mục tiêu nghiên cứu là: xây dựng quy trình m-PCR phân biệt các loại thịt dê, cừu, heo, gà, bò lẫn trâu; ứng dụng quy trình m-PCR để phát hiện 6 loại thịt trên trong các hỗn hợp DNA, hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt, có xử lý nhiệt và mẫu bột thịt trên thị tr ường làm nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc. Kết quả đạt được như sau: Đã xây dựng quy trình m-PCR phát hiện thịt heo, gà, dê, cừu, bò lẫn trâu. Tỷ lệ thích hợp cho các primer FSIM:RG:RCh:RCB:RS:RP là 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol. Quy trình này có thể áp dụng cho thịt tươi, thịt xử lý nhiệt ở nhiệt độ 80 o C/15’; 120 o C/15’; 120 o C/30’; 130 o C/15’; 130 o C/30’, 180 o C/15’. Ảnh hưởng của tỷ lệ DNA hiện diện trong các hỗn hợp DNA và hỗn hợp thịt lên khả năng phát hiện của m-PCR cũng được xác định. Đối với hỗn hợp DNA 6 loài có tỷ lệ bằng nhau, nồng độ DNA thấp nhất mà m-PCR phát hiện gà là 0,0001 ng/μl, heo là 0,00025 ng/μl, cừu, dê, trâu/&bò là 0,0025 ng/μl. Còn đối với hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu, tỷ lệ th ấp nhất mà m-PCR có thể phát hiện trâu/&bò, dê là 0,1%, cừu là 1%. Tỷ lệ giống nhau giữa hỗn hợp DNA và hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt ảnh hưởng như nhau đến khả năng phát hiện của m-PCR. M-PCR không phát hiện được thịt trâu/&bò, dê, cừu với tỷ lệ ≤ 10% trong hỗn hợp thịt được xử lý ở 130 o C/30’. ii SUMMARY Research project “Differentiation of meat species of buffalo, cattle, goat, sheep, pig, and chicken by multiplex - PCR technique” was carried out at Institute of Biotechnology & Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from October 15, 2009 to May 1, 2010. The project was aimed: (i) to build the m-PCR reaction used for differentiation of commercially available meat including lamb, beef and/or buffalo meat, chicken, pork and goat meat; (ii) to apply this reaction in identification of meat species in raw and processed meat mixtures. The results were summarized as follows: The optimal m-PCR condition for detection of the meat species was confirmed, in which the proportion of primers for identification of pork, lamb, beef, chicken, goat meat, and buffalo was 12: 7: 7:10: 5: 25 pmol (FSIM: RG: RCH: RCB: RS: RP), respectively. This protocol could be applied to fresh meat and meat that had been processed at 80 o C/15; 120 o C/15'; 120 o C/30 '; 130 o C/15'; 130 o C/30', and 180 o C/15'. The effect of the amount of DNA template from different meat species in the reaction was also investigated. For DNA mixture involving the six meat species with equal ratio, the lowest concentration for detection of DNA was 0.0001 ng/μl in chicken, 0.00025 ng/μl in pork, 0.0025 ng/μl in lamb, goat, buffalo and/or cattle . In the mixture with reduced DNA concentrations from lamb, cattle and goat meat, the lowest rate of DNA that can be detected in was 0.1% in buffalo meat and/or beef, 0,1% in goat meat and 1% in lamb. iii MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG TÓM TẮT .i SUMMARY ii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC HÌNH .vi DANH SÁCH SƠ ĐỒ vi DANH SÁCH CÁC BẢNG . vii Chương 1 .1 MỞ ĐẦU .1 1.1. Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu 2 1.3 Mục đích 2 Chương 2 .3 TỔNG QUAN 3 2.1. Sơ lược về thịt và thịt chế biến .3 2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt 3 2.1.2 Giới thiệu sơ lược về thịt chế biến 4 2.1.3 Tình hình gian lận trên thị trường thịt của thế giới và Việt Nam .5 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến của thế giới 5 2.1.3.2 Tình hình gian lận trên thị trường thịt tươi và thịt chế biến ở Việt Nam 5 2.2. Các phương pháp phát hiện thịt 6 2.2.1 Phương pháp dựa vào protein .6 2.2.1.1 Phương pháp điện di .6 2.2.1.2 Phương pháp miễn dịch 8 2.2.1.3. Phương pháp sắc ký .9 2.2.2. Phương pháp dựa vào DNA .9 2.2.2.1 Phương pháp lai DNA 9 2.2.2.2 Phương pháp dựa vào PCR 11 2.3 DNA ty thể và gen cytochrome b trong việc phát hiện loài 21 2.3.1 DNA ty thể 21 2.3.2 Di truyền của ty thể .25 2.3.3 Sử dụng gen cytochrome b để phát hiện nguồn gốc loài trong các sản phẩm thịt chế biến 25 2.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu về phát hiện loài của thịt bằng phương pháp multiplex PCR .26 Chương 3 .29 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 29 3.2 Nội dung nghiên cứu .29 3.3 Vật liệu .29 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA 29 3.3.2 Primer 29 3.3.3 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ .30 iv 3.4 Phương pháp tiến hành 30 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 30 3.4.2 Tách chiết DNA 31 3.4.3 Xây dựng quy trình m-PCR phát hiện thịt có nguồn gốc từ heo, gà, dê, cừu, bò và/hoặc trâu .31 3.4.3.1 Phát hiện từng loại thịt bằng các phản ứng PCR đơn .31 3.4.3.2 Thiết lập và tối ưu hóa quy trình m-PCR .32 3.4.3.3 Thí nghiệm xác định khả năng phát hiện thịt trâu của m-PCRError! Bookmark not 3.4.4 Ứng dụng m-PCR để phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà 32 3.4.4.1 Xác định giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR 33 3.4.4.2 Thực hiện m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu .33 3.4.4.3 Thực hiện m-PCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .33 3.4.4.4 Thực hiện m-PCR để phát hiện thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 34 3.4.4.5 Thực hiện m-PCR với bột thịt trên thị trường 34 Chương 4 .37 KẾT QUẢ THẢO LUẬN .37 4.1 Xây dựng quy trình m-PCR .37 4.1.1 PCR phát hiện từng loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu .37 4.1.2 Quá trình thiết lập và tối ưu hóa m-PCR 38 4.1.3 Thí nghiệm xác định khả năng phát hiện thịt trâu của m-PCR .40 4.2 Ứng dụng m-PCR phát hiện thịt trâu, bò, dê, cừu, heo, gà .40 4.2.1. Xác định giới hạn nồng độ DNA mỗi loài có thể phát hiện được của m-PCR 40 4.2.2 M-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu 42 4.2.3 M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .43 4.2.4 M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 44 4.2.4.1 Kết quả phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý cùng nhiệt độ và thời gian .44 4.2.4.2 Kết quả so sánh m-PCR với thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt ở cùng nhóm tỷ lệ phối trộn 47 4.2.5 M-PCR với bột thịt trên thị trường .50 Chương 5 .51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .52 PHỤ LỤC 63 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSE : bovine spongiform encephalophathy FSIM : forward primer SIM (kí hiệu của forward primer chung của m-PCR) GC : gas chromatography HPLC : high performance liquid chromatography IEF : isoelectric focusing LC : liquid chromatography LTRs : long terminal repeats m-PCR : multiplex polymerase reaction chain MT-ATP6 : mitochondrially encoded ATP synthase 6 mtDNA : mitochondrial deoxyribonucleic acid MT-ND1 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 1 MT-ND4 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4 MT-ND4L : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 4L MT-ND5 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 5 MT-ND6 : mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 6 MT-RNR1 : mitochondrially encoded 12S RNA MT-TH : mitochondrially encoded tRNA histidine MT-TL1 : mitochondrially encoded tRNA leucine 1 (UUA/G) MT-TS1 : mitochondrially encoded tRNA serine 1 (UCN) MT-TV : mitochondrially encoded tRNA valine NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide PCR : polymerase chain reaction Prion : proteinaceous infectious particle RCB : reverse primer cattle &/ buffalo (theo Matsunaga & ctv, 1999) RCh : reverse primer chicken RG : reverse primer goat RP- HPLC : reverse phase high performance liquid chromatography RP : reverse primer pig RS : reverse primer sheep SSRs : simple sequence repeats vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Mô hình kiểm tra một mẫu bằng kỹ thuật lai DNA 10 Hình 2.2: Genome của ty thể .24 Hình 4.1: Sản phẩm PCR riêng lẻ của heo, cừu, bò, gà, dê 37 Hình 4.2: Sản phẩm PCR của thịt bò và trâu .38 Hình 4.3: Kết quả m-PCR theo PCR riêng lẻ 39 Hình 4.4: Kết quả tối ưu m-PCR .39 Hình 4.5: Kết quả thí nghiệm khẳng định m-PCR phát hiện thịt trâu .40 Hình 4.6: Giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR 41 Hình 4.7: Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của trâu, bò, dê, cừu .42 Hình 4.8: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt .43 Hình 4.9: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 80 o C/15’(M2.1-M2.7) và 120 o C/15’ (M3.1-M3.7) 46 Hình 4.10: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 120 o C/30’(M4.1-M4.7) và 130 o C/15’ (M5.1-M5.7) 46 Hình 4.11: M-PCR phát hiện thịt heo, gà, trâu/&bò, dê, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 130 o C/30’(M6.1-M6.7) và 180 o C/15’ (M7.1-M7.7) 46 Hình 4.12: Kết quả m-PCR với bột thịt trên thị trường 50 DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Các phương pháp phân biệt loài của thịt 20 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu .36 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mô trong các loại thịt (tính theo khối lượng thịt xẻ) .3 Bảng 2.2: 13 gen mã hóa protein trong chuỗi vận chuyển 21 Bảng 2.3: 22 gen mã hóa tRNA .23 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho từng phản ứng PCR thịt tươi 31 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt dự kiến của phản ứng PCR thịt tươi 32 Bảng 3.3: DNA template của thí nghiệm khẳng định m-PCR phát hiện thịt trâu. Error! Bookmark not defined. Bảng 3.4: Tỷ lệ DNA heo, gà, trâu, bò, dê, cừu trong các hỗn hợp 33 Bảng 3.5: Hỗn hợp thịt chế biến không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt .35 Bảng 4.1: Giới hạn nồng độ DNA có thể phát hiện được của m-PCR 41 Bảng 4.2: Tỷ lệ thấp nhất của trâu, bò, dê, cừu mà m-PCR phát hiện trong các hỗn hợp thịt xử lý ở cùng nhiệt độ và thời gian 44 Bảng 4.3: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 1 (30:30:10:10:10:10) .47 Bảng 4.4: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 2 (40:40:5:5:5:5) .47 Bảng 4.5: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 3 (48:48:1:1:1:1) .48 Bảng 4.6: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 4 (49:49:0,5:0,5:0,5:0,5) .48 Bảng 4.7: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 5 (49,8:49,8:0,1:0,1:0,1:0,1) .48 Bảng 4.8: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 6 (49,9:49,9:0,05:0,05:0,05:0,05) .49 Bảng 4.9: Kết quả so sánh m-PCR hỗn hợp thịt không xử lý nhiệt và thịt xử lý nhiệt của tỷ lệ phối trộn 7 (49,94:49,94:0,03:0,03:0,03:0,03) .49 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, khi nhu cầu về lương thực thực phẩm tăng cao thì việc đảm bảo chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm là điều cần thiết. Trong đó, các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt đã và đang là mối quan tâm của xã hội. Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ một hay nhiều loại thịt khác nhau. Do sự đa dạng về hình thức, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt chế biến đã gây ra vấn đề gian lận thương mại. Trên thị trường có nhiều sản phẩm thịt ghi thành phần trên nhãn hiệu, công thức lệch với thực tế để nâng cao giá trị cho sản phẩm. Đặc biệt, sự gian lận này có thể ảnh hưởng đến việc kiêng sử dụng một hay một vài loài th ịt nào đó vì lý do sức khỏe (ví dụ bị dị ứng) hay vì lý do tôn giáo (ví dụ, đạo Hindu không ăn thịt bò, đạo Hồi và đạo Do Thái không ăn thịt heo). Thịt chế biến thường xử lý ở nhiệt độ cao trên 100 0 C (khoảng 120 0 C đối với thịt hộp, xúc xích tiệt trùng…). Đặc biệt đối với bột xương thịt làm thức ăn cho gia súc tuy xử lý ở nhiệt độ khoảng 130 0 C nhưng được sản xuất từ những phụ phế phẩm trong công nghiệp giết mổ heo, trâu, bò, cừu, gà, dê,…nên một số mầm bệnh nguy hiểm vẫn tồn tại và có khả năng gây bệnh. Ví dụ bệnh BSE (Bovine spongiform encephalopathy) - bệnh bò điên - gây hại gia súc và có khả năng lây lan sang người. Vì lý do này, các nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam không cho nhập bột xuơng thịt có nguồn gốc từ thịt bò, cừu . củ a các vùng lãnh thổ có mầm bệnh BSE. Vì thế, việc phát triển và ứng dụng các phương pháp phát hiện chính xác và nhanh chóng các loại thịt trong những sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm khác nhau là nhu cầu cần thiết của thị trường và xã hội. Có nhiều phương pháp để xác định nguồn gốc thịt như phương pháp phát hiện dựa vào protein (ví dụ điện di, miễn dịch, sắc ký), phương pháp phát hiện dựa vào DNA (lai DNA, RAPD-PCR, PCR đặ c trưng 2 cho loài như standard-PCR, multiplex-PCR, Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP.) Các phương pháp phát hiện dựa vào protein hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý nhiệt. Do đó, các phương pháp dựa vào DNA thường được sử dụng hơn đặc biệt là các phương pháp PCR đặc trưng cho loài. Trong đó, các phương pháp Realtime PCR, PCR-RFLP, PCR sequencing, PCR-SSCP đòi hỏi máy móc, trang thiết bị, hóa chất phức tạp, giá thành cao. Còn phương pháp multiplex PCR dễ thực hiện nên được sử dụng rộng rãi trong việc phân biệt loài của thịt. Nếu có quy trình ly trích hợp lý, xác định gen mục tiêu thích hợp sẽ có thể phân biệt được các loại thịt đã xử lý nhiệt. 1.2 Mục tiêu - Xây dựng quy trình phát hiện các loại thịt heo, gà, trâu, bò, dê, cừu bằng phương pháp multiplex PCR 1.3 Mục đích - Góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại đối với sản phẩm thịt chế bi ến cho con người và bột thịt làm nguyên liệu trong chế biến thức ăn gia súc. - Ngăn ngừa sự lan truyền mầm bệnh BSE từ thức ăn gia súc sang các loài thú nhai lại và người 3 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1. Sơ lược về thịt và thịt chế biến 2.1.1 Giới thiệu sơ lược về thịt Thịt là một khái niệm dùng để chỉ một số mô có giá trị sử dụng làm thực phẩm có nguồn gốc từ động vật. Trong thương mại, thịt gồm có các mô: mô cơ, mô mỡ, mô liên kết, mô xương sụn và mô máu. Thành phần hóa học của thịt bao gồm nước, protein, lipid, glucid, các chất trích ly chứa nitơ và không chứa nitơ, khoáng, vitamin và enzym. Các thành phần này phụ thuộc vào loài thú, tuổi, giới tính, mục tiêu sử dụng, khẩu phần nuôi dưỡng, mức độ và giai đoạn vỗ béo, bộ phận súc thịt và cơ thể học (Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004). Bảng 2.1 Tỉ lệ phần trăm (%) của các mô trong các loại thịt (tính theo khối lượng thịt xẻ) Loại mô Thịt bò (%) Thịt heo (%) Thịt cừu (%) Mô cơ 57-62 40-62 49-58 Mô mơ 3-16 15-40 4-18 Mô liên kết 9-12 6-8 7-11 Mô xương sụn 17-29 8-18 18-38 Mô máu 0,8-1 0,6-0,8 0,8-1 (Theo Xmolxki, 1975) Tính chất của các mô và thành phần cấu tạo của nó đều khác nhau. Do đó, tùy theo đặc tính và tỉ lệ của các thành phần cấu tạo trong mỗi loại mô sẽ quyết định tính chất của thịt. Trong súc thịt, mô cơ là mô có giá trị dinh dưỡng cao nhất, thấp nhất là mô liên kết. Mô mỡ có giá trị năng lượng cao và còn làm cho thịt có vị béo. Giá trị thực phẩm của thịt đầu tiên được đánh giá qua tỉ lệ protein chứ a trong đó và giá trị sinh