THỰC HÀNH HÓA SINH Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5 - 2010 - 2 MỤC LỤC CHƯƠNG I: PROTEIN 3 BÀI 1: PHẢN ỨNG BIURE 3 BÀI 2: KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH 5 BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP SORENSEN 7 (PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐịNH ĐạM FORMOL) 7 BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNGPROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 8 (GIảNG TRÊN MÔ HÌNH) 8 CHƯƠNG II: ENZYME 10 BÀI 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME 10 BÀI 2: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HOẠT HÓA VÀ KÌM HÃM ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME 11 BÀI 3: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ  -AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH 12 CHƯƠNG III: GLUCIDE 14 BÀI 1: PHẢN ỨNG VỚI THUỐC THỬ FEHLING 14 BÀI 2: PHẢN ỨNG SELIWANOFF 16 BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ 18 CHƯƠNG IV: VITAMIN 20 BÀI 1: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN A 20 BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN C 21 BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C 22 BÀI 1: SỰ NHŨ TƯƠNG HÓA LIPIDE 24 BÀI 2: PHẢN ỨNG XÀ PHÒNG HÓA 25 BÀI 3: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ IOD CỦA CHẤT BÉO 26 BÀI 4: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ ACIDE CỦA CHẤT BÉO 28 BAI 5: XÁC ĐỊNH LIPIT TỔNG SỐ 29 (GIảNG TRÊN MÔ HÌNH) 29 Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5 - 2010 - 3 Chương I: PROTEIN Bài 1: PHẢN ỨNG BIURE I) Nguyên tắc:  Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-)  Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO 4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ.  Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide  Phản ứng này thường thường đượcứng dụng để định lượng protein II) Nguyên liệu và hóa chất:  Dung dịch lòng trắng trứng 1%  Ure tinh thể  Dung dịch NaOH 10%  Dung dịch CuSO 4 1% III) Cách tiến hành & kết quả: Điều chế biure: cho vào ống nghiệm khô một ít tinh thể urê, đung trên ngọn lửa yếu. Lúc đầu urê nóng chảy, đến khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun. Quá trình này tạo ra biure, acide cianuric và amoniac Dùng 2 ống nghiệm: Ống nghiệm Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dd NaOH 10% và 1-2 giọt CuSO 4 1% Ống 1 (Đựng biure) PTPỨ: (CO-NH-)+ Cu(OH) 2 Dung dịch tím đỏ Ống 2 (3ml dd lòng trắng trứng 1%) Dung dịch màu tím Chú ý không cho quá nhiều CuSO 4 vì màu xanh của Cu(OH) 2 được tạo thành  Giải thích:  Thuốc thử của phản ứng màu biure là dung dịch NaOH và CuSO 4 , đôi khi nó còn được gọi là tác chất biure Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5 - 2010 - 4  Tuy nhiên chữ biure ở đây không phải là thuốc thử có chứa biure mà là vì cả biure và protein đều cho phản ứng màu giống nhau với NaOH và CuSO 4 , Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide  Phản ứng so màu Biure, liên kết peptide với Cu 2+ trong MT kiềm, là phản ứng đặc trưng để nhận biết protein  Nguyên tắc các phản ứng màu khác của protein:  Phản ứng xantoproteic: đặc trưng với các axit amin vòng thơm. Các gốc amino acid Tyr,Trp,Phe trong protein tác dụng với HNO 3 đặc tạo thành màu vàng và sau khi thêm kiềm sẽ chuyển thành da cam  Phản ứng ninhydrin: đặc trưng với các - axit amin.  Phản ứng Pholia: đặc trưng với các axit amin chứa lưu huỳnh  Phản ứng Millon : phát hiện Tyrosin. gốc Tyr tác dụng với thủy ngân nitrate trong HNO 3 đặc tạo thành kết tủa màu nâu đất  Phản ứng Folin: phát hiện Tyrosin, Tryptophan.  Phản ứng Sakaguchi: phát hiện Arginin. Gốc Arg tác dụng với dung dịch kiềm của α-naphtol và hypobromite cho màu đỏ anh đào Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5 - 2010 - 5 Bài 2: KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH I) Nguyên tắc:  Các muối của kim loại kiềm và kiềm thổ (thường dùng là (NH 4 ) 2 SO 4 , Na 2 SO 4 , NaCl, MgSO 4 ) có tác dụng gây kết tủa thuận nghịch protein. Sau đó nếu loại bỏ nhanh các yếu tố gây kết tủa ,protein trở về trạng thái dung dịch keo bền.  Các protein khác nhau có thể bị kết tủa vơí các nồng độ muối khác nhau,vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. II) Nguyên liệu và hóa chất:  Dung dịch lòng trắng trứng không pha loãng.  Dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4 bảo hòa .  Tinh thể NaCl.  Nước cất. III) Cách tiến hành & kết quả: 1) Cho vào ống nghiệm 3ml lòng trắng trứng + 3ml dd (NH 4 ) 2 SO 4 bảo hoà, lắc đều đến khi dung dịch bán bảo hoà và xuất hiện kết tủa globulin. Để 5 phút, lọc bỏ kết tuả ( thấm ướt giấy lọc bằng dd (NH 4 ) 2 SO 4 ) vào một ống nghiệm khác . Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (NH 4 ) 2 SO 4 (nếu dịch lọc là 4ml) cho đến khi dung dịch bảo hoà, lắc, albumin kết tủa,lọc, thu kết tủa Cho riêng kết tủa globulin và albumin vào 2 ống nghiệm tương ứng, thêm vào 2 ống từ 2- 3ml nước cất, lắc đều.  Kết quả:  Ống 1: tức là ống chứa kết tủa globulin ,sau khi cho nước cất vào thì kết tủa tan từ từ trong nước cất .  Do Globunlin vẫn ở dạng kết tủa ,đó là do Globulin đã bị biến tính ,không quay về trạng thái dung dịch keo ngay được ( hiện tượng kết tủa không thuận nghịch ).  Ống 2 : tức là ống chứa kết tủa albumin,sau khi cho nước cất vào thì kết tủa tan ngay trong nước cất.  Do Albumin trở về trạng thái dung dịch keo như ban đầu, kết tủa tan hoàn toàn (hiện tượng kết tủa thuận nghịch). 2)Cho vào ống nghiệm 3ml lòng trắng trứng , cho tiếp NaCl vào ,dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho đến khi dung dịch bảo hoà. Để yên 5 phút thì thấy xuất hiện kết tủa a . Lọc kết tủa sau đó acid hoá phần dịch lọc đó bằng cách thêm vào 1 giọt CH 3 COOH 1% ,thì thấy xuất hiện kết tủa b.  Kết quả: Kết tủa a là Globulin. Kết tủa b là Albumin.  Giải thích : Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5 - 2010 - 29 Bài 5: XÁC ĐỊNH LIPIT TỔNG SỐ (Giảng trên mô hình) I) Nguyên tắc:  Dùng dung môi kị nước trích li hoàn toàn lipide từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích li theo, bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi… tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. do có lẫn tạp chất, phần trích li được gọi là lipide  Có 2 phương pháp để xác định :  Phương pháp xác định trực tiếp : chiết xuất lipide ra khỏi nguyên liệu và cân trực tiếp  Phương pháp xác định gián tiếp : chiết xuất lipide ra khỏi nguyên liệu và cân lại nguyên liệu II) Nguyên liệu và hóa chất:  Dung môi chiết xuất lipide thường dùng là ether etylic  Nguyên liệu được nghiền nhỏ ,sấy khô đến khối lượng không đổi. III) Thiết bị Soxhlet : Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5 - 2010 - 30 IV) Cách tiến hành & kết quả:  Chuẩn bị túi bằng giấy lọc để đựng nguyên liệu hoặc dùng ống hình trụ đựng mẫu có sẵn ( túi giấy lọc được cắt hình chữ nhật, chiều dài gấp 2,5 lần chiều rộng, gấp thành túi trụ có đường kính bé hơn trụ chiết). Túi được sấy khô đến khối lượng không đổi và được cân trên cân phân tích ( nếu xác định theo phương pháp gián tiếp )  Cân chính xác 2-5 g rồi cho mẫu vào túi giấy, gấp kín mép túi, đặt túi có mẫu phân tích vào trụ chiết  Phương pháp xác định trực tiếp  Trước khi chiết, bình cầu được sấy khô đến khố lượng không đổi  Đặt bình cầu lên nồi cách thủy và cho ete vào ½ thể tích bình  Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết  Lắp trụ chiết vào bình cầu  Cho dung môi vào trụ chiết đến ngập túi nguyên liệu. Mức dung môi đến phần trên ống xifon trụ chiết  Lắp ông sinh hàn, ngâm nguyên liệu trong dung môi một vài giờ  Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy sao cho số lần dung môi rút từ trụ chiết xuống bình cầu khoảng 10-15 lần trong 1 giờ  Thử lipide đã chiết hết chưa bằng cách lấy một vài giọt ete từ đầu cuối trụ chiết cho lên đĩa kính đồng hồ sạch, cho bay hơi hết ete, nếu không có lipide trên đĩa kính, xem như lipide đã được chiết hoàn toàn  Khi chiết xong, lấy bình cầu ra, lắp ống sinh hàn vào và cất lấy ete  Sấy bình cầu có chứa lipide ( 60-70 0 C trong 30 phút ) đến khối lượng không đổi rồi đem cân  Tính kết quả Hàm lượng lipide có trong 100g mẫu nguyên liệu: c ba X 100).(   X : hàm lượng lipide tính theo % a : khối lượng bình và lipide (g) b : khối lượng bình (g) c : khối lượng mẫu đã tách lipide (g)  Phương pháp xác định gián tiếp :  Sau khi kết thúc thí nghiệm như trên, lấy túi mẫu nguyên liệu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi  Tính kết quả Hàm lượng lipide có trong 100g mẫu nguyên liệu : c ba X 100).(   X : hàm lượng lipide tính theo % a : khối lượng túi mẫu nguyên liệu trước khi chiết (g) b : khối lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi đã chiết (g) c : khối lượng nguyên liệu lấy để xác định các chỉ số của chất béo . BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN C 21 BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C 22 BÀI 1: SỰ NHŨ TƯƠNG HÓA LIPIDE 24 BÀI 2: PHẢN ỨNG XÀ PHÒNG HÓA 25 BÀI. BÉO 26 BÀI 4: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ ACIDE CỦA CHẤT BÉO 28 BAI 5: XÁC ĐỊNH LIPIT TỔNG SỐ 29 (GIảNG TRÊN MÔ HÌNH) 29 Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_ tổ 5 - 20 10