Đang tải... (xem toàn văn)
Lựa chọn thuộc tính trong khai phá dữ liệu
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------------------------------------- HOÀNG PHÚ HIỆP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI TRONG VI KHUẨN Echerichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------------------------------------- HOÀNG PHÚ HIỆP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI TRONG VI KHUẨN Echerichia coli Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ THỊ THU HIỀN Thái Nguyên - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Bảng viết tắt . 1 Danh mục các hình . 2 Mở đầu 3 Chương 1: Tổng quan tài liệu . 5 1.1. Bệnh tim mạch . 5 1.2. Chất hoạt hóa plasminogen 5 1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô người . 9 1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu đông . 12 1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô người . 14 1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam . 18 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 19 2.1.1. Vật liệu . 19 2.1.2. Hóa chất 20 2.1.3. Thiết bị 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu . 20 2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose 20 2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide . 21 2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) 22 2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế 23 2.2.5. Ghép nối DNA 23 2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt 24 2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli . 24 2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid 25 2.2.8. Xác định trình tự gen 26 2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli . 27 Chương 3: Kết quả và thảo luận . 28 3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA . 28 3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR . 28 3.1.2. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) . 30 3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế 30 3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế . 31 3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) . 32 3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hóa h-tPA . 32 3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt 32 3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA . 33 3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hóa h-tPA . 37 3.2. Biểu hiện gen . 43 3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp . 43 3.2.2. Kiểm tra protein bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE . 43 Kết luận và đề nghị 47 Tài liệu tham khảo . 48 Phụ lục . 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG VIẾT TẮT Amp Ampicillin kb Kilo base Bp Cặp bazơ (Base pair) LB Luria – Bertani CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase P Vùng serine protease (Serine protease) ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate PA Chất hoạt hóa plasmingen (Plasminogen activator) DNA Deoxyribonucleic acid PAI Chất ức chế chất hoạt hóa plasminogen (Plasminogen activator inhibitor) dNTP Deoxynucleoside triphosphate PCR Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction) E. coli Escherichia coli rDNA DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) EDTA Ethylene Diamine Tetra- acetic Acid RNA Ribonucleic acid EGF Vùng nhân tố sinh trưởng biểu bì (Epidermal growth factor region) RNase Ribonuclease EtBr Ethidium bromide scuPA Chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type plasminogen activator) F Vùng “ngón tay” (Finger) SDS Sodium Dodecyl Sulphate GST Glutathione S-transferase SK Streptokiase h- tPA Chất hoạt hóa plasminogen mô người (Human tissue plasminogen activator) TAE Tris-acetate- EDTA IPTG Isopropyl b-D thiogalactoside tPA Chất hoạt hóa plasminogen mô (Tissue - type plasminogen activator) K1 Vùng Kringle 1 uPA Chất hoạt hóa urokinase (Urokinase - type plasminogen activator) K2 Vùng Kringle 2 v/p Vòng/ phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc của tPA và uPA 7 1.2 Các vùng của tPA 10 1.3 Cấu trúc h-tPA 11 1.4 Quá trình phân hủy huyết khối 13 1.5 Con đường phân giải tơ máu (Fibrin) 13 2.1 Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1 19 3.1 Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA 30 3.2 Kết quả xử lý cDNA mã hóa h-tPA và các vector biểu hiện bằng enzyme hạn chế 32 3.3 Chọn dòng pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA) 34 3.4 Chọn dòng pET21a(+) mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA) 35 3.5 Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế 36 3.6 Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR 37 3.7 So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA và pET21a(+)/h-tPA với NM_000930 42 3.8 Kiểm tra kiểm tra protein h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA p3 44 3.9 Kiểm tra protein h-tPA trong pET21a(+)/h-tPA p1 45 Formatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Space Before: 0 pt, After: 0 ptFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: BoldFormatted: Font: Bold Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người. Giáo sư Paul Berg thuộc trường đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980, là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA- rDNA) vào năm 1972. Kể từ đó đến nay, công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học và các dược phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dược phẩm sinh học) nhằm phục vụ và bảo vệ sức khỏe con người [44]. Trong lĩnh vực nghiên cứu tạo các loại dược phẩm làm tan các cục máu đông để điều trị huyết khối và các rối loạn huyết khối tắc mạch, cuối những năm 1980, thông qua công nghệ rDNA, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tạo ra một số loại dược phẩm sinh học là các protein tái tổ hợp có khả năng làm tan các cục máu đông “đặc hiệu”. Một trong những protein đó, chất hoạt hóa plasminogen mô của người (human tissue plasminogen activator- h-tPA) đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y dược. DNA bổ sung (complementary DNA- cDNA) của gen mã hóa h-tPA đã được phân lập, tạo dòng, biểu hiện ở nhiều loại tế bào như tế bào trứng chuột đồng (Chinese hamster ovary- CHO), tế bào thận chuột chưa trưởng thành . và sản xuất dưới dạng dược phẩm tái tổ hợp [39]. Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang bắt đầu được tiếp cận. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô trong vi khuẩn Escherichia coli tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của ngƣời trong vi khuẩn Escherichia coli”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2. Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ rDNA để thiết kế vector và biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli nhằm tiến tới sản xuất protein h-tPA tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo dòng gen mã hóa h-tPA trong các vector biểu hiện thích hợp. - Biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli. 4. Những điểm mới của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu nhằm tiến tới ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô của người - một dược phẩm công nghệ sinh học có giá trị hoàn toàn chưa được nghiên cứu và sản xuất ở nước ta. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh tim mạch Bệnh tim mạch là các bệnh liên quan đến những rối loạn ảnh hưởng tới tim và các mạch máu bao gồm bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh mạch máu ngoại biên và tăng huyết áp. Bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới. Mỗi năm, bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong cho 17,5 triệu người và dự đoán sẽ có khoảng 25 triệu người bị bệnh tim mạch tử vong vào năm 2020. Bệnh tim mạch cũng được dự đoán sẽ là nguyên nhân lớn nhất gây tàn phế cho người vào năm 2020. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi 2 giây có 1 người chết vì bệnh tim mạch. Cứ mỗi 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và mỗi 6 giây thì có một trường hợp đột quỵ. Hiện có đến 300 yếu tố nguy cơ kết hợp với bệnh mạch vành và đột quỵ sẽ dẫn đến bệnh tim mạch [60]. Một trong những nguyên nhân sinh lý quan trọng dẫn tới các bệnh tim mạch là do thành mạch bị tổn thương, dẫn tới hình thành huyết khối bên trong mạch máu. Do vậy, điều trị huyết khối là một trong những phương pháp hiệu quả giúp làm giảm nguy cơ tử vong và các biến chứng ở các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch, đặc biệt là ở các bệnh nhân đột quỵ và nghẽn mạch máu. Trong phác đồ điều trị huyết khối và bệnh tim mạch, chất hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator, PA) đóng vai trò quan trọng và được xem là thuốc điều trị có hiệu quả cao. Chất hoạt hóa plasmminogen có vai trò biến đổi plasminogen thành plasmin- là chất phân hủy huyết khối (thrombolytic). Plasmin sau đó sẽ hòa tan dần fibrin và fibrinogen từ đó làm tan huyết khối. Bằng công nghệ gen, các PA đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất nhằm tạo ra thuốc đặc hiệu trong điều trị huyết khối và bệnh tim mạch. Tuy nhiên, do quy trình sản xuất phức tạp nên giá thành của sản phẩm này khá cao. 1.2. Chất hoạt hóa plasminogen Chất hoạt hóa plasminogen có tác dụng quan trọng trong quá trình làm tan khối máu đông. Chất hoạt hóa plasminogen là nhóm enzyme duy nhất chuyển chất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 http://www.lrc-tnu.edu.vn xúc tác plasminogen từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động - plasmin. Vì đặc tính này, một vài loại plasminogen khác nhau đã được sử dụng nhằm điều trị các chứng bệnh tim mạch. Chất hoạt hóa plasminogen gồm bốn nhóm chính. Một nhóm là chất hoạt hóa plasminogen urokinase (urokinase- type plasminogen activator, uPA). Chất này có liên quan đến kháng thể urokinase và không kết hợp với tơ máu. Bởi vậy chất hoạt hóa này được cho rằng có thể có liên quan đến hoạt hóa plasminogen trong pha lỏng của huyết thanh. Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue-type plasminogen activator, tPA), có khả năng tương tác với kháng thể chất hoạt hóa mô và kết hợp với tơ máu. Loại thứ ba là streptokinase (SK). SK hoạt hóa plasminogen bằng cơ chế trực tiếp. Cuối cùng là enzyme phân hủy tơ máu (fibrinolysis) được giải phóng nhanh khi huyết tương bị tổn thương và giải phóng một số chất hoạt hóa vào thành mạch [18], [47]. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase là sản phẩm chính của thận, tồn tại dưới dạng phân tử chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type plasminogen activator - scuPA) không hoạt động. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase được phân lập có hai dạng: dạng có trọng lượng phân tử cao (khối lượng 54,7kDa) và dạng có trọng lượng phân tử thấp (khối lượng 31,5kDa) [18]. Chúng có hai chức năng: chức năng chính là tham gia trong phân giải protein mô liên kết và chức năng thứ hai được biết đến với vai trò điều khiển của tPA như chất hoạt động sinh lý trong máu [30]. Sự hoạt hóa của scuPA do sự phân hủy xung quanh bởi plasmin trong cấu trúc hai sợi dẫn tới việc tăng hoạt tính của plasminogen lên. Thông qua quá trình này, một số lượng nhỏ của plasmin có thể xúc tác sản phẩm uPA hoạt động, ảnh hưởng tới hình dạng của nhiều plasmin. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase có thể chỉ hoạt hóa plasminogen với sự có mặt của fibrin. Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy fibrin. Trong huyết tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7ng/ml. Giá trị cao nhất thường được tìm thấy trong bệnh nhân gan mãn tính và ung thư gan [9]. [...]... chất hoạt hóa plasminogen tái tổ hợp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 2: 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1 Vật liệu Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vật liệu ban đầu là cDNA mã hóa h-tPA đã được chọn dòng trong vector pUC18 (pUC18/ h-tPA) trong nghiên cứu trước đây [10] Vector biểu hiện gồm hai loại:... tạo nên các đặc tính sinh học đặc hiệu của cả phân tử Vùng F đóng vai trò chủ yếu tạo nên tính ái lực cao với tơ máu Hoạt tính này thể hiện tính đặc hiệu cao của h-tPA trong quá trình phân giải các khối máu đông giàu tơ máu Vùng EGF thể hiện hoạt tính gắn h-tPA với bề mặt tế bào, chức năng này được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn bảo thủ trong rất nhiều... bằng phương pháp tủa cồn/EDTA: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 http://www.lrc-tnu.edu.vn - Bổ sung 4l EDTA 125mM có pH 8,0 và 60l cồn 100% Đảo nhẹ hỗn hợp và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4 oC Loại bỏ cồn - Rửa tủa bằng 60l cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút và làm khô - Bổ sung 10l Hi–DiTM Formamide và biến tính ở 95oC trong 5 phút... tạo nên cầu disulfide trong domain Vùng kringle trong protease serine rất quan trọng trong mối tương tác protein-protein trong quá trình hoạt hóa plasminogen và phân giải tơ máu, hoặc quá trình chuyển đổi prothrombin-thrombin Vùng kringle 2 của h-tPA cũng liên quan chặt chẽ với quá trình gắn tơ máu và có khả năng kích thích hoạt tính h-tPA đối với fibrin nên có vai trò quan trọng trong sự kết hợp giữa... 100 µl loading dye Voltex phá tế bào, biến tính protein trong 5 phút ở 95oC; - Dùng 10l mẫu để điện di SDS-PAGE cùng với thang chuẩn protein và mẫu đối chứng âm là dịch phá màng của E.coli BL21 và dịch phá màng E.coli BL21chứa vector rỗng được cảm ứng IPTG; - Phần dịch nuôi cấy còn lại được ly tâm thu tế bào Giữ tế bào ở -20oC chờ bước tinh chế protein Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên... [55] Vùng kringle 1 không được xem như có liên quan đến trong đặc tính kết hợp với tơ máu của h-tPA mặc dù trình tự amino acid của kringle 1 và kringle 2 có tính tương đồng cao [52] Vùng P đảm nhiệm chức năng phân cắt plasminogen bằng enzyme để tạo ra plasmin [37] Hình 1.3 Cấu trúc h-tPA [38] Protein h-tPA được tổng hợp và tồn tại trong tế bào màng trong mạch dưới dạng chuỗi polypeptide sợi đơn, tuy nhiên... của các tiểu phần protein trong trường điện Ở một số điều kiện nhất định, protein ở dạng ion và có mức độ ion hóa khác nhau, nên có thể tách riêng biệt chúng theo khả năng di động trong trường điện từ về hai cực âm (-) và dương (+) Kết quả nhận được phổ các vạch protein khác nhau Phương pháp điện di là một phương pháp nghiên cứu sinh hóa thông dụng và rất tiện lợi Phương pháp điện di protein thường... 200vòng/phút (v/p) ở 37oC trong môi trường LB lỏng từ 1- 2h; Ngày tiếp theo cấy trải dịch nuôi ra đĩa chứa môi trường LB đặc Nuôi qua đêm ở 37oC; - Chọn 1 khuẩn lạc từ đĩa, cấy chuyển vào 1,5 ml môi trường LB lỏng, nuôi qua đêm ở 37oC; - Cấy chuyển 200l dịch nuôi sang 30 ml LB lỏng Nuôi lắc trong 3h ở 37oC; - Chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm Giữ lạnh trên đá trong 10 phút; - Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút, ở... sung 5l của sản phẩm ghép nối vào ống tế bào khả biến (khoảng 100l) Giữ trong đá khoảng 15 phút; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 http://www.lrc-tnu.edu.vn - Sốc nhiệt ở 42oC trong 70 giây, sau đó chuyển ngay sang bình đá và giữ trong đá 5 phút; - Bổ sung 300l môi trường LB lỏng; - Nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1giờ; - Cấy trải hết dịch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc có bổ... và ủ trong đá từ 3 – 5 phút; - Thêm 500 l dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ thể tích 24:1) Đảo đều hỗn hợp; - Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4 oC Chiết và chuyển pha lỏng ở phía trên sang một ống eppendorf mới; Thêm 50 l CH3COONa 3 M (pH 5,2) và 1 ml cồn 100 % Đảo đều và giữ lạnh ở -200C trong 3 giờ; - Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC để thu tủa DNA; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu . nên các đặc tính sinh học đặc hiệu của cả phân tử. Vùng F đóng vai trò chủ yếu tạo nên tính ái lực cao với tơ máu. Hoạt tính này thể hiện tính đặc hiệu. tạo nên cầu disulfide trong domain. Vùng kringle trong protease serine rất quan trọng trong mối tương tác protein-protein trong quá trình hoạt
![Hình 1.1. Cấu trúc của tPA và uPA [9] - Lựa chọn thuộc tính trong khai phá dữ liệu](https://media.store123doc.com/figures/001/169/hinh-cau-truc-tpa-upa-1169777.png)
![Hình 1.3. Cấu trúc h-tPA [38] - Lựa chọn thuộc tính trong khai phá dữ liệu](https://media.store123doc.com/figures/001/169/hinh-cau-truc-h-tpa-1169779.png)
![Hình1.5. Con đƣờng phân giải tơ máu (Fibrin) [58] - Lựa chọn thuộc tính trong khai phá dữ liệu](https://media.store123doc.com/figures/001/169/hinh-dong-phan-giai-to-mau-fibrin-1169780.png)
![Hình 1.4. Quá trình phân hủy huyết khối [9] - Lựa chọn thuộc tính trong khai phá dữ liệu](https://media.store123doc.com/figures/001/169/hinh-trinh-phan-huy-huyet-khoi-1169781.png)
