Đang tải... (xem toàn văn)
Nuôi cấy bacillus Subtilis thu nhận Amylase và ứng dụng trong sản xuất
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NI CẤY BACILLUS SUBTILIS THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS THU NHẬN α-AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN Giáo viên hƣớng dẫn: Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng Nguyễn Nhƣ Nhứt Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thanh Thủy iii LỜI CẢM ƠN Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời trăn trở, lo lắng động viên để tơi có đƣợc ngày hơm Xin tỏ lịng biết ơn đến tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trƣờng Xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng anh Nguyễn Nhƣ Nhứt tận tình hƣớng dẫn, động viên tơi thời gian thực khóa luận Cảm ơn anh bạn phịng sinh hóa ứng dụng trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ thời gian thực tập tốt nghiệp Cảm ơn Hồng Vy Phƣơng Uyên, hai ngƣời bạn thân chia xẻ giúp đỡ năm học trƣờng iv TĨM TẮT Nguyễn Thanh Thủy, Đại học Nơng Lâm TP HCM Đề tài nghiên cứu “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α-amylase ứng dụng sản xuất dextrin”, thực phịng sinh hóa ứng dụng trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM từ 19/03/2007 – 19/07/2007 GVHD: ThS Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng ThS Nguyễn Nhƣ Nhứt Đối tƣợng nghiên cứu α-amylase Bacillus subtilis Chúng sử dụng phƣơng pháp Lowry định lƣợng protein hoà tan nƣớc, phƣơng pháp Heinkel xác định hoạt độ α-amylase để khảo sát thời gian nuôi cấy, tỷ lệ tủa α-amylase cồn 96% (NH4)2SO4, khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến khả thủy phân tinh bột tạo dextrin chế phẩm α-amylase Kết thu đƣợc nhƣ sau: - Thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis thích hợp để thu α-amylase 48 - Tỷ lệ tủa α-amylase cồn 96% tốt thể tích dịch chiết enzyme thể tích cồn Thời gian tủa 15 phút - pH nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng thủy phân chế phẩm α-amylase 6,0 55oC - Lƣợng dextrin thu đƣợc nhiều từ thủy phân bột 10% v ABSTRACT NGUYEN THANH THUY, Nong Lam University of HCM city Graduating thesis topic: “α-amylase production by Bacillus subtilis solid state fermentation and dextrin production application” This thesis was carried out at biochemistry and application room of Natural Science University HCMC from 03/2007 to 09/2007 We used α-amylase activity measurement method (Heinkel) and protein concentration determination method (Lowry) to investigate fermentation time, αamylase precipitation by 96% ethanol and solid ammonium sulfate After recovering α-amylase from fermented medium we examined starch hydrolysis ability and dextrin production of α-amylase product Result experiments showed that: - α-amylase activity was hightest at 48h incubation - Precipiating α-amylase by 96% ethanol was better than solid ammonium sulfate and suitable volume ratio of extracted enzyme and ethanol for precipitation was 1:3 - Optimum temperature and pH for hydrolysis of purified α-amylase were respective 55 degree C and 6,0 - α-amylase had the most effective hydrolysis in 10% cassava starch fluid vi MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Abstract v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xi Danh sách sơ đồ xii Danh sách đồ thị xii Danh sách biểu đồ .xii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH 1.3 YÊU CẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 BACILLUS SUBTILI 2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Bộ gen 2.1.4 Ứng dụng 2.2 ALPHA-AMYLASE 2.2.1 Khái niệm 2.2.2 Phân loại, danh pháp 2.2.3 Cấu trúc phân tử 2.2.4 Tính chất 2.2.5 Cơ chế xúc tác 10 2.2.6 Ứng dụng 11 2.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT 12 vii 2.3.1 Nuôi cấy bề mặt 12 2.3.2 Ni cấy chìm 12 2.4 TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME 13 2.5 DEXTRIN 13 2.5.1 Phân loại 14 2.5.2 Tính chất 14 2.5.2.1 Độ nhớt 15 2.5.2.2 Độ pH 16 2.5.2.3 Tuổi dung dịch dextrin 16 2.5.2.4 Độ hòa tan 16 2.5.2.5 Màu sắc 16 2.5.3 Quy trình sản xuất dextrin 17 2.5.4 Ứng dụng 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 19 3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 19 3.3 PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 20 3.3.1 Xác định mật độ tế bào 20 3.3.2 Khảo sát thời gian ni cấy thích hợp 20 3.3.3 Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme cồn 96% 20 3.3.4 Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme (NH4)2SO4 21 3.3.5 Khảo sát thời gian tủa enzyme cồn 96% 21 3.3.6 Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến khả thủy phân α-amylase 22 3.3.6.1 Nhiệt độ 22 3.3.6.2 pH 22 3.3.7 Khảo sát tỷ lệ cồn thích hợp thu dextrin 22 3.3.8 Khảo sát khả thủy phân chế phẩm α-amylase với nguồn tinh bột 22 3.3.8.1 Khảo sát khả thủy phân với nguồn tinh bột 22 3.3.8.2 Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp 23 3.4 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 23 viii Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY 24 4.2 KẾT QUẢ TINH SẠCH α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ (NH4)2SO4 25 4.2.1 Kết tỷ lệ tủa enzyme cồn 96% 24 4.2.2 Kết tỷ lệ tủa enzyme (NH4)2SO4 27 4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA ENZYME BẰNG CỒN 96% 28 4.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE 29 4.4.1 Nhiệt độ 29 4.4.2 pH 30 4.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN THÍCH HỢP THU DEXTRIN 31 4.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA CHẾ PHẨM α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT 32 4.7 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE 32 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT B subtilis Bacillus subtilis GH Glycosidic Hydrolase EC Enzyme Commission DAP Diamoni Phosphate MW Molecular Weight Da Dalton DE Dextrose equivalent CT Canh trƣờng dOD Delta optical density DCE Dịch chiết enzyme CPE Chế phẩm enzyme (đã sấy khô) CP tƣơi Chế phẩm enzyme tƣơi UI Unit International x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Hình thái Bacillus subtilis Hình 2.2 Bacillus subtilis giai đoạn tạo bào tử Hình 2.3 Khuẩn lạc B subtilis thạch đĩa Hình 2.4 Cấu trúc không gian α-amylase Hình 2.4 Vị trí cắt α-amylase phân tử tinh bột 11 Hình 2.5 Dextrin 14 Hình 4.1 Mơi trƣờng bán rắn trƣớc ni cấy 25 Hình 4.2 Canh trƣờng nuôi cấy sau 48 25 Hình 4.3 Ảnh hƣởng pH lên hoạt độ α-amylase 30 Hình 4.4 Chế phẩm α-amylase 36 Hình 4.5 Chế phẩm dextrin 36 40 19 Hopek M., Ziobro R, Achremowicz B., 2006 Comparison of the effects of microbial a-amylase and scalded flour on bread quality Acta Sci Pol, Technol Aliment 5(1), 97 – 106 20 O S AZEEZ, 2005 Production of Dextrins from Cassava Starch Chemical Engineering Department, Federal University of Technology, Minna, Nigeria, Lenardo Journal of Sciences ISSN 1583 – 0233 21 Dextrin The Colombia Encylopedia, Sixthedition Copyright 2001 - 05 Colombia University Press 22 Bacillus subtilis 41 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MỘT SỐ LOẠI MƠI TRƢỜNG 1.1 Mơi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar Giá đậu 100g D-glucose 50g Pepton 10g Agar 20g Nƣớc cất đủ 1000 ml pH = Đun sôi 100g giá với 1000 ml nƣớc cất 30 phút, để nguội Lọc nƣớc giá vải lọc định mức lại cho đủ 1000 ml Cho glucose, pepton, agar vào đun sôi, khuấy Phân vào ống nghiệm, ống khoảng 10 ml môi trƣờng, hấp khử trùng 1atm 30 phút Các ống nghiệm sau hấp đƣợc để nghiêng 1.2 Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton Giá đậu 100g D-glucose 50g Pepton 10g Nƣớc cất đủ 1000 ml pH = Cho Glucose, pepton vào nƣớc chiết giá, khuấy cho vào erlen Hấp khử trùng 1atm 30 phút 42 1.3 Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn Bã đậu nành 50g Cám bắp 50g NaCl 0.36g CaCl2 0.6g DAP 0.2g MgSO4 0.5g Nƣớc cất đủ 135 ml pH = CÁC PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.1 Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Khác với phƣơng pháp đếm trực tiếp dƣới kính hiển vi, phƣơng pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật sống diện mẫu Ƣu điểm phƣơng pháp độ nhạy cao, cho phép định lƣợng vi sinh vật mật độ thấp mẫu Cách thực - Pha loãng mẫu theo dãy thập phân: Mẫu đƣợc pha loãng thành dãy nồng độ thập phân: hút ml mẫu (hoặc dung dịch có độ pha lỗng trƣớc đó) vào ống nghiệm chứa ml nƣớc cất khử trùng, lắc - Sau pha loãng thành nồng độ 10-3,10-4, 10-5, 10-6,… hút ml dịch pha loãng nồng độ cho vào đĩa petri Đổ khoảng 15 – 20 ml môi trƣờng khử trùng để nguội đến 45 - 50oC vào đĩa petri có mẫu - Xoay nhẹ đĩa petri chiều ngƣợc chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống đƣợc trộn môi trƣờng cấy - Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên, lật ngƣợc đĩa - Sau 24 tiến hành đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc đĩa 43 Tính kết Mật độ tế bào vi khuẩn mẫu ban đầu tính từ số liệu độ pha lỗng Di đƣợc tính theo cơng thức: Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong đó: Ai số khuẩn lạc trung bình /đĩa Di độ pha lỗng V dung tích huyền phù tế bào cho vào đĩa (ml) Mật độ tế bào trung bình MI mẫu ban đầu trung bình cộng Mi nồng độ pha loãng khác 2.2 Phƣơng pháp đo độ đục Nguyên tắc Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử khơng tan hình thành hệ huyền phù có độ đục phần tử diện môi trƣờng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Tế bào vi sinh vật thực thể nên diện môi trƣờng làm môi trƣờng trở nên đục Độ đục huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Tiến hành - Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính độ đục mật độ tế bào: Các huyền phù vi sinh vật cần kiểm nghiệm đƣợc pha loãng đo OD 610nm đạt giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 0,5 Dùng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào (N/ml) huyền phù Tính giá trị log(N/ml) cho giá trị mật độ N/ml tƣơng ứng với độ đục Vẽ đƣờng biểu diễn log(N/ml) (trục tung) theo OD610nm (trục hoành) Xác định khoảng tuyến tính log(N/ml) OD610nm - Xác định mật độ tế bào theo độ đục: Đo độ đục huyền phù tế bào cần xác định mật độ Từ trị số OD610nm đo đƣợc, dựa vào đƣờng tƣơng quan log(N/ml) độ đục OD610nm suy trị số log(N/ml) trị số mật độ N/ml (N/ml = 10a với a = log(N/ml) 44 2.3 Phƣơng pháp tinh enzyme cồn Nguyên tắc Độ hòa tan protein dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, số số điện mơi dung dịch Nhìn chung, phân tử có số điện mơi lớn (nhƣ nƣớc, dimethylsulphoxid) ổn định tƣơng tác chúng với phân tử protein tạo điều kiện thuận lợi cho hòa tan protein dung dịch Ngƣợc lại, dung môi với số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản phân tán phân tử protein mơi trƣờng Do đó, độ hịa tan phân tử protein giảm xảy kết tủa làm giảm số điện môi hữu môi trƣờng Cách tiến hành Sau cho cồn vào, enzyme bị kết tủa Ly tâm loại cồn, thu tủa enzyme Tủa enzyme đƣợc hòa tan dung dịch đệm acetate (pH=5) đo hoạt tính enzyme phƣơng pháp Heinkel kết hợp với định lƣợng protein phƣơng pháp Lowry 2.4 Phƣơng pháp tủa enzyme (NH4)2SO4 Nguyên tắc Ở nồng độ muối cao khả hịa tan enzyme giảm mạnh có xu hƣớng kết lắng nồng độ muối cao làm giảm số điện môi dung dịch, làm protein bị nƣớc Cách tiến hành Cân xác lƣợng muối (NH4)2SO4 ứng với nồng độ bão hòa 10 ml dịch chiết enzyme (xem bảng 2.1) Bảng 2.1 Khối lƣợng tƣơng ứng độ bão hoà Độ bão hoà (%) (NH4)2SO4 (gram) 50 55 60 65 70 3,1 3,51 3,9 4,3 4,72 45 Cho 10 ml dịch chiết enzyme vào erlen đƣa vào máy khuấy từ, cho từ từ muối vào Sau 30 phút lấy ly tâm 2.5 Phƣơng pháp Heinkel Thực Cho vào ống nghiệm ml dung dịch tinh bột 1%, ml dung dịch NaCl 0,1%, ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0 Lắc đều, để ống nghiệm tủ ấm 30oC, 15 - 20 phút để dung dịch đạt đến 30oC Thêm ml dung dịch enzyme pha loãng đạt đến 30oC vào ống nghiệm Lắc tiếp tục giữ 30oC 30 phút Lấy ống nghiệm khỏi tủ ấm cho vào ml dung dịch HCl 1N để dừng phản ứng Song song với mẫu thí nghiệm, làm mẫu kiểm tra đối chứng tƣơng tự nhƣ nhƣng cho dung dịch HCl vào trƣớc cho enzyme vào Lấy ml mẫu thí nghiệm đối chứng cho vào ống nghiệm mới, thêm vào ml dung dịch Iod pha loãng 450 lần Lắc đều, so màu bƣớc sóng 560 nm Lấy hiệu số đọc đƣợc máy mẫu đối chứng thí nghiệm đối chiếu với đƣờng cong tiêu chuẩn, tính số mg tinh bột bị thủy phân Cách tính Đơn vị hoạt động enzyme lƣợng enzyme có khả phân giải mg tinh bột thành sản phẩm không tạo màu với Iod sau 30 phút điều nhiệt độ thí nghiệm Hoạt độ A = Số mg tinh bột bị phân giải * Độ pha loãng (UI) 2.6 Phƣơng pháp Lowry định lƣợng protein hòa tan nƣớc Nguyên tắc Hầu hết protein chứa Tyrosin Tryptophan Hàm lƣợng amino acid tùy thuộc vào loại protein Vì vậy, protein loại với có hàm lƣợng amino acid giống Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin tạo thành phức chất có màu Cƣờng độ màu phức tỷ lệ với hàm lƣợng Tyrosin Tryptophan 46 (cũng lƣợng protein) Vì ta dùng phƣơng pháp so màu để xác định hàm lƣợng protein Hóa chất Dung dịch albumin 0,1%: cân xác 0,1 g albumin pha với nƣớc cất thành 100 ml Dung dịch A: cân g Na2CO3 hòa NaOH 0,1N thành 100 ml Dung dịch B: 0,5 g CuSO4.5H2O hòa natri citrate 1% thành 100 ml Dung dịch C: hỗn hợp A B theo tỉ lệ 49:1 dung dịch C pha trƣớc dùng 30 phút Thuốc thử Folin: pha loãng lần từ Folin đậm đặc Cách tiến hành + Lập đồ thị chuẩn: Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn có nồng độ: 0, 50, 100, 150, 200, 250 μg/ml từ dung dịch albumin chuẩn 0,1% pha loãng với nƣớc cất theo tỷ lệ khác (xem bảng 2.1) Bảng 2.2 Cách pha nồng độ albumin Số ống nghiệm Albumin 1% (ml) 0,5 1,5 2,5 Nƣớc cất (ml) 10 9,5 8,5 7,5 Protein (µg/ml) 50 100 150 200 250 Hút 0,4 ml dung dịch albumin pha loãng theo bảng từ ống – cho vào ống nghiệm theo thứ tự Thêm vào ml dung dịch C, lắc đều, để yên nhiệt độ phòng phút Thêm 0,2 ml Folin, lắc đều, để yên 5-10 phút, thêm nƣớc cất đủ ml So màu bƣớc sóng 750 nm Xác định trị số mật độ quang ống, từ xây dựng đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml) 47 + Xác định hàm lƣợng protein mẫu: Hút vào ống nghiệm 0,4 ml dung dịch mẫu thí nghiệm Thêm vào ml dung dịch C, lắc đều, để yên phút Thêm 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên – 10 phút, thêm nƣớc cất cho đủ ml Đem đo mật độ quang bƣớc sóng 750 nm Cách tính Từ đƣờng chuẩn so sánh mật độ quang ống nghiệm chứa mẫu protein, từ suy hàm lƣợng protein nguyên liệu a (μg/ml) Lƣợng protein (M) có g ngun liệu đƣợc tính theo cơng thức: -3 M= a x 10 x n mg protein/g m Với a: hàm lƣợng protein (μg/ml dung dịch) n: hệ số pha loãng mẫu m: khối lƣợng nguyên liệu lấy phân tích (g) 2.7 Phƣơng pháp thu nhận dextrin Các bƣớc tiến hành: - Dịch hóa: thời gian hồ hóa tinh bột, ta để dung dịch enzyme nhiệt độ thích hợp để enzyme đƣợc hoạt hóa Tinh bột đƣợc hồ hóa làm nguội khoảng 50oC, sau bổ sung enzyme vào dung dịch hồ tinh bột Từ lúc cho enzyme vào, khuấy liên tục, khuấy kỹ để tạo tiếp xúc enzyme chất đồng Thời gian từ lúc hồ hóa tinh bột đến lúc làm nguội cho enzyme vào khoảng phút - Khi hồ tinh bột bắt đầu lỏng ra, tính thời gian - Bất hoạt enzyme: sau thời gian khảo sát ta bất hoạt enzyme nhằm đảm bảo xác thông số đo thời điểm khảo sát cách làm lạnh thêm ml dung dịch HCl 5% - Sau ly tâm loại bỏ tinh bột thừa, tủa cồn thu dextrin, đem sấy khô 70 80oC 48 2.8 Đồ thị chuẩn xác định mật độ tế bào Bảng 2.3 Giá trị OD610nm tƣơng ứng mật độ tế bào OD610nm 0,12 0,221 15,333x106 34x106 7,186 0,306 7,531 0,41 0,53 Mật độ trung bình (N/ml) Log (N/ml) 7,719 8,001 8,149 y = 2,3588x + 6,9686 R2 = 0,9725 8,4 Log (N/ml) 52,333x106 100,333x106 141x106 8,0 7,6 7,2 6,8 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 OD610nm Đồ thị 2.1 Sự tƣơng quan giá trị OD61onm mật độ tế bào 2.9 Đồ thị chuẩn xác định lƣợng tinh bột bị thủy phân theo phƣơng pháp Heinkel Bảng 2.4 Giá trị OD650nm tƣơng ứng hàm lƣợng tinh bột Tinh bột (mg/ml) 10 OD trung bình 0,016667 0,139 0,2497 0,3673 0,467 0,56167 dOD560nm 0,1223 0,233 0,3507 0,450333 0,545 49 y = 0,0561x 0,6 R2 = 0,997 dOD 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 10 tinh bột (mg/ml) Đồ thị 2.2 Sự tƣơng quan giá trị OD560nm hàm lƣợng tinh bột (mg/ml) 2.10 Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp LOWRY Bảng 2.5 Giá trị OD750nm tƣơng ứng với nồg độ albumin 50 100 150 200 250 OD750nm trung bình 0,043 0,1117 0,1683 0,2253 0,277 0,33133 dOD 0,0687 0,1253 0,1823 0,234 0,28833 dOD Albumin (μg/ml) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 y = 0,0012x R2 = 0,9961 50 100 150 200 250 albumin (μg/ml) Đồ thị 2.3 Sự tƣơng quan giá trị OD750nm hàm lƣợng protein 50 2.11 Thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis Bảng 2.6 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase Thời gian (giờ) Số lần Trung bình Phƣơng sai Sai số 0,297 0,295 0,296 0,296 1E-06 0,0006 48 60 72 5,209 5,227 5,227 0,0003332 0,0105 52454,27 52089,17 52271,72 52272,38 33324,117 105,395 0,264 0.262 0,258 0,261 9,33E-06 0,0018 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 4,634 4,597 4,524 4,585 0,0031103 0,0322 Hoạt độ (UI/g CT) 36 5,245 ∆OD 24 ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CT) 367790,03 361948,7 375092,2 366817,31 43365784 3802,008 ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CT) 0,267 0,265 0,269 0,267 4E-06 0,0012 4,689 4,652 4,725 4,689 0,001333 0,0211 468865,3 465214,3 472516,2 468865,26 13329647 2107,894 0,256 0,251 0,251 0,252 8,33E-06 0,0017 4,488 4,397 4,397 4,427 0,002777 0,0304 448784,9 439657,4 439657,4 442699,56 27770097 3042,482 0,233 0,233 0,230 0,231 2,33E-06 0,0009 4,068 4,050 4,013 4,044 0,0007776 0,0161 406798,6 404973,1 401322,2 404364,3 7775627,2 1609,93 ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CT) ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CT) 2.12 Kết tủa enzyme cồn 96% (NH4)2SO4 Bảng 2.7 Ảnh hƣởng tỷ lệ cồn 96% lên hoạt độ α-amylase Hoạt độ (UI/ml dịch chiết enzyme) Hoạt độ (UI/10ml DCE) 5020,56 50205,64 Hoạt độ (UI/100ml CPE tƣơi) Hiệu Phƣơng Enzyme/cồn Sai số suất Trung sai Lần Lần Lần (%) bình 1:1 4001,80 4640,72 4458,17 4366,90 108303,38 190,003 8,698 1:2 44025,66 43934,38 44208,21 44056,08 19439,07 80,497 87,751 1:3 45303,50 45577,32 45942,42 45607,75 102749,4 185,067 90,842 1:4 44345,12 44071,29 44436,39 44284,27 36101,13 109,698 88,206 1:5 43341,10 43614,92 42702,18 43219,40 219383,77 270,422 86,085 Trƣớc tủa 51 Bảng 2.8 Hàm lƣợng protein tƣơng ứng tỷ lệ cồn 96% α-amylase Protein (mg/ml DCE) 9,703 Protein (mg/100ml CP tƣơi ) Trƣớc tủa Enzyme/cồn Lần Lần TB 10,900 14,883 22,193 22,894 23,638 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 Lần 10,112 16,809 21,405 23,069 23,463 10,375 16,196 21,668 23,419 23,988 Protein (mg/10ml DCE) 97,032 Hiệu Phƣơng sai Sai số suất (%) 0,1609487 0,232 10,78 0,9682472 0,568 16,45 0,1609487 0,232 22,42 0,0715328 0,154 23,83 0,0715328 0,154 24,42 10,462 15,963 21,756 23,127 23,696 Bảng 2.9 Hoạt độ α-amylase sau tủa (NH4)2SO4 Hoạt độ (UI/ml DCE) 5157,47 Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Trƣớc tủa Độ bão hòa (%) Lần Lần Lần TB 50 55 60 65 70 31571,450 37017,493 37595,565 37078,343 36743,670 31693,149 36774,095 37595,565 37504,290 36865,369 32240,796 36956,644 37534,715 37260,892 37169,617 31835,132 36916,077 37575,282 37281,175 36926,219 Hoạt độ (UI/10ml DCE) 51574,76 Hiệu Phƣơng Sai số suất sai (%) 127125,3 205,852 61,73 16044,95 73,132 71,58 1234,227 20,283 72,86 45666,38 123,378 72,29 48134,84 126,669 71,60 Bảng 2.10 Hàm lƣợng protein tƣơng ứng độ bão hoà (NH4)2SO4 dùng tủa α-amylase Protein (mg/ml DCE) 9,85 Protein (mg/100ml CP tƣơi) Trƣớc tủa Độ bão hòa (%) Lần Lần Lần TB 50 55 60 65 70 14,825 16,021 15,904 16,605 19,173 14,591 15,846 16,488 16,546 19,231 15,000 15,671 16,488 16,897 18,706 14,805 15,846 16,293 16,683 19,037 Protein (mg/10ml DCE) 98,57 Hiệu Phƣơng sai Sai số suất (%) 0,0420113 0,118 15,02 0,0306569 0,101 16,08 0,1135441 0,195 16,53 0,0351987 0,108 16,92 0,0828872 0,166 19,31 52 2.13 Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian tủa cồn 96% Bảng 2.11 Hoạt độ α-amylase sau thời gian tủa cồn 96% Hoạt độ (UI/ml DCE) 5020,56 Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Trƣớc tủa Phút Lần 15 30 45 60 75 Lần Lần 50277,96 48680,65 45759,87 45486,05 44253,84 50186,68 48771,93 46033,69 45851,15 44162,57 50643,06 48771,93 46033,69 45851,15 45075,31 Trung bình 50369,23 48741,50 45942,42 45729,45 44497,24 Hoạt độ (UI/10ml DCE) 50205,64 Hiệu Phƣơng sai Sai số suất (%) 58317,204 139,424 93,24 2777,010 30,425 90,23 24993,087 91,274 85,05 44432,155 121,699 84,65 252707,884 290,234 82,37 Bảng 2.12 Hàm lƣợng protein tƣơng ứng thời gian tủa cồn 96% Trƣớc tủa Phút 15 30 45 60 75 Protein (mg/ml DCE) 9,703 Protein (mg/100ml CP tƣơi) Lần Lần Lần TB 21,230 22,193 23,244 23,463 24,294 21,580 22,368 23,069 23,813 24,469 21,668 21,931 22,894 24,251 24,207 21,493 22,164 23,069 23,842 24,324 Protein (mg/10ml DCE) 97,032 Hiệu Phƣơng sai Sai số suất (%) 0,0536496 0,134 22,15 0,0485401 0,127 22,84 0,0306569 0,101 23,77 0,1558393 0,228 24,57 0,0178832 0,077 25,07 53 2.14 Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt độ CPE Bảng 2.13 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt độ chế phẩm α-amylase Nhiệt độ (oC) Số lần Trung bình Phƣơng sai Sai số 0,279 0,284 0,293 0,285 5,03333E-05 0,0041 45 50 55 60 65 5,008 5,172 5,032 0,0167731 0,075 819473 834686 862068 838742 4,66E+08 12462 0,317 0,323 0,320 0,320 9,33333E-06 0,0018 Lƣợng tinh bột (mg/ml) 5,601 5,711 5,674 5,662 0,0031103 0,032 Hoạt độ (UI/g CP) 40 4,917 ∆OD 30 ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ(UI/g CP) 933566 951821 945736 943708 86395857,8 5366 ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ(UI/g CP) 0,326 0,324 0,329 0,326 6,33333E-06 0,0015 5,775 5,738 5,830 5,781 0,0021105 0,027 962469,8 956385 971597 963484 58625760,65 4420 0,425 0,422 0,422 0,423 3E-06 0,0010 7,573 7,518 7,518 7,536 0,0009997 0,018 1262154 1253027 1253027 1256069 27770097,15 3042 0,445 0,446 0,448 0,446 2,33333E-06 0,0009 7,938 7,956 7,992 7,962 0,0007776 0,016 1323004 0,411 1326046 0,417 1332131 0,413 1327060 0,414 21598964,45 9,33333E-06 2683 0,0018 7,327 7,436 7,363 7,375 0,0031103 0,032 1221081 1239336 1227166 1229194 86395857,8 5366 0,310 0,302 0,315 0,309 4,3E-05 0,0038 5,483 5,337 5,574 5,464 0,0143294 0,069 913790 889450 929003 910748 398038059 11519 ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ(UI/g CP) ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ(UI/g CP) ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ(UI/g CP) ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ(UI/g CP) 54 2.15 Kết khảo sát ảnh hƣởng pH lên hoạt độ CPE Bảng 2.14 Ảnh hƣởng pH lên hoạt độ chế phẩm α-amylase Số lần ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) 0,427 7,619 Hoạt độ(UI/g CT) 1269760, 0,4345 pH 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CT) ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ(UI/g CT) ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ(UI/g CT) ∆OD Lƣợng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ(UI/g CT) Trung bình Phƣơng sai Sai số 0,424 0,416 0,422 3,23333E-05 0,0033 7,564 7,418 7,533 0,010774798 0,060 1260633 1236293 1255562 299299936 9988 0,4445 0,4335 0,438 3,7E-05 0,0035 7,755 7,938 7,737 7,810 0,012329923 0,064 1292579 1323004 1289537 1301707 342497865 10685 0,4215 0,4175 0,4175 0,419 5,33333E-06 0,0013 7,518 7,445 7,445 7,469 0,001777286 0,024 1253027 1240857 1240857 1244914 49369062 4057 0,4185 0,4165 0,4155 0,417 2,33333E-06 0,0009 7,463 7,427 7,409 7,433 0,000777563 0,016 1243899 1237814 1234772 1238829 21598964 2683 0,402 0,402 0,401 0,402 3,33333E-07 0,0003 7,162 7,162 7,144 7,156 0,00011108 0,006 1193698 1193698 1190656 1192684 3085566 1014 ... thích hợp sử dụng nhiều ngành cơng nghiệp y dƣợc Từ thực tiễn tiến hành đề tài ? ?Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α -amylase ứng dụng sản xuất dextrin” 1.2 MỤC ĐÍCH Thu nhận α -amylase, xác định...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************** NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS THU NHẬN α -AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT DEXTRIN Giáo viên... Thủy, Đại học Nông Lâm TP HCM Đề tài nghiên cứu ? ?Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α -amylase ứng dụng sản xuất dextrin”, thực phòng sinh hóa ứng dụng trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM từ
