Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp.xyli , Tác nhân gây bệnh cần mía gốc
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: CHU THỊ BÍCH PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VĂN BẰNG KỸ SƢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN CHU THỊ BÍCH PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** Graduation thesis Major: Biotechnology RESEARCH ON Leifsonia xyli subsp. xyli, THE CAUSAL AGENT OF RATOON STUNTING DISEASE ON SUGARCANE Doctor Student LE DINH DON CHU THI BICH PHUONG Ho Chi Minh City 8/ 2007 4 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, Bình Dương đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Anh Nguyễn Văn Lẫm, anh Nguyễn Anh Khoa và các anh chị tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Trường đại học Nông Lâm. Chị Kiều, chị Vy, Chị Vân cùng toàn thể các bạn sinh viên cùng thực hiện khóa luận tại phòng 105, khu Phượng Vĩ, Trường đại học Nông Lâm đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua. Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học K29 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sau cùng, con xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn sâu sắc nhất đối với bố mẹ; cám ơn bố mẹ và hai em đã luôn tin tưởng, yêu thương, tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt. Em cũng xin cám ơn anh đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện, Chu Thị Bích Phượng 5 TÓM TẮT Đề tài: "NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC" được thực hiện từ ngày 1 tháng 4 đến ngày 30 tháng 8 năm 2007 tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Hiện nay, cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới (Cuba, Ấn Độ, Australia); vì vậy, diện tích trồng mía cũng như sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở cây mía có đến 126 loại bệnh xảy ra làm giảm đáng kể đến năng suất và sản lượng của cây, gây thiệt hại to lớn đối với ngành công nghiệp đường trên thế giới (Ricaud và ctv., 1989). Trong đó, bệnh cằn mía gốc được phát hiện ở hầu hết các khu vực trồng mía, có thể làm giảm đến 50 % sản lượng đối với các giống nhạy cảm và không có khả năng kháng (Bailey và Bechet, 1995). Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), tác nhân gây bệnh cằn mía gốc. Đây là một loại vi khuẩn có kích thước nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm, đôi khi dài đến 10 m), dạng conryne, kí sinh chuyên tính gây tắc bó mạch của cây, làm giảm sức sống và số lượng chồi tạo thành, đặc biệt là các chồi hình thành sau khi thu hoạch. Cây bị bệnh này thường còi cọc, đường kính cũng như chiều dài thân nhỏ hơn so với cây bình thường (Davis và ctv., 1980). Mục đích của đề tài nhằm khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx trong bó mạch dọc theo vị trí lóng và khảo sát thời gian kí sinh gây tắc mạch của vi khuẩn khi xâm nhập vào cây; phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh; sau đó tiến hành các thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định Lxx từ các dòng vi khuẩn được phân lập. Các thí nghiệm khảo sát trên nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử (PCR, dot blot, nghiên cứu cấu trúc gen, cơ chế gây bệnh), từ đó đưa ra chiến lược xử lý và kiểm soát bệnh hiệu quả. Các nội dung thực hiện (1) Khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo các lóng bằng phương pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method). (2) Chủng bệnh các cây nuôi cấy 6 mô 3 tháng tuổi bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx. Sau đó, khảo sát thời gian vi khuẩn gây tắc mạch và tỉ lệ cây được chủng bị nhiễm. (3) Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh và thực hiện các phản ứng sinh hóa nhằm xác định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được. Các kết quả thu đƣợc (1) Kết quả cho thấy hầu hết mía được khảo sát đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc với tỉ lệ nhiễm khác nhau từ nhẹ đến trung bình. Vi khuẩn Lxx tập trung chủ yếu ở lóng thứ nhất từ dưới lên và có mật độ giảm dần trong các lóng ở phía trên. (2) Hầu hết các cây nuôi cấy mô sau khi chủng đều bị nhiễm bệnh. Kết quả khảo sát cho thấy cây bắt đầu bị tắc mạch sau khoảng 30 ngày chủng bệnh, tỉ lệ mạch tắc tăng dần theo thời gian quan sát (45, 60 ngày). (3) Các dòng khuẩn lạc phân lập được sau 28 – 42 ngày nuôi cấy đều có dạng tròn lồi, đường kính 0,1 – 0,3 mm, trong suốt giống như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx. Các khuẩn lạc này được cấy chuyền trên môi trường MSC và SC, sau đó tăng sinh trong môi trường lỏng S8 và thực hiện các thử nghiệm sinh hóa. Tuy nhiên, kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy chỉ có một dòng vi khuẩn phân lập được có thể là Leifsonia xyli subsp. xyli. Giới hạn của đề tài (1) Phương pháp nhuộm STM là một phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc. Tuy nhiên, phương pháp này không thể tiến hành ở giai đoạn sớm mà chỉ có thể tiến hành đối với những cây mía trên 3 tháng tuổi; do đó, việc kiểm soát bệnh ở giai đoạn cây còn nhỏ rất khó khăn. (2) Quá trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx rất khó khăn do đây là vi khuẩn ký sinh chuyên tính trong bó mạch của cây mía. Vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian 28 – 42 ngày, do môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra. (3) Kết quả thử nghiệm sinh hóa chỉ nhằm phát hiện sơ bộ vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được, cần phải tiến hành các thử nghiệm phân tử để xác định lại kết quả đã đạt được. 7 SUMMARY The thesis titled: "RESEARCH ON Leifsonia xyli subsp. xyli, THE CAUSAL AGENT OF RATOON STUNTING DISEASE ON SUGARCANE" was submitted to Biotechnology Department, Nong Lam University by CHU THI BICH PHUONG in partial fulfillment of the requirements for the degree of Bachelor in Biotechnology. Ratoon stunting disease (RSD), caused by the xylem–limited coryneform bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), is a major constraint for worldwide sugarcane production. However, RSD is difficult to detect in the field because the typical symptoms of this disease, such as thinner, weaker and fewer stalks per stool, could be due to unknown factors. Since Lxx spread mechanically by infected planting and harvesting equipments, as well as by infected plant materials, it is necessary that the initial planting material be free of RSD. Our research was conducted to investigate the Lxx's distribution along the stalk, the infection level of the inoculated plants and the time for Lxx colonized the vascular; in order to develop the best control strategy to prevent losses from RSD. Although Lxx's colonization in the sugarcane is a systemic infection, the results of staining by Transpiration Method (STM) showed that the titer of the bacterium was different between the internodes. The bacteria titer was highest in the basal internode, it is suitable for conclusions of Dean (1984) and Grisham (2007); so that diagnoses should be conducted on this position. It took about 30 days for Lxx to colonize in the xylem vascular of the inoculated plants. After 28 – 42 days inoculated, bacteria strains isolated from sap of infected plants were subjected to the biochemical tests for identifing Lxx. The preliminary results showed that only one strain was recommended to be Lxx; consequently, molecular biology tools should be used to dissect Leifsonia xyli subsp. xyli, the causal agent of RSD. 8 MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn . iii Tóm tắt . iv Summary vi Mục lục vii Danh sách các chữ viết tắt . x Danh sách các bảng xi Danh sách các hình . xii 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu . 3 1.2.1. Mục đích . 3 1.2.2. Nội dung . 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía . 4 2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển . 4 2.1.2. Phân loại học 4 2.1.3. Phân bố . 5 2.1.4. Đặc điểm thực vật học 5 2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía . 5 2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển 6 2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía . 8 2.2. Các loại bệnh hại trên mía . 9 2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc . 12 2.3.1. Tác nhân gây bệnh 12 2.3.2. Triệu chứng . 13 2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh . 14 9 2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh . 15 2.4. Các phương pháp chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Lxx 16 2.4.1. Phương pháp chẩn đoán truyền thống . 16 2.4.2. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi . 16 2.4.3. Phương pháp nhuộm STM 16 2.4.4. Phương pháp huyết thanh học . 17 2.4.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử . 18 2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc 19 2.5.1. Trên thế giới 19 2.5.2. Trong nước 20 3. VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP . 21 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21 3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm . 21 3.2.1. Vật liệu thí nghiệm 21 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 21 3.2.3. Thiết bị, dụng cụ . 22 3.3. Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu 22 3.3.2. Phương pháp nhuộm STM 24 3.3.3. Phương pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh 24 3.3.4. Phương pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được 24 3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn 24 3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate . 26 3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh vật . 26 3.4. Bố trí thí nghiệm 27 10 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh . 29 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng 34 4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx . 38 4.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được . 41 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 45 5.1. Kết luận 45 5.2. Đề nghị . 45 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 47 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 48 Tài liệu tham khảo Internet . 51 7. PHỤ LỤC . 52 Phụ lục 1: Môi trường SC . 52 Phụ lục 2: Môi trường MSC 52 Phụ lục 3: Môi trường lỏng S8 53 Phụ lục 4: Môi trường Phenol Red Carbohydrate Broth . 53 Phụ lục 5: Môi trường Starch . 53 Phụ Lục 6: Bảng sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx . 54 [...]... xyli subsp xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc" nhằm tìm hiểu kĩ lưỡng hơn về tác nhân gây bệnh Từ đ , đưa ra được một phương pháp phát hiện vi khuẩn nhanh chóng và chính xác, góp phần vào chiến lược kiểm soát và hạn chế bệnh 1.2 Mục đích, nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích Thực hiện các nghiên cứu cơ bản về bệnh cằn mía gốc và vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli để tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn... thế giới và các tác nhân gây bệnh chưa có gì thay đổi với 126 bệnh gồm: 9 bệnh do virus, 2 bệnh do phytoplasma, 9 bệnh do vi khuẩn, 68 bệnh do nấm, 3 bệnh do thực vật kí sinh, 2 bệnh do tác động cơ giới và 24 bệnh chưa xác định được nguyên nhân (Joaquin, 2001) (Trích dẫn bởi Hà Đình Tuấn, 2004) Ở Vi t Nam, tình hình nghiên cứu và khảo sát bệnh trên cây mía không nhiều Theo kết quả nghiên cứu của Hà... leaf virus 15 Nguồn: Hà Đình Tuấn (2004) Pseudomonas rubrilineans 25 2.3 Sơ lƣợc về bệnh cằn mía gốc 2.3.1 Tác nhân gây bệnh Bệnh cằn mía gốc xảy ra ở hầu hết các khu vực trồng mía trên thế giới: Antigua, Argentina, Australia, Bangladesh, Barbados, Belize, Bolivia, Brazil, Burkina Faso, Cameron, Trung Quốc, Colombia, Congo, Costa Rica, Cuba, Ấn Đ , Indonesia, Nhật, Malaisia, Mali, Mexico, Đài Loan, Thái... Monteiro-Vitorello và ctv ., 2004) Đến năm Hình 2.3 Vi khuẩn Lxx - tác nhân gây bệnh cằn mía gốc (Nguồn: www .leifsonia. lncc.br/ lxxsite/index.php) 198 0, Davis và ctv đã phân lập thành công loại vi khuẩn này từ dịch chiết của cây bị bệnh trên môi trường nhân tạo Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli (Lxx) là một loại vi khuẩn có kích thước nhỏ ( 0,2 5 - 0,3 5 x 1 - 4 m, đôi khi dài đến 10 m) (Davis và ctv ., 1980 ), dạng... liệu mía Đông Nam Bộ có 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chưa biết tác nhân và một số bệnh khác do tuyến trùng, thực vật kí sinh, do yếu tố môi trường và dinh dưỡng gây ra Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến được trình bày ở bảng 2.1 23 24 Bảng 2.1 Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến Tên Vi t Nam Tên tiếng Anh Tác nhân gây. .. Brumbley và ctv ., 2006) Bệnh cằn mía gốc được phát hiện đầu tiên ở Australia từ năm 1944 - 1945 nhưng vào thời điểm đó người ta vẫn chưa tìm ra nguyên nhân Hughes và Steindl (1955) đã tìm ra tác nhân gây bệnh và cho rằng đó là do virus Năm 197 3, một loại vi khuẩn nhỏ được phát hiện là có liên kết với bệnh cằn mía gốc (Gillaspie và Teakle, 1989; Teakle và ctv ., 1978) (Trích dẫn bởi Claudia B Monteiro-Vitorello... vi khuẩn 35 Hóa chất trong các thử nghiệm sinh hóa khẳng định vi khuẩn Lxx: dung dịch KOH 3 % (Merk, Đức ), proteone peptone (Oxoid, Anh ), NaCl (Merk, Đức ), beef extract (Himedia, Ấn Độ ), phenol red (Merk, Đức ), manitol (Merk, Đức ), sorbitol (Merk, Đức ), H2O2 30 % (Trung Quốc ), dung dịch thuốc thử KI (Trung Quốc ), peptone (Himedia, Ấn Độ ), starch (Vi t Nam ), agar (Vi t Nam ), casein (Oxoid, Anh ), ferric... b , dụng cụ Các thiết b , dụng cụ được sử dụng trong toàn bộ quá trình thí nghiệm bao gồm: kính hiển vi quang học, nồi hấp vô trùng, tủ sấy, tủ cấy vô trùng (microflow ), máy đo pH, tủ định ôn, màng lọc vô trùng ( 0,2 m và 0,4 5 m ), màng parafilm, cối, chày, dao, hộp nhựa, bercher, kim tiêm, túi nilon, ống nghiệm, ống Durham, bình tam giác, đĩa petri, micropipet và đầu típ các loại 3.3 Phƣơng pháp nghiên. .. lợi về nhiệt đ , ẩm đ , ánh sáng, ngập lụt hay khô hạn cũng góp phần làm gia tăng tỉ lệ bệnh Bệnh gây thiệt hại nặng nề hơn trong các vụ mía gốc, mía tái sinh từ gốc sót lại cũng dễ dàng lây bệnh sang mía tơ (Westphal và Mirkov, 2003) 2.3.4 Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh Bệnh cằn mía gốc được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất tác động đến sản lượng mía trên thế giới Vi khuẩn Lxx chủ... trình phát hiện Lxx trong dịch chiết và dịch khuẩn lạc bằng kĩ thuật PCR (Y Pan và ctv ., 1998); giải mã trình tự bộ gen của Lxx (Luis và ctv ., 2004) Ở nước ta, bệnh cằn mía gốc là một loại bệnh đã được phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã có nhiều vùng bị thiệt hại nặng nề do bệnh gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004) Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về căn bệnh này cũng như vi khuẩn . cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc& quot; nhằm tìm hiểu kĩ lưỡng hơn về tác nhân gây bệnh. Từ đ , đưa ra được. cảm và không có khả năng kháng (Bailey và Bechet, 1995). Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx ), tác nhân gây bệnh cằn mía gốc.