VIỆN KHOA HỌC V CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI Tài liệu hướng dẫn thực tập CÔNG NGHỆ ENZYME VÀ PROTEIN ( Dùng cho học viên cao học) Phụ trách thực tập: CN. Đỗ Thị Tuyến ThS. Diệp Quỳnh Như ThS.Nguyễn thị Như Quỳnh Tp.HCM, 03/2010 Thửùc taọp moõn: Coõng ngheọ enzyme vaứ protein 1. MC CH - YấU CU Ni dung bi thc tp ny giỳp sinh viờn hiu c: o Phng phỏp trớch ly v thu nhn enzyme bromelin t thc vt o Phng phỏp tinh sch enzyme bng k thut sc ký lc gel o Phng phỏp xỏc nh hot tớnh enzyme protease v xỏc nh mt s thụng s ti u cho hot ng ca enzyme protease. o Phng phỏp xỏc nh hm lng protein theo Lowry, t ú xỏc nh c hot tớnh riờng ca enzyme. 2. NI DUNG V PHNG PHP [1] Thu nhn bromelin t da: Trớch ly, ta enzyme v sy phun thu nhn bromelin dng bt [2] Tinh sach Enzyme bromelin bng sc ký lc gel [3] Xỏc nh hot tớnh thy phõn c cht casein ca enzyme protease theo hóng Amano, pH 7,0. [4] Xỏc nh nhit ti u cho hot ng ca enzyme protease [5] Xỏc nh pH ti u cho hot ng ca enzyme protease [6] Xỏc nh hm lng protein theo Lowry, t ú xỏc nh hot tớnh riờng ca enzyme protease. 3. KT QU T C - Xỏc nh c nhit v pH ti u cho hot ng ca enzyme protease. - Xỏc nh c hot tớnh bromelin/gam nguyờn liu & hot tớnh riờng ca enzyme bromelin. - Hiu sut tinh sch bromelin sau sc ky K THUT TRCH LY THU NHN ENZYME BROMELIN T DA ( Ananas conosus L) NGUYấN LIU: ngn (nh sinh trng), v qu, tht v lừi da Quy trỡnh trớch ly v thu nhn bromelin dng thụ Nguyờn liu c xay nh, trớch trong nc ct t l 1:3 (w/w) , riờng i vi tht qu da c ộp ly nc lc qua vi mn thu dch E thụ, b cn ly tõm 2000rpm trong 5 phỳt- thu dch lc. Dch lc c ta cn 96% t l 3V cn:1 V dch lc hoc ta bng (NH4) 2 SO 4 70% bóo hũa ( dch E v dung mụi ta phi c lnh trc khi trn v ta), thi gian ta khong 45 phỳt. Khi quan sỏt thy cn ta- ly tõm 5000 rpm, 10 phỳt 5 0 C. Thu cn ta- Sy phun thu Bromelin dng bt thụ K THUT SY PHUN Trang 2 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein Sấy phun là kỹ thuật làm chuyển từ một dung dịch, huyền phù hay nhủ hố thành dạng bột. Nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành cơng nghiệp như: thự phẩm, dược, hố học, vật liệu và cơng nghệ nano. 1. NGUN TẮC HOẠT ĐỘNG Q trình sấy phun trải qua 4 bước cơ bản sau: o Mẫu dạng lỏng được phân phối thành dạng phun sương o Các hạt phun sương tiếp xúc với khí nóng o Làm khơ các hạt phun sương o Tách sản phẩm (ở dạng bột) khỏi luồng khí Hình 1: Sơ đồ cơ bản của một hệ thống sấy phun Mẫu được bơm từ một bình chứa mẫu qua 1 vòi phun – spray nozzle (2) bằng bơm lưu chất – fluid pump (1). Khơng khí từ máy nén khí được kiểm sốt bởi một vale kim – needle vale (3) và chuyển qua vòi phun, hồ trộn với mẫu ở đầu vòi phun. Sau đó, q trình sấy mẫu diễn ra trong buồng sấy – drying chamber (7). Lúc này, mẫu được chuyển thành dạng các hạt chất lỏng với đường kính 20 um và có diện tích bề mặt lên đến 3.000 cm 2 / ml. Khơng khí được hút vào thiết bị bằng máy hút – aspirator (10) và được làm nóng đến nhiệt độ đã chọn (nhiệt độ set) bằng bộ gia nhiệt – heater (5). Luồng khí nóng này được hút vào buồng sấy mẫu và tiếp xúc với các hạt mẫu, làm khơ nó ngay lập tức. Do diện tích bề mặt của mẫu q lớn, hơn 90% hơi nước được làm bay hơi bằng luồng khí nóng liên tục trong buồng sấy. Trang 3 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein Hình 3: đầu phun của máy sấy phun Mẫu đã được làm khơ, ở dạng bột mịn, tiếp tục được làm khơ và chuyển qua một ống xốy đặc biệt – cyclone (8), tất cả hơi nước được tách ra ở đó và được thu hồi vào bình chứa sản phẩm – product vessel (9). Q trình làm khơ này thường mất khoảng 0,5 giây hoặc ít hơn. Vì các hạt mẫu ln được bao quanh bởi hơi nước, nên nhiệt độ xung quanh các hạt nhỏ này sẽ khơng thể tăng cao hơn nhiệt độ của hơi nước. Các mẫu nhạy với nhiệt, chẳng hạn enzyme, có thể được chuyển thành dạng bột mà chỉ mất một phần rất nhỏ hoạt tính, với một nhiệt độ tương đối cao (80 0 C). Hỗn hợp hơi nước và khơng khí sẽ được hút ra ngồi qua máy hút. Chế độ nhiệt của q trình vận hành sẽ được hiển thị trên khung điều khiển bằng cách kiểm sốt nhiệt độ đầu vào – inlet và đầu ra – outlet, thơng qua các sensor. Nếu mẫu dính vào đầu vòi phun, khí nén sẽ thổi vào đầu phun ở bộ phận phân phối – distributor (6) bằng cách mở và điện từ – electromagnetic vale (4) để loại bỏ mảng dính đó. Nếu cần thiết, khơng khí có thể được cho vào buồng sấy bằng cách tháo nắp – cap (11) ở bean hơng ra. 2. CÁC BƯỚC VẬN HÀNH 1. Bật nút ON (CP) ở phía sau của máy 2. Bật cơng tắc ON (1) 3. Bật cơng tắc máy hút (2) 4. Điều chỉnh luồng khí vào buồng sấy mẫu bằng cách chỉnh núm số máy hút (3) Điều chỉnh nhiệt độ 5. Chọn chế độ kiểm sốt INLET hoặc OUTLET (5). Nhiệt độ inlet tối đa là 230 0 C. Nhiệt độ outlet tối đa là 140 0 C. 6. Chỉnh đèn set nhiệt độ (SV) (16) bằng cách ấn nut PV/SV (21). 7. Set giá trị nhiệt độ cần thiết bằng nút Up (23) hoặc Down (20). Khi đạt được giá trị cần set, ấn nút Enter (22). Bật ON của cơng tắc gia nhiệt (4). 8. Xem nhiệt độ hiện thời bằng nút PV/SV (21). 9. Khi đèn kiểm sốt nhiệt (18) nhấp nháy và sự dao động nhiệt chậm lại chính là lúc nhiệt độ hiện tại PV đã được thiết lập. 10. Trong q trình vận hành, muốn tăng nhiệt độ thì nhấn nút PV/SV (21), rồi tiếp tục theo các bước 6, 7 và 8 như trên. 11. Nếu nhiệt độ outlet hiển thị (7) vượt q nhiệt độ cần thiết (nhiệt độ set), thì mở vale kim (14) để chỉnh áp suất vào vòi sấy. Trang 4 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein 12. Bật ON cơng tắc bơm (10) và (11). Sau đó, chuyển một lượng thích hợp dịch vào sấy. Nếu mẫu dùng nước làm dung mơi, thì nên dùng nước tinh khiết (nước cất hay nước khử ion). 13. Khi nhiệt độ outlet đạt giá trị cần thiết, điều chỉnh tốc độ dòng khí, lượng mẫu và áp suất khí nén tương ứng sao cho phù hợp với các điều kiện u cầu. Chú ý: • Nếu nhiệt độ inlet vẫn khơng thay đổi, thì theo các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ outlet như sau: • Tốc độ dòng chất lỏng mẫu cao Nhiệt độ outletthấp • Tốc độ dòng khí sấy cao Nhiệt độ outletcao • Độ đặc (yếu tố nội tại) cao Nhiệt độ outletcao • Nếu áp suất khí nén tăng, thì mẫu sẽ được sấy thành các hạt mịn hơn. 14. Khi các yếu tố biến động trên đã được set đến giá trị cần thiết (đã ổn định), thay nước cất bằng mẫu cần sấy. Lúc này nhiệt độ outlet có thể dao động nhẹ. Nếu cần, điều chỉnh tốc độ bưm mẫu và các yếu tố liên quan. 15. Khi lượng bột cần thiết đã được thu hồi trong bình sản phẩm, dừng cho mẫu vào và thay bằng nước cất trở lại. Lúc này, giảm nhẹ tốc độ bơm. 16. Tắt gia nhiệt (4). 17. Khi nhiệt độ inlet hạ xấp xỉ 100 0 C, tắt bơm (10) và (11). Đóng vale kim để ngừng phun. 18. Chỉnh nút của máy hút (3) về 0 một cach từ từ và tắt máy hút (2). 19. Tắt cơng tắt của máy chính (1). 20. Tháo bình sản phẩm ra. Đơi khi mẫu đã được sấy dính vào ống cyclone, vì vậy, cần lấy ra cẩn thận. 21. Tắt CP, khố máy nén khí và rút day khỏi nguồn điện. 3. PHƯƠNG PHÁP VỆ SINH VÀ BẢO TRÌ MÁY 1. Tháo các bộ phận của buồng sấy mẫu và ống cyclone (đều làm bằng thuỷ tinh) cẩn thận và rửa dưới vòi nước máy. 2. Rửa tất cả các khu vực mà bột mẫu có thể bám vào như: bộ phận phân phối mẫu, sensor nhiệt outlet, ống hút khí,… 3. Loại bỏ các vết bẩn trong ống bơm mẫu bằng cách bật nút ON của cơng tắc bơm (10) và (11). Sau đó, bơm với nước cất. 4. Vòi phun mẫu nên được rửa bằng bể rửa siêu âm. Cần rửa bộ phận phun mẫu thật cẩn thận, vì máy sẽ khơng hoạt động được nếu còn bất kỳ vết dơ nào trong vòi phun. 5. Rửa màng lọc khí ở đầu khí vào của ống khí. Tháo nắp ở phía trên và kéo ống khí ra. Lấy màng lọc khí và rửa như sau: • Đặt màng dưới vòi nước chảy, sau đó sấy khơ • Thổi bụi bằng khí nén • Làm sạch bằng máy hút chân khơng • Nếu khơng thể làm sạch màng thì có thể thay màng mới. 6. Làm sạch màng lọc của máy hút (khí xả) Trang 5 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein Loại các bụi bẩn dính vào đầu ra của máy hút • Mở cửa sổ gắn với máy hút ở phía dưới máy chính • Tháo nắp ở trên, tháo ốc gắn máy hút • Tháo máy hút ra và gỡ ống gắn với máy hút • Kéo máy hút sang một bên • Tháo nắp ở trên máy hút. Lấy màng lọc ra • Làm sạch màng lọc giống như bước 5 ở trên • Lắp ráp trở lại theo trình tự ngược lại. Để lắp màng lọc, đặt bề mặt mềm ra phía người dùng. 4. CÁC CHÚ Ý KHI VẬN HÀNH 1. Các điều kiện sấy tối ưu thay đổi tuỳ thuộc vào mẫu cần sấy. 2. Một số ngun nhân khiến lượng lớn mẫu dính vào thành của buồng sấy là: mẫu có nồng độ cao, nhiệt độ đầu vào thấp, áp suất khí nén q cao hay q thấp và tốc độ bơm mẫu q cao. Do đó, cần chỉnh các điều kiện thật phù hợp. 3. Khi hướng phun mẫu thay đổi do mẫu dính vào đầu phun, cần bật ON nút pulse jet (12) để thổi sạch vết bám. Nếu điều này khơng làm sạch được thì tháo vòi phun ra và lau sạch bằng khăn giấy. 4. Ngun nhân làm kết dính mẫu vào bình cyclone là do hơi nước q bão hồ gây ra, hoặc có thể do tính chất của mẫu (độ tan chảy thấp, có khả năng kết bám,…). Để giảm lượng nước trong bột mẫu thì cần tăng nhiệt độ của mẫu. Tăng nhiệt độ đầu vào hoặc đầu ra hoặc tốc độ khí sấy hoặc giảm tốc độ bơm mẫu. Điều này làm giảm sự chênh lệch nhiệt độ đầu vào và đầu ra của ống cyclone. Nếu ngun nhân do đặc tính của mẫu thì cần thêm vào một số chất phù hợp. 5. Khi bột mẫu có tính giữ ẩm cao, nó có thể trở nên ướt trong bình thu sản phẩm. Có thể khắc phục theo phương pháp đề cập ở mục 4, hoặc gia nhiệt bình đựng mẫu nếu cần. 6. Vòi phun chuẩn có kích thước đường kính là 406 um, nhưng nếu sấy mẫu với các hạt rắn lớn thì có thể dùng các vòi phun lớn hơn: 508 hoặc 711 um để tránh bị nghẽn đầu phun. Do sự khác nhau về kích thước của các đầu phun, nên các điều kiện sấy cũng khác nhau. Hình 5 cho thấy mối tương quan giữa áp suất và tốc độ dòng khí phun đối với vòi phun chuẩn 406 um (được hiệu chuẩn so với áp suất khí quyển). 7. Thỉnh thoảng, một số hạt mẫu rất mịn nên khơng thể được thu nhận bởi ống cyclone, do đó, nó bị hút ra ngồi cùng với hơi nước. Nếu bột mẫu q mịn thì cần giảm tốc độ dòng khí sấy, hoặc giảm áp suất của dòng khí. Bột mẫu càng mịn nếu mẫu càng lỗng. Do đó, cần điều chỉnh độ đặc cảu mẫu cho phù hợp. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH PROTEASE A Xác định hàm lượng protein theo Lowry A.1. Ngun tắc Hầu hết các protein đều chứa hai amino acid là Tyrosin và Tryptophan, hàm lượng của những amino acid này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau sẽ chứa hàm lượng amino acid này như nhau. Trang 6 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu, màu này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan (Hàm lượng protein). Vì thế ta có thể dùng phương pháp so màu và xác định được hàm lượng protein. A.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị A.2.1.Hóa chất Na 2 CO 3 Citrate Natri 1% NaOH 0,1M Albumin tinh khiết Thuốc thử Folin Dung dịch Albumin 0,1%: Cân chính xác 0,1 g Albumin, pha lỗng với nước cất thành 100 ml dung dịch. Dung dịch A: Cân 2 g Na 2 CO 3 , hòa tan trong NaOH 0,1N thành 100 ml. Dung dịch B: Cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong Citrate Natri 1% thành 100 ml. Dung dịch C: Pha hỗn hợp dung dịch A và B theo tỷ lệ 49:1 (Chỉ pha để dùng ngay trong ngày). A.2.2. Dụng cụ và thiết bị Ống nghiệm Máy đo quang phổ UV-Vis Bình định mức 50 ml; 100 ml Pipet 1 ml; 5 ml; 10 ml; 25 ml A.3. Các bước tiến hành A.3.1. Dựng đường chuẩn Albumin Pha dung dịch Albumin để đạt các nồng độ: 0; 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700 µg/ml theo bảng sau: Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7 Hàm lượng protein µg/ml 0 100 200 300 400 500 600 700 Dung dịch Albumin 0,1% (ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 Nước cất (ml) 10 9 8 7 6 5 4 3 Hút 0,5 ml dung dịch Albumin 0,1% có các nồng độ theo thứ tự 0; 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700 µg/ml cho vào các ống nghiệm sạch và sấy khơ đã đánh số sẵn. Thêm vào đó 2 ml dung dịch C. Lắc đều và để n ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó thêm vào 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5 ml. Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm. Vẽ biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo hàm lượng protein chuẩn (µg/ml) A.3.2. Xác định hàm lượng protein trong mẫu enzyme protease. Trang 7 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein Hút 0,5 ml dung dịch enzyme protease (đã pha sẵn ở Phần B), cho vào một ống nghiệm sạch và sấy khơ. Thêm vào đó 2 ml dung dịch C. Lắc đều và để n ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó thêm vào 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5 ml. Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm. A.4. Tính tốn Từ đường chuẩn, so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein, suy ra hàm lượng protein của 0,5 ml dung dịch enzyme protease đã pha lỗng. Từ đó tính được: A.4.1. Hàm lượng protein có trong 1ml dung dịch enzyme đã pha lỗng (mg protein/ml dung dịch enzyme protease đã pha lỗng) A.4.2. Hàm lượng protein có trong 1g enzyme protease ban đầu (mg protein/ g enzyme protease ban đầu) B. Xác định hoạt tính enzyme protease (số tiết: 4) B.1. Ngun tắc Dùng protein ‘casein’ làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme. B.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị B.2.1.Hóa chất HCl 0,1M Na 2 CO 3 0,4M Dung dịch Trichloracetic 0,4M Tyrosin tinh khiết NaOH 0,1M Thuốc thử Folin H 3 PO 4 1/30M Đệm Phosphate (ph 7,0) 0,1M Dung dịch Casein 1,5%: Cân 1,5g casein từ sữa (Hãng Merck). Thêm 25 ml dung dịch NaOH 0,1 M, đun nóng trong bồn nước ở nhiệt độ 90 – 95 o C trong 10 phút. Sau khi làm lạnh, điều chỉnh pH đến 7,0 bằng dung dịch acid phosphoric 1/30 M. Thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch đệm Phosphate (pH 7,0) 0,1M. Thêm nước cất vào dung dịch để đạt thể tích 100 ml. Enzyme Protease : Bromelin trích từ dứa ở dang thơ được pha lỗng trong đệm Phosphate (pH 7,0) 0,1M. B.2.2. Dụng cụ và thiết bị Ống nghiệm Giấy lọc Tủ ấm Bồn đun nước và giữ nhiệt Máy đo quang phổ UV-Vis Máy đo pH Bình định mức 50 ml; 100 ml; 1000 ml Pipet 1 ml; 5 ml; 10 ml; 25 ml B.3. Các bước tiến hành Trang 8 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein B.3.1. Dựng đường chuẩn Tyrosin Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80 µgTyrosin/1 ml HCl 0,1M. Thêm 5 ml dung dịch Na 2 CO 3 0,4 M vào 1 ml dung dịch Tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha lỗng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 ± 0,5 o C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả A s10 ; A s20 ; As 30 ; A s40 ; A s50 ). Đối với đối chứng: dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho Tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này làm đối chứng A s0 ). Dựng đường chuẩn theo hàm lượng µg Tyrosin và độ hấp thụ. B.3.2. Xác định hoạt tính enzyme protease Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1,5% vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37 ± 0,5 o C trong 10 -15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1 ml dung dịch enzyme vào và lắc đều . Đem ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ 37 ± 0,5 o C trong 60 phút. Sau đó, cho vào hỗn hợp này 2 ml dung dịch acid Trichloracetic 0,4M. Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sua đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5 ml dung dịch Na 2 CO 3 0,4M vào 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha lỗng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp này. Trộn đều, để n ở 37 ± 0,5 o C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm (A 60 ). Mẫu đối chứng: lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm (A 0 ). B.4. Tính tốn Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg Tyrosin trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. B.4.1. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml dung dịch enzyme) = ({(A 60 – A 0 ) –b}/ a x 1/100 B.4.2. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = {(A 60 – A 0 ) –b}/ a x 1/100 x n Trong đó: A 60 : Độ hấp thụ của mẫu A 0 : Độ hấp thụ của mẫu đối chứng a,b là các hệ số lấy từ phương trình đường chuẩn tyrosin ( y= ax+b). n: Hệ số pha lỗng của enzyme 1/100: Hệ số chuyển đổi C. Tính tốn hoạt tính riêng của enzyme protease Từ kết quả hàm lượng protein ở mục A.4 và kết quả hoạt tính enzyme protease của mục B.4. Tính hoạt tính riêng của enzyme: số ĐVHT/mg protein enzyme. Có 2 cách tính: C.1. Hoạt tính riêng (ĐVHT/ mg protein enzyme) 1.4. 1.4. A B = C.2. Hoạt tính riêng (ĐVHT/ mg protein enzyme) 2.4. 2.4. A B = Trang 9 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein D. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme protease. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme protease theo các giá trị pH như sau: pH 6.0; 7.0 và 9.0. Các bước thực hiện tương tự như Mục B, nhưng có một số khác biệt sau: Pha thêm dung dịch cơ chất casein 1,5% ở pH 6.0 và 9.0. Pha thêm dung dịch enzyme protease ở pH 6.0 và 9.0. E. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme protease. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease theo các giá trị nhiệt độ như sau: 27 o C; 37 o C; 47 o C. Các bước thực hiện tương tự như Mục B, nhưng có một số khác biệt sau: Đối với nhiệt độ 27 o C: cho thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 27 o C. Đối với nhiệt độ 47 o C: cho thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 47 o C. TINH SẠCH ENZYME PROTEASE BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL A. Tinh sạch và xác định thành phần của enzyme protease bằng sắc ký lọc gel (4 tiết) 1. Ngun tắc Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hỗn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngồi các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thơi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. 2. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ 2.1. Dụng cu và thiết bị Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ. Phễu đổ gel Bình hút chân khơng Flow Adaptor 1,5 cm. Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm; thể tích: 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2) 2 x 3,14 (π) = 30 x (1,5/2) 2 x 3,14). Bình đựng dung dịch đệm Ong nghiệm: 50 cái. Vòi hút chân khơng để khử bọt khí cho các dung dịch 2.2. Hóa chất Gel “Bio-Gel P-100”, hãng Bio-Rad có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm; khả năng ngậm nước: 12 ml/1 g gel khơ; phạm vi phân tách: 5.000-100.000 daltons. Đệm phosphate 0,1M; pH 7.0: khử bọt khí trước khi dùng 3. Các bước tiến hành 3.1. Chuẩn bị gel Cân 5 g gel “Bio-Gel P-100” khơ (chính xác cần dùng 4,4 g nhưng vì thể tích gel sẽ bị mất trong suốt q trình thao tác nên cần cân dư), cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH 7.0 đựng trong cốc . Dùng dung dịch đệm phosphate pH 7.0 nhiều gấp 2 Trang 10 [...]... Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch tính bằng đơn vị ĐVHT/ ml dung dịch enzyme sau tinh sạch Trang 11 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein C Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel HTenzyme 2 Hiệu suất về hoạt tính enzyme = HTenzyme1 x100 Trong đó: HTenzyme1: Hoạt tính enzyme protease trước tinh sạch (ĐVHT/ml dung dịch enzyme trước... sạch) HTenzyme2: Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch (ĐVHT/ml dung dịch enzyme sau tinh sạch) HTenzyme2 Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch (mg/ml) = HLproteinsautinhsach Hoattinhriengenzyme2 Độ tinh sạch của enzyme protease sau sắc ký = Hoattinhriengenzyme1 Trong đó: Hoattinhriengenzyme1: Hoạt tính riêng của enzyme protease trước tinh sạch Hoattinhriengenzyme2: Hoạt tính riêng của enzyme. .. định hàm lượng protein và hoạt tính của enzyme protease sau tinh sạch (4 tiết) Thu các fraction chứa dịch enzyme protease đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel, tiến hành xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Amano, pH 7.0 như Mục B Bài 1 và hàm lượng protein theo phương pháp Lowry như Mục A Bài 1 B.1 Hàm lượng protein sau tinh sạch tính bằng đơn vị mg protein/ ml dung dịch enzyme sau tinh.. .Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 = 106 ml dung dịch đệm Đối với các gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 giờ ở 20oC để hydrate... Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thốt của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 đến 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel (packed) Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor... đầy gel, khóa đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm khơng nên... phải sạch (khơng bị nhiễm bẩn và khơng có các hạt rắn); hòa tan hồn tồn trong dung dịch đệm Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột Nếu vì tính chất của mẫu mà khơng thể đem lọc được thì nên ly tâm mẫu 3.3 Thu và xác định mẫu tách được Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng detector trong hệ sắc ký và được thể hiện độ hấp thụ... trước tinh sạch Hoattinhriengenzyme2: Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Amano (2002) Protease N “Amano” – Assay method for Protease activity (Amano method, pH 7.0) 2 Bio-Rad (2000) Bio-Gel® P Polyacrylamide Gel- Instrution Manual 3 Bollag, D.M., Rozycki, M.D., Edelstein, S.J (1996) Protein Methods A John Wiley & Sons, Inc, Publication 4 Boyer, R.F (1993) Modern experimental... trình hydrate xảy ra hồn tồn, gạn lớp nổi trên bề mặt Chuyển dung dịch vào một bình hút chân khơng có gắn với vòi hút chân khơng Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình Khơng dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư gel Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106ml) và lắc nhe Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định Gạn hoặc loại... Methods A John Wiley & Sons, Inc, Publication 4 Boyer, R.F (1993) Modern experimental Biochemistry The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc 5 Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chín (2000) Thực tập lớn Sinh hóa Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM 6 Nguyễn Tiến Thắng (2003) Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm Sinh học Viện Sinh học Nhiệt đới Trang 12 . V CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI Tài liệu hướng dẫn thực tập CÔNG NGHỆ ENZYME VÀ PROTEIN ( Dùng cho học viên cao học) Phụ trách thực tập: CN thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau sẽ chứa hàm lượng amino acid này như nhau. Trang 6 Thực tập môn: Công nghệ enzyme và protein