Đang tải... (xem toàn văn)
ứng dụng kỹ thuật RT-PCR xác định
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM DUY LÃM Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM DUY LÃM Th.S. NGƠ XN TUYẾN Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 iii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình dạy sỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian em học tại trường. Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Hảo, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giải đáp những vấn đề khó khăn và tạo điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Em xin cảm ơn Anh Ngô Xuân Tuyến, chò Trì Thanh Thảo, anh Cao Thành Trung, anh Chu Quang Trọng đã nhiệt tình hướng dẫn, trợ giúp em về nguyên vật liệu, dụng cụ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài này. Em xin cảm ơn anh chò làm việc tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dòch Bệnh Thuỷ Sản Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, phòng lab DNA TRung Tâm Chẩn Đoán YKhoa Hoà Hảo, các anh chò ở Trại Thực Nghiệm Thủ Đức, đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này. Bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, bản khoá luận này không tránh khỏi những khiếm khuyết nhất đònh, rất mong sự giúp đỡ chỉ bảo cũng như các ý kiến đóng góp của quý thầy cô, anh chò và các bạn sinh viên. Sau cùng, em xin cảm ơn gia đình cùng bè bạn đã quan tâm, giúp đỡ, động viên em hoàn thành tốt đề tài. TpHCM, tháng 8 năm 2005 Sinh viên Phạm Duy Lãm iv TÓM TẮT Tôm càng xanh là một trong những đối tƣợng nuôi quan trọng của ngành nuôi trồng thủy sản. Ở Châu Á tôm càng xanh đƣợc mở rộng và tăng cƣờng nuôi với qui mô công nghiệp ở một số nƣớc nhƣ Ấn Độ, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan, các nƣớc này chiếm sản lƣợng lớn tôm càng xanh của cả thế giới. Sự mở rộng và tăng cƣờng nuôi tôm càng xanh đã làm phát sinh nhiều bệnh mới. Một trong những bệnh mới đƣợc ghi nhận gần đây xuất hiện trong những bể ƣơng tôm càng xanh gây thiệt hại cho ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở Ấn Độ, sau đó xuất hiện ở Đài Loan và 5 tỉnh thuộc Trung Quốc. Bệnh này có biểu hiện hơi trắng ở đuôi nên đƣợc gọi là “bệnh trắng đuôi ”. Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV). Hiện nay, trong các bể ƣơng tôm càng xanh ở Việt Nam xuất hiện dấu hiệu lâm sàng hơi trắng ở đuôi, các bể này có tỷ lệ chết rất cao. Để xác định nguyên nhân gây chết trong các bể ƣơng có phải là do MrNV và XSV gây ra hay không. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm qui trình Single - Step PCR của Widada và Sahul Hameed để xác định có hay không sự hiện diện MrNV và XSV trong mẫu bệnh nghi ngờ là bệnh trắng đuôi. Những kết quả thử nghiệm qui trình Single - Step PCR mà chúng tôi đạt đƣợc có kết quả nhƣ sau: Xác định đƣợc sự hiện diện đồng thời MrNV và XSV trong mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ bằng qui trình Single - Step RT - PCR Khảo sát đƣợc hai qui trình tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation Kit và Trizol trên mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi Ấn Độ bằng qui trình Single - StepRT - PCR. Khảo sát đƣợc nồng độ mồi của hai virus cho phản ứng Single - Step RT- PCR là 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV. Khảo sát đƣợc nhiệt độ lai tối ƣu của hai virus cho phản ứng Single - Step PCR là 550C. Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tôm càng xanh thu từ thực địa, kết quả phát hiện đƣợc 6 mẫu tôm mẹ, 1 mẫu tôm postlarvae có sự hiện diện đồng thời của MrNV và XSV trong mẫu tôm bệnh trắng đuôi. v ABSTRACT Freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) plays an economically important role in aquaculture. However, The recent report of new disease in freshwater prawn hatcheries, this disease is responsible for mortalities in hatchery - reared Freshwater Prawn which losses aquaculture industry in India. The disease was reported in Guadeloupe and Martinique (India) subsequently in the five provinces of China. The clinical sign of disease is whitish appearance of the tail and has given rise to the name “White tail disease”. Lately, scientists have been detected a nodavirus - like particles from freshwater prawn suffering from White tail disease (WTD), named Macrobrachium rosenbergii nodavirus. Subsequently a second virus - like particle, named XSV. XSV has always been found associated with the MrNV. Untill, The relationships between these two viruses remain unknown. Although White tail disease (WTD) caused by Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and virus-like particle (XSV) which hasn’t reported in Viet Nam. Therefore In this study, process of Single - Step RT - PCR of Widada and Sahul Hameed. et al was use to identify whether this disease existed in Viet Nam. To optimal of Single - Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed. et al for the laboratory, positive control from India was used. We experimented successful process of Single-Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed. The suitable condition for a Single-Step RT-PCR RT-PCR reaction is 1,5 mM Mg2+, 20 mol primer and 550C annealing temperature. Based on this method, 50 samples of freshwater prawn collected in the Thu Duc and other provinces in Mekong Delta were extracted RNA and amplified with two couples of primer MrNV-RNA2-F, MrNV-RNA2-R for MrNV and XSV-F, XSV-R for XSV. Seven samples were confirmed to be infected by MrNV and XSV. In short, MrNV and XSV have been detected in Viet Nam. It is essential to carry out further studies to identify the outbreak conditions and to suggest the treatment methods so that the freshwater prawn farming can be developed. vi Mục lục Lời cảm ơn . iii Abstract iv Tóm tắt . v Mục lục vi Danh mục các hình và các bảng . ix Danh mục các từ viết tắt x PHẦN 1. LỜI MỞ ĐẦU 1 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TÔM CÀNG XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 3 2.1.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới . 3 2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam 3 2.2. MỘT SỐ BỆNH TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH . 5 2.2.1. Bệnh hoại tử cơ . 5 2.2.2. Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng 5 2.2.3. Bệnh hoại tử do vi khuẩn 5 2.2.4. Bệnh phát sáng 5 2.2.5. Bệnh lột xác dính vỏ . 6 2.2.6. Bệnh do Protozoa 6 2.2.7. Bệnh virus . 6 2.2.8. Bệnh trắng đuôi 6 2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TRẮNG ĐUÔI DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG 10 2.3.1. Phƣơng pháp mô học 10 2.3.2. Phƣơng pháp lai Dot-lot 10 2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) 11 2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) . 12 2.3.5. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) . 12 2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) . 15 vii PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 18 3.2. VẬT LIỆU . 18 3.2.1. Mẫu tôm 18 3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình . 18 3.2.3. Hạt Bead RT - PCR: Ready - To - Go (Chế phẩm sử dụng ngay) 19 3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit . 19 3.2.5. Thang DNA X174 RF Hae III (Boehringer Mannheim) 20 3.2.6. Hoá chất khác 20 3.2.7. Dụng cụ và thiết bị 21 3.3. PHƢƠNG PHÁP . 21 3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus 21 3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol 21 3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio-Rad) 22 3.3.2. Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV 22 3.3.3. Phƣơng pháp điện di nucleic acid trên gel agarose 23 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 24 3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT-PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tôm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ 24 3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT-PCR . 24 3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio-Rad) . 24 3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi 25 3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi 25 3.4.3. Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa . 25 viii PHẦN 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ. 26 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR . 27 4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết. 27 4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi 30 4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi 30 4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH KHẢO SÁT ĐƢỢC KIỂM TRA MỘT SỐ MẪU TÔM CÀNG XANH THU THỰC ĐỊA . 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận . 36 5.2. Tồn tại . 36 5.3. Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 38 Tiếng nƣớc ngoài 39 ix Danh mục hình và các bảng Hình 2.1: Biểu hiện bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh . 8 Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirus . 8 Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV 11 Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR 17 Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tôm càng xanh nhiễm MrNV, XSV 26 Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách bằng bộ Kit và Trizol . 28 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau . 29 Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV 30 Hình 4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tôm càng xanh . 33 Hình 4.6: Kết quả điện di mẫu tôm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức . 34 Biểu đồ 2.1: Số lƣợng trại giống và sản lƣợng tôm càng xanh ở ĐBSCL từ 1999 - 2003. .4 Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng RT- PCR . 18 Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III . 20 Bảng 3.3: Thành phần hai Mix sử dụng Single - Step RT - PCR 22 Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi 25 Bảng 3.5: Các loại mẫu tôm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau . 25 Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol 28 Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ 31 Bảng 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT - PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh 35 x Danh mục các từ viết tắt DNA: Deoxyribonucleic acid ss-DNA: Single strand - Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid mRNA: Messenger ribonucleic acid cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid Bp: Base pair (cặp base) dATP: 2’-deoxyadenosine-5’-triophosphate dCTP: 2’-deoxycytosine-5’-triophosphate dGTP: 2’-deoxyguanine-5’-triophosphate dTTP: 2’-deoxythymine-5’-triophosphate UV: Ultra Violet- tia cực tím TE: Tris-EDTA. DIG: Digoxigenin DEPC: Diethyl Prycacbonat ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long FAO: Food and Agrculture Organization NoV: Nodamura virus BoV: Boolaara virus AhNNV: Atlantic halibut nervous necrosis virus GGNNV: Greasy grouper nerous necrosis virus SJNNV: Striped jack nervous necrosis virus PaV: Pariacoto virus MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus XSV: Extra small virus PCR: Polymerase Chain Reaction RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Reaction RFLP: Restriction fragment lenght polymorphism S - ELISA: A sandwich enzyme linked immunosorbent assay Tm: Nhiệt độ lai của mồi [...]... tôi tiến hành đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ” với: Mục đích Xác định sự hiện diện hai loại virus MrNV và XSV trên tôm càng xanh bằng kỹ thuật RT-PCR Nội dung nghiên cứu Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu chứng dƣơng đƣợc cung cấp... chu kỳ phản ứng PCR Trong thực tế sử dụng, số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR không vƣợt quá 40 chu kỳ do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp thƣờng có khuynh hƣớng kết hợp với nhau, kết quả là hiệu quả khuếch đại càng về sau càng giảm vì những nguyên nhân sau: Sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng Sự xuất... sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó kết quả khuếch đại giảm hẳn nên số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lƣợng bản mẫu ban đầu 2.3.5.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 14 DNA mẫu: Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Ngoài ra phƣơng pháp PCR... mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế Nồng độ Mg2+ quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhƣng lại hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng Quá thừa Mg2+ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa mồi và khuôn, kết quả là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu Nồng độ tối ƣu Mg2+ phải đƣợc xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử... nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm mồi xuôi (sens primer), mồi ngƣợc (antisnes primer) 2.3.5.2 Phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: Bƣớc 1: giai đoạn biến tính (denaturation), trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết... 681 bp AY222840 500 bp 20 3.2.3 Hạt bead RT - PCR: READY - TO - GO (Chế phẩm sử dụng ngay) Sản phẩm này do công ty Amersham pharmacia biotech, Mỹ sản xuất Đây là chế phẩm có sẵn các thành phần để thực hiện phản ứng RT - PCR, khi sử dụng ta chỉ cần thêm bản mẫu và mồi sử dụng Mỗi loại hạt Bead đƣợc thiết kế cho một phản ứng với thể tích cuối 50 µl Thành phần của hạt bead gồm: 2 đơn vị Taq DNA polymerase... vị trí các đoạn DNA trên gel Trong kỹ thuật điện di DNA, ngƣời ta thƣờng sử dụng các thang chuẩn với mục đích so sánh và ƣớc lƣợng kích thƣớc các phân tử điện di Các thang chuẩn này là hỗn hợp gồm nhiều đoạn DNA (đối với thang DNA) Dựa vào kích thƣớc đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thƣớc các phân tử mục tiêu... trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tôm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ Trong thử nghiệm này chúng tôi đã sử dụng đúng qui trình của tác giả đƣa ra Thử nghiệm qui trình trên 1 mẫu tôm thịt đã xác định nhiễm MrNV và XSV cung cấp từ Ấn Độ, 1 mẫu tôm không bị bệnh đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp mô học, và 1 mẫu chứng âm (RNA bản mẫu đƣợc thay bằng H20 - DEPC) Các mẫu đƣợc tách... mẫu tôm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae có triệu chứng lâm sàng bệnh trắng đuôi Các mẫu tôm càng xanh đƣợc bảo quản trong tủ âm - 700C 3.2.2 Mồi sử dụng cho qui trình Mồi đƣợc thiết kế bởi tác giả Yoganandhan và cộng sự (2005) dựa trên trình tự của RNA virus (MrNV: Ac No AY222840; XSV Ac No) Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR Virus MrNV XSV Primer Trình tự MrNV-RNA2-F... ra khỏi màng lai Tiếp đó thêm vào phản ứng kháng thể kháng DIG (anti digoxygenine antibody) có gắn enzyme alkaline phosphatase, ở quá trình này nếu có sự hiện diện của mẫu dò thì kháng thể sẽ kết hợp với mẫu dò Cuối cùng loại bỏ phần kháng thể không phản ứng và thêm cơ chất của enzyme alkaline phosphatase để thực hiện phản ứng tạo màu ngay trên màng lai Phản ứng dƣơng tính (tạo màu) chỉ xảy ra khi . NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL. CƠNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL
