Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào cây thuốc lá Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào cây thuốc lá Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào cây thuốc lá luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Dung NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍCH LŨY ASEN VÀO CÂY THUỐC LÁ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Dung NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍCH LŨY ASEN VÀO CÂY THUỐC LÁ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hướng dẫn: TS Lê Thị Bích Thủy PGS TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Quang Huy- trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, TS Lê Thị Bích Thủy – phịng Di truyền tế bào thực vật – Viện Cơng nghệ Sinh học, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn tới CN Hồ Thị Hƣơng tập thể cán phòng Di truyền tế bào thực vật – Viện Cơng nghệ Sinh học giúp đỡ tơi nhiệt tình tạo điều kiện tốt trình học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy giáo, cô giáo dạy khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội dạy bảo giúp đỡ thời gian học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đinh, người thân bạn bè động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Học viên Nguyễn Thị Thu Dung MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG 10 DANH MỤC HÌNH 11 MỞ ĐẦU 12 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15 1.1 Tình hình nghiên cứu nhiễm kim loại nặng nƣớc 15 1.2 Tình hình nhiễm Asen 18 1.2.1 Sơ lược Asen 18 1.2.2 Tình hình nhiễm Asen Việt Nam 19 1.2.3 Ảnh hưởng Asen đến sức khỏe người 19 1.2.4 Xử lý ô nhiễm Asen đất 20 1.2.4.1 Phương pháp xử lý truyền thống 20 1.2.4.2 Phương pháp sinh học 20 1.3 Cơ sở khoa học chuyển gen thực vật 22 1.3.1 Khái niệm chuyển gen 22 1.3.2 Các phương pháp chuyển gen thực vật 22 1.3.2.1 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp .22 1.3.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp 22 1.3.2.3 Các hệ thống vector chuyển gen thực vật .25 1.3.2.4 Giới thiệu vector pCAMBIA1301 .28 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1 Chủng vi khuẩn sử dụng thí nghiệm 31 2.1.2 Vật liệu sinh học phân tử 31 2.1.3 Vật liệu thực vật 31 2.1.4 Hóa chất 32 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 32 2.1.6 Máy móc thiết bị 32 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Thiết kế vector pCambia1301 mang gen arsC 33 2.2.1.1 Nuôi cấy lưu giữ chủng 33 2.2.1.2 Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ tế bào vi khuẩn E.coli DH5α 33 2.2.1.3 Phương pháp nhân gen đích kỹ thuật PCR .34 3.2.1.4 Phương pháp điện di gel agarose 35 2.2.1.5 Phương pháp tinh từ gel agarose kit hãng Fermentas (Mỹ) 36 2.2.1.6 Phương pháp xử lý với enzyme giới hạn 37 2.2.1.7 Phản ứng ghép nối gen arsC với vector pCAMBIA1301 37 2.2.2 Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt 38 2.2.2.1 Kiểm tra chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp PCR .39 2.2.2.2 Kiểm tra chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp cắt enzyme giới hạn 39 2.2.3 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A tumefaciens xung điện 40 2.2.4 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua A tumefaciens 40 2.2.4.1 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens 40 2.2.4.2 Biến nạp .41 2.2.4.3 Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy 41 2.2.4.4 Sàng lọc chồi thuốc chuyển gen môi trường có kháng sinh chọn lọc 41 2.2.4.5 Tái sinh hoàn chỉnh .41 2.2.4.6 Ra môi trường đất : trấu : cát 42 2.2.5 Phương pháp phân tích chuyển gen 42 2.2.5.1 Phương pháp kiểm tra chuyển gen PCR .42 2.2.5.2 Lai Southern blot 42 CHƢƠNG KẾT QUẢ 47 3.1 Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC 47 3.1.1 Sơ đồ vector pCAMBIA1301-arsC dự định thiết kế 47 3.1.2 Gắn gen arsC vào vector biểu pCAMBIA 1301 47 3.1.3 Biến nạp pCAMBIA1301-arsC vào tế bào khả biến E coli DH5α phương pháp sốc nhiệt 49 3.1.4 Kết kiểm tra vector pCAMBIA1301 – arsC 50 3.1.4.1 Kết kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC phản ứng PCR – colony 50 3.1.4.2 Kết kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC enzyme giới hạn NcoI Eco72I 51 3.2 Biến nạp vector pCAMBIA1301 – arsC vào vi khuẩn A tumefaciens 53 3.3 Tạo thuốc chuyển gen arsC 54 3.4 Kiểm tra thuốc chuyển gen đƣợc trồng tự nhiên 64 3.4.1 Kiểm tra thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR 64 3.4.2 Kết kiểm tra thuốc chuyển gen Southern Blot 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 Kết luận 68 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens As Asen BAP Benzylaminopurine Bp Base pair CaMV35S Cauliflower Mosaic Virus 35S Cefo Cefotaxime DNA Deoxyribonucleic Acid dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate EDTA Ethylene Diamine tetra- acetate Acid Gus Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase Kan Kanamycin Kb Kilo base KLN Kim loại nặng LB Môi trường theo Luria Bertani MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) NAA Naphthalene Acetic Acid OD Optical density hay mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid SDS Sodium dodecyl sulfate SSC Saline sodium sitrate TAE Tris bazơ – Axit acetic – EDTA Taq Thermus aquaticus T-DNA Transferred-DNA Ti-plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u UV Ultraviolet (light) Vir Virulence region = vùng gây độc DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi đặc hiệu nhân gen arsC 31 Bảng 2.2 Phản ứng cắt pBT-arsC NcoI Eco72I 37 Bảng 2.3 Phản ứng cắt pCAMBIA1301 NcoI Eco72I .37 Bảng 2.4 Phản ứng ghép nối gen arsC vào vector pCAMBIA1301 .38 Bảng 3.1 Khả hình thành phát triển thuốc chuyển cấu trúc vector pCAMBIA1301 tái tổ hợp mang gen đích 61 10 vị trí gắn gen arsC genome dịng thuốc có khả vị trí Trong đó, đối chứng âm dòng thuốc 2, 3, không cho vạch băng Chứng tỏ trình chuyển gen arsC vào thuốc 1, 4, (tương ứng với dòng thuốc số 2, 13, 17) thành công 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Biến nạp thành công chủng E coli DH5α chủng A tumefaciens C58 mang vector pCAMBIA1301-arsC - Tạo 24 dòng thuốc chuyển gen mang gen arsC sống sót mơi trường chứa kháng sinh chọn lọc Cefotaxime Hygromycin in vitro tự nhiên - Đã kiểm tra có mặt gen arsC thuốc trồng tự nhiên kỹ thuật PCR chứng minh thành công lai Southern Blot Kiến nghị - Cần tiếp tục đánh giá khả tích lũy asen đánh giá tính ổn định di truyền hệ sau dòng thuốc mang gen arsC thu - Mở rộng triển khai ứng dụng chủng A tumefaciens C58 mang cấu trúc vector pCAMBIA1301-arsC để nghiên cứu chuyển gen trồng khác nhằm mục đích tích lũy Asen cải tạo mơi trường bị nhiễm Asen - Dựa kết nghiên cứu đề tài điều kiện vùng ô nhiễm cụ thể tiếp tục tạo trồng chuyển gen khác nhằm mục đích cải tạo mơi trường 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Văn Ái, Mai Trọng Nhuận, Nguyễn Khắc Vinh (2005), Một số đặc điểm phân bố Arsen tự nhiên vấn đề ô nhiễm arsen môi trường nước ta, Báo cáo Cục địa chất khoáng sản Việt Nam Đặng Thị An (2005), Nghiên cứu khả chống chịu kim loại nặng số loài thực vật, Đề tài nghiên cứu cấp Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật 2005-2006 Bùi Thị Kim Anh (2011), Nghiên cứu sử dụng thực vật (dương xỉ) để xử lý ô nhiễm Asen đất vùng khai thác khống sản, Luận án Tiến sĩ Mơi trường đất nước, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Bernard R Glick, Jack J Pasternak (2009), Công nghệ sinh học phân tử Nguyên lý ứng dụng ADN tái tổ hợp, Nxb Khoa học kĩ thuật Nguyễn Văn Bình, Nguyễn Đức Quý, Vũ Minh Quân, Lê Quang Thành (2000), “Sự phân bố phát tán KLN đất nước khu vực mỏ thiếc Sơn Dương”, Tạp chí khoa học trái đất, 22(2), tr 134-139 Nguyễn Tiến Cư, Trần Văn Tựa, Đặng Đình Kim, Đỗ Tuấn Anh, Lê Thu Thủy (2007), “Nghiên cứu khả xử lý chì (Pb) đất ô nhiễm cỏ Vetiver zizannioides”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường - Nghiên cứu ứng dụng - Kỉ niệm năm thành lập Viện công nghệ môi trường, Viện KH &CN Việt Nam, Hà Nội, 29-30/10/2007, tr 308-312 Phạm Văn Khang, Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Xuân Huân (2004), “Một số nghiên cứu kim loại nặng giới”, Tạp chí khoa học đất, 20, tr 157161 Lê Văn Khoa, Nguyễn Xuân Cự, Trần Thiện Cường, Nguyễn Đình Đáp (2010), Giáo trình nhiễm mơi trường đất biện pháp xử lý, Nhà xuất giáo dục Việt Nam 69 Đặng Đình Kim (2010), Báo cáo tổng kết kết khoa học công nghệ đề tài nghiên cứu sử dụng thực vật để cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại nặng vùng khai thác khống sản, Chương trình KHNC cấp Nhà Nước KC08, Bộ Khoa học Cơng nghệ 10 Lê Thanh Hịa (2003),Sinh học phân tử virus Gumboro nghiên cứu ứng dụng Việt Nam, Nxb nông nghiệp, Hà Nội 11 Diệp Thị Mỹ Hạnh, E GarnierZarli (2007), “Lantana Canmara L., thực vật có khả hấp thu Pb đất để giải nhiễm”, Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ, 10(1) 12 Đồng Thị Minh Hậu, Hồng Thị Thanh Thủy, Đào Phú Quốc (2008), “Nghiên cứu lựa chọn số thực vật có khả hấp thu kim loại nặng (Cr, Cu, Zn) bùn nạo vét kênh Tân hóa- Lị gốm”, Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ, 11(4) 13 Lê Ðình Lương, Quyền Ðình Thi (2003), Kĩ thuật di truyền ứng dụng, Nxb đại học quốc gia Hà Nội 14 Nguyễn Quang Thạch (2005), Giáo trình Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, Nxb Nông nghiệp 15 Khuất Hữu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử kĩ thuật gen, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội 16 Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội 17 Nguyễn Ðức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội 18 Bùi Phương Thảo, Hồng Thu Hằng, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013), “ Thiết kế vector chuyển gen Lsi2 góp phần nâng cao khả vận chuyển tích lũy asen thực vật”, Hội nghị khoa học Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013, tr 1064-1069 19 Vũ Quyết Thắng (1998), “Hàm lượng kim loại nặng đất rau muống Thanh Trì”, Tạp chí hoạt động khoa học, tr 31-32 70 20 Hoàng Thị Thanh Thủy, Từ Thị Cẩm Loan, Nguyễn Như Hà Vy (2007), “Nghiên cứu địa hóa mơi trường số kim loại nặng trầm tích sơng rạch Tp Hồ Chí Minh”, Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ, 10(1), tr 47-54 21 Nguyễn Thu Trang (2013), Thiết kế vector chuyển gen GSHI nhằm nâng cao khả tích lũy asen thực vật, Luận văn Thạc sĩ Công nghệ Sinh học, Đại học Thái Nguyên 22 Lâm Minh Triết, Lê Huy Bá (2006), Sinh thái môi trường học bản, Nxb Đại học Quốc gia TPHCM 23 Nguyễn Đình Tuấn(2005), “Chất lượng nước kênh rạch Tp Hồ Chí Minh Hiện trạng thách thức”, Báo cáo hội thảo “Phát triển bền vững thành phố xanh lưu vực sông”, 5/2005, tr - 24 Trần Văn Tựa, Nguyễn Đức Thọ, Đỗ Tuấn Anh, Nguyễn Trung Kiên Đặng Đình Kim (2007), “Sử dụng sậy cỏ vetiver xử lý nước thải chứa Cr Ni theo phương pháp vùng rễ”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường - Nghiên cứu ứng dụng-Kỷ niệm năm thành lập Viện công nghệ môi trường, Viện KH &CN Việt Nam, Hà Nội, tr.29 25 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia giới hạn cho phép kim loại nặng đất Việt Nam, QCVN 03:2008/BTNMT 26 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2008), “Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi”, Tạp chí cơng nghệ Sinh học, 6(4A), tr 679-687 71 Tài liệu tiếng Anh 27 Alloway B and Ayres D (1993), Chemical Principles of Environmental pollution, Blackie Academy and Profesional 28 Agency for toxic substances and disease registry (ATSDR) (1999), Toxicological profile for Arsenic, U.S Department of Heath and human services: Atlanta, GA 29 Ashraf M., Foolad M.R (2009), “Roles of glycine betaine and proline in improving plants abiotic stress resistance”, Environmental and Experimental Botany, (59), pp 206 – 216 30 Barceló J and Poschenrieder C (2003), “Phytoremediation: principles and perspectives”, Contributions to Science, institute d’Edtudis Catalans, Bacelona, pp 333 – 344 31 Cangelosi G.A., Ankenbauer R.G., and Nester E.W (1990), “Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein”, Proc Natl Acad Sci USA, 87, pp 6708-6712 32 Capuana M (2011), “Heavy metals and woody plants-biotechnologies for phytoremediation”, iForest, 4, pp 7-15 33 Chaney R (1997), “Phytoremediation of soil metals”, Current Opinion in Biotechnology, 8, pp 279–284 34 Cezary K and Bal R.S (2001), “Fractionation and Mobility of Cooper, Lead, and Zinc in Soil Profiles in the Vicinity of a Cooper”, Smelter J Environ Qual., Vol 30, March-April 2001, pp 485-491 35 Chen H.M., Zheng C.R., Tu C and Shen Z.G (2000), “Chemical methods and phytoremediation of soils contaminated with heavy metals”,Chemosphere, Vol 41, No 1-2, pp 229-234 36 Chiristina L., Finn O., et al (2002), “Remediation of mixed contamination Soil and tar/PAH contaminated Soil” 37 Chopra V.L., Anwan N (1990), Genetic Engineering and Biotechnology, Oxford and IBH Publishing CO.PVT, Ltd UK 72 38 Cohen S.N., Chang A.C., Hersu L (1972), “Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA”,Proc Natl Acad Sci USA, 69, pp 2110-2114 39 DhankherO.P., Li Y., Rosen B.P., Shi J., Salt D., Senecoff J.F., Sashti N.A., Meagher R.B (2002), “Engineering tolerance and hyperaccummulation of Arsenic in plants by combining Arsenate reductase and g-glutamylcysteine synthase expression”,Nature Biotechnology, 20, pp 1140-1145 40 Dietz A.C and Schnoor J.L (2001), “Advances in Phytoremediation Environmental Health Prospectives”, Supplement 1, 109, pp 163-169 41 Ellis D.R., Gumaelius L., Indriolo E., Pickering I.J., Bank J.A., Salt D.E (2006), “A novel arsenate reductase from the Arsenic hyperaccummulating fern Pterisvittata”, Plant Physol, 141, pp 1544-1554 42 Fallon K.M., Phillips R (1989), “Responses to water stress in adapted and unadapted carrot cell suspension cultures”, Journal of Experimental Botany, 40, pp 681-687 43 Gelvin S.B (2000), “Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration”, Annu Rev.Plant Physiol Plant Mol Biol, 51, pp 223–256 44 Ghosh M., Singh S.P (2005), “A review on phytoremediation of heavy metals and utilization of íts by products”, Applied ecology and environmental research, 3(1), pp 1-18 45 Glick B.R., Jackj P (1994), Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington D.C USA 46 Gustavo A., Cabrera J (1998), “The Agrobacteriumtumefaciens gene transfer to plant cell”, Molecular Microbiology, (26), pp 1-14 47 Ha S.B., Smith A.P., Howden R Dietrich W.M., Bugg S., O’Connell M.J., Goldsbrough P.B., Cobbett C.S (1999), “Phytochelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast Schzosaccharomycespombe”, Plant Cell, 11, pp 1153-1163 73 48 Hansen G., Chilton M.D (1999), “Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe”, Curr Top Microbiol.Immunol, 240, pp 22–57 49 Hirschi K.D., Zhent R.G., Cunningham K.W., Reat P.A., Fink G.R (1996), “CAX1, an HI/Ca2+ antiporter from Arabidopsis”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America, 93, pp 87828786 50 Ma J.Q.,Komar M., Zhang T.W., Cai Y., Kenelley E.D (2001), “A fern that hyperaccumulaters Arsenic”, Nature, pp 409-509 51 Mello D.J (2003), Food Safety – Contaminants and toxins, CABI Publishing 52 Murashige T., Skoog F (1962),“A revised medium for rapid grow and bioassayswith tobaco cultures”,Physiol Plant, 15,pp 473 – 497 53 Norman Terry, Gary Banuelos (1999), Phytoremediation of contaminated soils and water, CRC Press/Lewis Publishers, Boca Raton, FL, pp 85-107 54 Prasad M.N.V., Freitas H.M.O (2003), “Metal hyperaccumulation in plant – biodiversity prospecting for phytoremendiation technology”,ElectronJ Biotechnol, 6(3), pp 285-321 55 Raskin I., Smith R.D., Salt D.E (1997), “Phytoremediation of metals: Using plants to remove pollutants from the environment”, Curr.Opin Biotechnol, 8(2), pp.221-226 56 Sabarrinath S., Shan W., Lena Q.M., Bala R (2009), “Expression of a Pterisvittataglutaredoxin PvGRX5 in transgenic Arabidopsis thaliana increases plant arsenic tolerance and decreases arsenic accumulation in the leaves”, Plant, Cell andEnvironment, 32, pp 851–858 57 Saghai M.A., Biyashev R.M., Yang G.P., Zhang Q., Allard R.W (1984), “Extraodirarily polymorphic microsetellite DNA in barley: Species diversity, chromosome location, and population dynamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 91, pp 5466-5470 58 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol.3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 74 59 Saxena P.K et al (1999), “Phytomerediation of heavy metal contaminated and polluted soils”, In: MNV prasad & J Hagemayr (eds) Heavy metal stress on plants, From molecules to ecosystems, Springer Verlag, Berlin, pp 305-329 60 Shiralipour A., Ma L., Cao X (2002), “Effects of compost on Arsenic leachability in soils and Arsenic uptake by a fern”, Report #02-04, University of Florida, Gainesville, FL 61 Smith E.F., Townsend C.O (1907), "A Plant-Tumor of Bacterial Origin", Science, 25(643), 671–673 62 Sun H.H., Sun A.C., Hyeon Y, Kyung-Suk C (2011), “Screening of Cucumissativus as a new arsenic-accumulating plant and its arsenic accumulation in hydroponic culture”, Environ Geochem Health, 33, pp 143– 149 63 Topping J.F (1998), Tobacco transformation, In: Foster GD, Taylor SC.Vol.81: Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance,Humana Press Inc,Totowa, NJ, pp 365-385 64 US-EPA (2002), Arsenic treatment technologies for soil, waste and water, Solid Waste and Emergency Response (5102G), EPA-542-R-02-004 September 2002, 132 pages 65 Varsha M., Nidhi M., Anurag M (2010), “Heavy metals in plants: phytoremediation: Plants used to remediate heavy metal pollution”, Agric Biol J N Am, 1(1), pp 40-46 66 Yadav R., Arora P., Kumar S (2010), “Perspectives for genetic engineering of poplars for enhanced phytoremediation abilities”, Ecotoxicology, 19, pp 1574–1588 75 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Cấu trúc vector pCAMBIA1301 Sơ dồ cấu trúc pCAMBIA1301 76 Phụ lục 2: Quy trình chuyển gen quan tâm vào thuốc cải tiến (Toopping, 1998) [63] Chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa gen quan tâm bảo quản glycerol -80oC nuôi cấy môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc, ni tối 28oC ngày Cây in vitro phát triển 3-4 thật, chọn bánh tẻ để tiến hành biến nạp Các mảnh cắt với kích thước khoảng cm2 mơi trường ½ MS lỏng đặt lên môi trường cảm ứng CT1 (MS + 1mg/l BAP) Một ngày trước biến nạp, chọn khuẩn lạc trịn đều, đứng độc lập ni lỏng 10 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, ni qua đêm (16 giờ) Sau ni phục hồi thêm 50 ml LB không bổ sung kháng sinh chọn lọc Biến nạp: - Khuẩn sau ni đem đo OD600= 0,6-1 sử dụng để biến nạp - Đem ly tâm lạnh thu cặn khuẩn, cặn khuẩn hòa tan với dung dịch ½ MS để tạo dịch huyển phù vi khuẩn - Các mảnh sau ngày nuôi cấy cảm ứng môi trường CT chuyển sang b́nh tam giác có chứa dung dịch ½ MS lỏng dịch huyền phù vi khuẩn Sau 30 phút chuyển mảnh lên giấy thấm tiệt trùng, thấm khô cấy lên mơi trường CT1 khơng có kháng sinh, đồng nuôi cấy ngày Sau ngày, cấy chuyển mảnh sang mơi trường có bổ sung Cefotaxime 500mg/l Hygromycin 5mg/l (CT2) Sau 2-3 tuần, mảnh bắt đầu cảm ứng tạo mô sẹo chuyển sang mơi trường MS có bổ sung Cefotaxime 500mg/l + Hygromycin 5mg/l (CT2) Sau tuần, mảnh tạo chồi chuyển sang môi trường MS có bổ sung Cefotaxime 400 mg/l + Hygromycin 10 mg/l (CT3) 77 Sau tạo đa chồi, chồi phát triển tốt chuyển sang môi trường tạo rễ MS + NAA 0,1 mg/l có bổ sung Cefotaxime 400 mg/l + Hygromycin 10 mg/l (CT4) 10 Cây rễ nhiều, cao 5-7 cm đua bầu chứa giá thể đất: trấu: cát (1:1:1) 11 Sau tuần, phát triển ổn định, tiến hành kiểm tra sau chuyển gen Phụ lục 3: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Tên môi trường LB đặc LB lỏng Thành phần môi trường Yeast extract g/l; Trypton 10 g/l; NaCl 10 g/l; agar 16 g/l, pH = 7,0 Yeast extract g/l; Trypton 10 g/l; NaCl 10 g/l; pH = 7,0 78 Phụ lục 4: Thành phần môi trƣờng nuôi chọn lọc thuốc chuyển gen [26] Tên môi trường MS Ký hiệu MS Thành phần môi trường Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) Đồng nuôi cấy CT1 MS + mg/l BAP + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 Chọn lọc CT2 chuyển gen lần MS + mg/l BAP + 30 g/l sucrose + g/l agar + 500 mg/l Cefotaxime + mg/l Hygromycin, pH = 5,8 Chọn lọc CT3 chuyển gen lần MS + mg/l BAP + 30 g/l sucrose + g/l agar + 400 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hygromycin, pH = 5,8 Ra rễ tạo CT4 MS + 0,1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose + g/l agar + hoàn chỉnh 400 mg/l Cefotaxime + 10 mg/l Hydromycin, pH = 5,8 79 Phụ lục 5: Trình tự gen arsC đƣợc so sánh với trình tự gen gốc mang mã số X80057.1 GeneBank Accession Description 59375 Max score Total score Query coverage 782 782 100% Evalue 0.0 Maxident 99% >lcl|59375 Length=426 Score = 782 bits (423), Expect = 0.0 Identities = 425/426 (99%), Gaps = 0/426 (0%) Strand=Plus/Plus Query ATGAGCAACATTACCATTTATCACAACCCGGTCTGCGGCACGTCGCGTAATACGCTGGAG 60 ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct ATGAGCAACATTACCATTTATCACAACCCGGCCTGCGGCACGTCGCGTAATACGCTGGAG 60 Query 61 ATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACTCCGCCAACG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 ATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACTCCGCCAACG 120 Query 121 CGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 CGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGT 180 Query 181 AAAAACGTCGAACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 AAAAACGTCGAACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGG 240 Query 241 TTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTCTGATTAATCGCCCGATTGTGGTGACGCCG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 TTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTCTGATTAATCGCCCGATTGTGGTGACGCCG 80 300 Links Query 301 CTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTCTGCCAGATGCGCAA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 CTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTCTGCCAGATGCGCAA 360 Query 361 AAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 361 AAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTG Query 421 AAATAA 426 |||||| Sbjct 421 AAATAA 426 81 420 ... có nghiên cứu tách dòng chuyển gen hấp thụ Asen từ thực vật sống vùng ô nhiễm, điểm đề tài Để đạt mục tiêu đề trên, thực đề tài ? ?Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào thuốc lá? ??... có sẵn khả tích lũy KLN, chúng tơi nghiên cứu quy trình chuyển gen để tạo mang gen tích lũy KLN cho khơng có khả tích lũy KLN Cụ thể nghiên cứu tạo thuốc mang gen arsC để tích lũy Asen 1.3 Cơ... TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Dung NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍCH LŨY ASEN VÀO CÂY THUỐC LÁ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN