Đang tải... (xem toàn văn)
khái quát chung về gen silencing và quá trình tạo ra hoa hồng màu xanh
SiRNA - GENE SILENCING GV hướng dẫn : ĐOÀN THỊ HOÀI NAM SV thực hiện : LÊ KHẮC AN_ 10sh MSV : 107261101101 TỔNG QUAN 1 Đặt vấn đề 2 Lịch sử hình thành 3 Định nghĩa 4 Nguồn gốc 5 Các bước tạo phân tử siRNA 6 Cơ chế làm tắt gen bởi siRNA 7 Các lưu y 8 Ứng dụng 9 Hướng phát triển 10 Ứng dụng cụ thể 11 Kết luận 1/ ĐẶT VẤN ĐỀ Như chúng ta đã biết, trong tế bào có nhiều loại RNA khác nhau, mỗi loại đảm nhận một chức năng sinh hoc riêng biệt Một số chức năng quan trọng của RNA: 1. Chức năng vận chuyển thông tin di truyền 2. Chức năng tham gia tổng hợp và vận chuyển Protein 3. Chức năng hoàn thiện các phân tử RNA 4. Ngoài ra RNA còn có các chức năng quan trọng khác 5. Đặc biệt gần đây các nhà sinh học phân tử đã phát hiện ra chức năng điều hoà biểu hiện gene của RNA Sự khám phá ra tế bào có một cơ chế đặc biệt – cơ chế im lặng gen (siRNA – RNA silencing), đã vượt quá mong đợi và mở rộng hiểu biết của chúng ta về cơ chế kiểm soát gene trong cơ thể sinh vật. Hơn nữa, sự khám phá ra siRAN không chỉ cung cấp cho chúng ta một công cụ thí nghiệm mạnh mẽ mới để nghiên cứu chức năng của các gene mà còn nuôi dưỡng những mong đợi của chúng ta về những ứng dụng tương lai của siRNA trong y học, nông nghiệp, . Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng một số trình tự siRNA có thể kích hoạt hệ miễn dịch bẩm sinh và kết quả trong việc tạo ra các cytokine tiền viêm và loại I interferon Đặc biệt là Y học nghiên cứu ứng dụng siRNA để chữa những căn bệnh về tim mạch, ung thư, các bệnh vius: cúm (AH5NI, AH1N1), HIV,… giải quyết tốt các vấn đề nhân loại Kể từ khi khám phá ra RNAi thì việc nghiên cứu cơ chế và ứng dụng của nó ngày càng trở thành một vấn đề lý thú thu hút sự quan tâm của các nhà sinh học 2/ LỊCH SỬ HÌNH THÀNH Nguồn gốc hình thành RNA silencing chính là từ kỹ thuật antisense-RNA (Pestka và các cộng sự, 1984) được đăng trên tạp chí PNAS số 81. Trong nghiên cứu này một cấu trúc plasmid được thiết kế để tổng hợp đoạn RNA bổ sung cho phân tử mRNA beta-galactosidase dưới sự điều khiển của một promoter PL. Khi phân tử RNA chiều ngược (antisense RNA) được hình thành thì các nhà khoa học quan sát được rằng sự tổng hợp protein beta-galactosidase bị ức chế gần như hoàn toàn (98%). Tuy nhiên trong giai đoạn này các nhà khoa học vẫn chưa hình dung được cơ chế nào gây ra sự ức chế các gen trên. Dần dần đến những đầu thập niên 1990, những báo cáo đầu tiên được công bố trên các tạp chí quốc tế (Napoli và các cộng sự, 1990; van der Krol và các cộng sự, 1990). Quan sát đầu tiên hiện tượng này là trên một nghiên cứu của hoa dạ yến thảo (petunia). Các nhà khoa học đã cố gắng tạo màu tím trên cánh hoa petunia bằng cách chuyển gen quy định màu tím Chalcone synthase (CHS) dưới sự điều khiển của một promoter mạnh (promoter 35S). Gen CHS là gen có liên quan đến chu trình hình thành chất anthocyanin trong hoa petunia. Tuy nhiên thay vì hình thành màu tím của cánh hoa như mong đợi thì chúng lại thể hiện các đốm màu khác nhau và thậm chí là màu trắng. Hiện tượng này các nhà khoa học đặt thuật ngữ là "cosuppresion" nghĩa là "đồng ức chế" bởi vì sự biểu hiện của gen chuyển vào và gen nội sinh trong hoa petunia đều bị ức chế như nhau. Một điều thú vị nữa trong nghiên cứu này là màu trắng của cánh hoa petunia có thể được quan sát qua các thế hệ sau và dần dần các hoa chuyển sang màu tím. Một sự trùng hợp ngẫu nhiên khác được quan sát trên nấm Neurospora crassa khi Cogoni và các cộng sự vào năm 1994 đã tiến hành một thí nghiệm nhằm phát trển màu cam của nấm thông qua việc chuyển một gen có chức năng tạo ra carotenoid. Tuy nhiên thay vì tạo ra màu cam như mong muốn thì nấm hầu như không thể hiện. Hiện tượng này được các nhà khoa học đặt tên là "quelling". Năm 1995, trên tạo chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đều tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng phân tử RNA chiều thuận vẫn có thể gây ra ức chế gen với hiệu quả tương đương với phân tử RNA chiều ngược. Kết quả là các phân tử RNA của cả hai chiều đều ức chế sự biểu hiện của gen par-1. Điều này gây ra một sự lúng túng bởi vì điều mong đợi nhất của các nhà khoa học là phân tử RNA sẽ bắt cặp với mRNA chiều thuận (sense mRNA) của gen par-1 nhằm ức chế khả năng mã hóa protein của nó. Phải đến 3 năm sau, năm 1998, nhóm nghiên cứu của Fire đã giải thích được điều nghịch lý này bằng những thí nghiệm cũng trên tuyến trùng C.elegans. Kết quả là phức chất dsRNA ức chế sự biểu hiện của gen gấp 10 lần so với việc dùng phân tử RNA đơn lẻ theo chiều thuận hay chiều nghịch. Hơn thế nữa khi loại bỏ dsRNA thì các phân tử đơn RNA theo chiều thuận hay chiều nghịch dần dần mất tác dụng ức chế gen. Như vậy nhóm nghiên cứu của giáo sư Fire đã xác định được nguyên ngân chủ yếu của hiện tượng RNA silencing chính là do phân tử dsRNA gây nên. Hiện tượng này được các nhà khoa học đặt cho một thuật ngữ là RNA interference (RNAi). Hiện tượng RNAi cũng được quan sát trên loài ruồi dấm Drosophila . Nhóm nghiên cứu của Richard Cathew đã chứng minh rằng tiêm phân tử dsRNA vào trong các phôi tế bào của ruối hay dùng súng bắn gen dẫn đến hiện tượng silencing hiệu quả hơn là dùng các tế bào yeast chứa các dsRNA cho ruồi dấm ăn (Nature- Vol.404- April, 2000). Cùng lúc đó nhóm nghiên cứu của giáo sư Hannon ở phòng nghiên cứu Cold Spring Habor, New York, USA cũng đã thành công trong việc ức chế sự biểu hiện của 2 gen cyclinE và myc liên quan đến chu trình phát triển và phân chia tế bào của ruồi dấm bằng phương pháp RNAi. Bằng việc khám phá vai trò của dsRNA liên quan đến việc phân hủy các mRNA trong suốt quá trình tìm hiểu cơ chế của RNAi và PTGS người ta đã nhận ra rằng cơ chế chung ảnh hưởng đến biểu thị của gen đối với quá trình quelling, cosupression, RNAi hay PTGS đều tương tự như nhau vì trong cơ chế của chúng đều có sự hiện diện của phân tử siRNA (small intefering RNA) dẫn đến việc hình thành các phức chất siRNA-RISC và cuối cùng là sự phân hủy các phân tử RNA dẫn đến việc ức chế sự biểu hiện kiểu hình của gen. Tựu chung lại người ta đặt một thuật ngữ mới là RNA silencing. 3/ ĐỊNH NGHĨA siRNA là các phân tử RNA sợi kép nhỏ, kích thước khoảng 21-28 nu, được tạo ra bởi Dicer- một RNA endonuclease nhóm III, là thành phần quan trong của phức hợp RISC gọi là siRISC có chức năng phân hủy mRNA đồng dạng của nó. [1] Các phân tử RNAi này có thể gây lên các hiêu ứng: - Ức chế dịch mã đơn vị mRNA - Ức chế sự phiên mã của gene ở trong nhân - Phân giải mRNA 4/ NGUỒN GỐC Các siRNA có nguồn gốc ngoại sinh tức có nguồn gốc từ bên ngoài đưa vào tế bào và cơ thể sống qua các con đường khác nhau (bằng tiêm hoặc có nguồn gốc từ các gen chuyển từ bên ngoài vào cơ thể[2] 5/ CÁC BƯỚC TẠO RA PHÂN TỬ siRNA a, Quá trình tạo ra các phân tử siRNA có thể được tóm tắt qua các bước sau: * Hình thành phân tử phiên mã sợi kép dài (dsRNA). Đầu tiên là hình thành các sản phẩm RNA sợi kép. Các sản phẩm sợi kép này có thể là các gen chuyển được thiết kế ngược chiều nhau, hoặc là các sản phẩm trung gian trong quá trình tái sinh của virus. * Hình thành siRNA thành thục. Các phân tử dsRNA được Dicer cắt thành các phân tử RNA nhỏ sợi kép có kích thước khoảng 22 nu. Do bị cắt bởi Dicer, các phân tử này có đầu so le với gốc phosphat ở đầu 5’ và 2-3 phân tử nu đầu 3’ (overhang). Tiếp theo, phân tử RNA nhỏ sợi kép này được được tách bởi helicase thành 2 phân tử sợi đơn - trong 2 mạch đơn này, chỉ mạch nào có đầu 5’ có hoạt lực với Agronauttrong phức hệ RISC mới gằn được với phức hệ RISC => tạo phức hợp siRNA-RISC -mạch còn lại đầu 5’ không có hoạt lực với Agronaut => không liên kết với RISC được . Các phân tử siRNA thành thục sợi đơn này sẽ tham gia hình thành phức hợp RISC. b, Phương pháp Việc tạo ra siRNA là phương pháp hoàn toàn có thể chủ động được bằng cách: - Xác định trình tự của gen đích_ gen cần phải làm bất hoạt - Thiết lập các vector mang gen siRNA tương ứng - Chuyển gen vào cơ thể sống - Cơ thể sinh sản dsRNA gây bất hoạt các gen của chính cơ thể sống đó hoặc các gen của virus gây bệnh hoặc để sản xuất ra các siRNA trị liệu 5/ Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA • dsRNA : là những đoạn RNA dài mạch kép có trình tự bổ xung với gene đích ( target RNA ) có 2 đầu thò là 3’OH • Dicer : là một loại enzyme endonuclease ( Ribonuclease III ) chịu trách nhiệm hoàn thiện sợi dsRNA. • Phức hệ RISC : Phức hệ gắng gene kích ứng bởi RNA. Phức hệ này có chứa enzyme helicase và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA . • siRNA : là RNA can thiệp kích thước nhỏ được tạo ra từ dsRNA Bước 1 Các đoạn dsRNA sợi kép dài được cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn (siRNA) khoảng 21-28 nucleotit. - Dicer=helicase+2RNaseIII + Protein… - Dicer cắt_dsRN -> siRNA Bước2 Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới tác dụng của enzyme helicase, một mạch được nạp vào phức hợp protein một cách chon lọc gọi là phức hợp cảm ứng bất hoạt RISC. - Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (ký hiệu là RISC*). - Sợi đơn siRNA sau khi được nạp vào RISC được gọi là mạch hướng dẫn, nó đóng vai trò chỉ đạo trong việc đưa phức hợp siRNA-RISC* đến các phân tử mRNA có trình tự bổ sung với nó.Việc chỉ đạo của siRNA thông qua một endonuclease có trong RISC là Agronaute protein. Bước3 RISC* xâm nhập được vào nhân tế bào và kết cặp với trình tự tương đồng theo nguyên tắc bổ sung Bước4 Lúc này RISC* huy động một số protein làm cải biến chất nhiễm sắc quanh vị trí promoter của gene => sự kìm hãm phiên mã. -khi tương tác với DNA: RISC methyl hóa DNA và biến đổi histon dẫn đến ngăn cản khởi động phiên mã -khi tương tác với mRNA : RISC tạo tín hiệu để RNase phân hủy mRNA Cơ chế tắt gen lúc này phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa siRNA và mRNA đích. +Nếu sự tương đồng giữa siRNA và mRNA đích là hoàn toàn thì phân tử mRNA có xu hướng bị cắt và phân giải (do hoạt tính nuclease của RISC) => không có mRNA mã hoá cho protein đó. +Nếu sự tương đồng giữa siRNA và mRNA chỉ là một phần thì xu hướng xảy ra là sự ức chế dịch mã do khi chung bám trên mRNA => ngăn cản sự dịch chuyển của Ribosome trong quá trình dịch mã => quá trình dịch mã bi ngưng lại => không tạo ra được protein. Cơ chế tắt gene bởi siRNA có hiệu quả rất cao, chỉ cần một lượng nhỏ siRNA được đưa vào tế bào cố thể đủ để làm nhiều bản sao trong cơ thể đa bào. 6/ CÁC ĐẶC ĐIỂM CƠ BẢN * Các đoạn dsRNA tương ứng với vùng intron hoặc promoter không tạo ra hiện tượng câm (silencing) của gen tương ứng. Như vây sự can thiệp (interfering) của RNA là ở mức hậu phiên mã (post-transcriptional level). * Khi tiêm các RNA ở dạng cùng chiều (sense) hay ngược chiều (antisense) vào tuyến trùng đã không ảnh hưởng tới lượng mRNA của gen tương ứng tức không làm ảnh hưởng tới sự biểu hiện của gen. Tuy nhiên khi tiêm các RNA ở dạng sợi kép dsRNA (hỗn hợp của RNA cùng chiều và ngược chiều)