Đang tải... (xem toàn văn)
Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài HươngMỤC LỤCCHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU . 3 CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 42.1 Giới thiệu về cây đu đủ .42.1.1. Giới thiệu 42.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ 52.1.3.Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ .52.2 Giới thiệu về enzyme papain 52.2.1 Cysteine protease 52.2.2 Nguồn gốc 52.2.3 Tính chất của papain .5 2.2.3.1 Tính chất vật lý .62.2.3.2 Tính chất hóa học .7a) Cấu tạo hóa học: .7b) Cấu trúc không gian .8c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain .9d) Phản ứng của papain 11e) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain .13CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 143.1 Phương pháp thu nhận papain 143.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ 143.1.2 Thu nhận papain 143.2 Phương pháp tinh sạch papain 15. . 3.2.1. Điện di .153.2.2 Lọc qua Sephadex G-75 .15CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 174.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng .174.1.1 Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân .17a/ Nguyên lý chung: 17b/ Thuyết minh quy trình chung: 18Nhóm _08DSH2 - 1 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương4.1.2 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân 184.1.3 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân .194.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành .194.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính 20a. Cơ chất: .20b. Điều kiện: .20c. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme: 20 . . c.1. Khái quát 20c.2. Phương pháp xác định hoạt tính của papain 214.2 Một số ứng dụng của enzyme papain .254.2.1 Trong y học .254.2.2 Trong công nghiệp thực phẩm: 254.2.3 Trong các ngành công nghiệp khác: .26CHƯƠNG V: KẾT LUẬN .28Tài lệu tham khảo 29Nhóm _08DSH2 - 2 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài HươngCHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦUTrong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và peptidase. Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh. Ngoài ra, papain còn là một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ. Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu hóa, giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn. Nó có thể giúp phân giải và loại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể. Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi các chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi trường hơi kiềm hay trung tính. Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng trứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt. Trung bình một trái đu đủ cho được 12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Với những lợi ích và giá trị mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng rộng rãi và thường được dùng trong lĩnh vực chế biến mỹ phẩm. Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dược phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm Vì tầm quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tôi thực hiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi.Nhóm _08DSH2 - 3 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài HươngCHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN2.1 Giới thiệu về cây đu đủ2.1.1 Giới thiệuTên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - CaricacCây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ.2.1.2 Phân bố sinh thái của cây đu đủ.Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài C. Nhóm _08DSH2 - 4 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hươngpeltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á. Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi.2.1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da.2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵamip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan.3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng.4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó.5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu.6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria). Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp, papain được dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain.2.2 Giới thiệu về enzyme papain2.2.1 Cysteine proteaseNhóm _08DSH2 - 5 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương- Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, esterthiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động.- Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp.- Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide.2.2.2 Nguồn gốcPapain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm.2.2.3 Tính chất của papain2.2.3.1 Tính chất vật lýBảng 2.1: Tính chất vật lý của papainTính chất vật lý Giá trịĐiểm đẳng điện pI = 8.75Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13Phân tử lượng 20,700Độ triền quang [α]D -66.70Nhóm _08DSH2 - 6 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài HươngĐộ xoắn 17%Vòng hiệu ứng cotton 290nmThể tích riêng phần V(mL/g) 0.724Trị số ma sát f/fo 1.16Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt.2.2.3.2. Tính chất hóa họca) Cấu tạo hóa học:Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S. Papain là 1 protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton.Bảng 2.2: Thành phần hóa học:Amino acid Số lượng Amino acid Số lượngAlanine 13 Lyeine 9Arginine 10 Proline 4Aspartic acid 17 Serine 9Half – Cysteine 6 Threonie 11Glutamid acid 17 Tryptophan 7Glycine 23 Tyrosine 5Histidine 2 Valine 17Isoleucine 10 Methionine 15Leucine 10 0Tổng cộng: 185Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch Nhóm _08DSH2 - 7 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hươngpolypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25.b) Cấu trúc không gianPhân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử.Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 570C.c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen.- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Nhóm _08DSH2 - 8 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài HươngLys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys.- Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau.Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys.Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser. Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng:- Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.- Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid:(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)-CO-)k i+k=n- Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid(H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH (H2N-CH(R)-COOH)n` + (H2N-CH(R)-CO-)kn`+k = nNhóm _08DSH2 - 9 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương- So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxy tự do. Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7 amino aicd trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên 1 chuỗi có phenylamine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y ( có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain.- Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và trafnerase. Hoạt hóa papain:Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. hki có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ. Bất hoạt:- Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.- Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m).d) Phản ứng của papain Nhóm _08DSH2 - 10 - [...]... xác định phân tử lượng của papain, ta dùng cột Sephadex G-75 có kích thước cột là 1.1x100 cm cột được cân bằng trước dung dịch đệm gồm sodium phosphate 0.1M và dung dịch EDTA ( ethylenediamine-tetraacetic aicd) pH=7 Nhóm _08DSH2 - 17 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng 4.1.1... phân 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành Chúng tôi điều chế enzyme papain để thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng với các nội dung sau: 1 Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ - Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain - Định lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế - Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian - Khảo... acetate … Làm cho enzyme không hoạt động nữa để thu được sản phẩm loãng Nhưng nhà sản xuất muốn sản phẩm đạt được chất lượng cao và bảo quản dễ dàng hơn người ta thường cô đặc sản phẩm tao ra sản phẩm khô ở đây ta kết thúc quá trình thủy phân của enzyme papain Mục đích người ta dùng enzyme papain dể thủy phân bánh dầu đậu phộng là nhằm cung cấp them các acid amin có trong enzyme vào trong bánh dầu, để bổ... trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy Khi thủy phân các protein khác... protein bánh đậu phộng thành acid amin là một quá trình khá phức tạp Dưới điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, enzyme sẽ tham gia phản ứng theo sơ đồ sau: E + S ESS + P - Người ta cho rằng ban đầu enzyme sẽ liên kết với cơ chất (bánh dầu đậu phộng) , sau đó mới diễn ra sự thủy giải và tạo ra các sản phẩm là các acid amin và các đoạn peptid ngắn - Ở đây E là enzyme papain và S là protein đậu phộng, ... trong hóa học… “ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử” Đã có những nghiên cứu ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân đậu nành, trong chế biến thịt, trong sản xuất mỹ phẩm… Tài liệu tham khảo Nhóm _08DSH2 - 28 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương [1] Đồng Thị Thanh Thu, Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ... ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain Nhóm _08DSH2 - 20 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương 2 Khảo sát phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng - Xác định hàm lượng đạm formol và đạm amoniac theo thời gian phản ứng - Khảo sát sự thay đổi hàm lượng xúc tác, pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng thủy phân 4.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính a Cơ chất: - Protease trong nhựa đu đủ - Cơ chất... tạo thành acid amin hay peptid cấp thấp và giải phóng enzyme b/ Thuyết minh quy trình chung: Bánh dầu đậu phộng sau khi được xay nhuyễn ta bổ sung enzyme khô papain và dd đệm phosphate 0.1M để quá trình phân giải bánh dầu nhanh hơn, quá trình thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ 1500C với pH = 8-8.5, thời gian thủy phân là 1- 2 giờ Sau quá trình thủy giải ta đem đi ly tâm nhằm thu dịch lỏng ( loại bỏ... lượng phân tử thấp (khoảng 6,000 Da) Ta không thể khử được vị đắng nhưng có thể giảm bớt được bằng cách kiểm soát mức độ thủy phân để cho những peptid có phân tử lượng lớn chiếm ưu thế - Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm là thủy phân không triệt để, sau thủy phân còn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn không tan, do đó người ta thường phối hợp thủy phân bằng hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân. .. sinh trong quá trình thủy phân: - Những nghiên cứu về sự liên kết enzyme và cơ chất đề ra giả thuyết: phần lớn các enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt ngoài của protein đậu phộng theo một tiến trình tương đối nhanh, sau đó sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong những thành phần này Nhóm _08DSH2 - 19 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương xảy ra chậm hơn Sự thủy phân những nối peptid của protein đậu . enzyme T.s Nguyễn Hoài HươngCHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng4 .1.1. quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tôi thực hiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo