Đang tải... (xem toàn văn)
Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc sử dụng DNA tái tổ hợp như là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất cây trồng và chất lượng lươn
PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt Vấn Đề Cách hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học giới nhận thấy việc sử dụng DNA tái tổ hợp nhƣ công cụ hữu hiệu việc nâng cao suất trồng chất lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời thúc đẩy đƣợc nông nghiệp bền vững Tiếp theo nhận định hàng loạt đột phá nghiên cứu khoa học phƣơng pháp chuyển gen, việc phát bảo tồn gen quý Tuy nhiên, việc nghiên cứu phân tích mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn lớn số lƣợng độ tinh DNA mẫu thí nghiệm Để giải vấn đề này, nghiên cứu trình tự đoạn DNA hoạt đông gen, biểu protein cấu trúc protein, ngƣời ta trọng tới việc phân lập thu nhận đoạn DNA quan tâm tiến hành tạo với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên cứu Mặc khác, gen sinh vật lớn phức tạp mà trình tự gen quan tâm thƣờng có hay hai tế bào Vì khơng thể sử dụng phƣơng pháp sinh hố thơng thƣờng để phân lập gen mục tiêu gen Những vấn đề đƣợc giải ta sử dụng cấu trúc DNA có khả tự chép tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng gen, biểu gen hay thao tác khác gen Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu gọi vector Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào thích hợp cho phép vector có khả tồn ổn định chép độc lập với gen tế bào Tế bào có khả tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi tế bào chủ Tế bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc cải tạo để tạo thành chủng chủ có kiểu gen đặc tính thuận lợi cho thao tác gen Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi dòng tái tổ hợp Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp dùng cho thao tác gen Toàn q trình gọi tạo dịng DNA hay DNA cloning Mục đích tạo dịng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn tinh khiết trình tự DNA hay thu nhận dịng tế bào có khả biểu gen mục tiêu Xuất phát từ khó khăn thực tế nghiên cứu tảng kiến thức kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu q trình học tập, chúng tơi tiến hành thực đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α” khố luận tốt nghiệp 1.2 Mục tiêu đề tài Thiết lập quy trình chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescipt chuyển đƣợc plasmid tái tổ hợp vào tế bào ký chủ Ecoly DH5α 1.3 Nội dung thực 1.3.1 Phần Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giá trị OD600nm mật số tế bào vi khuẩn dựa tƣơng quan số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tƣơng quan giá trị OD600nm theo thời gian ni cấy Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α hóa chất sốc nhiệt Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp SDS-kiềm thể biến nạp, kết hợp với phản ứng cắt enzym giới hạn để kiểm tra 1.3.2 Phần Chuẩn bị đoạn DNA để chèn Cắt tinh vector Phản ứng sửa chữa sai sót đoạn DNA chèn, nhằm tạo đoạn DNA có đầu Phản ứng nối vector DNA chèn Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào Kiểm tra thể biến nạp mơi trƣờng có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG Kiểm tra lại kết biến nạp đoạn gen phản ứng cắt, phản ứng PCR plasmid tách chiết từ thể biến nạp PHẦN TỔNG QUAN TÀI LYỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp vi khuẩn 2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp Biến nạp tƣợng tiếp nhận DNA từ bên vào tế bào vi khuẩn Hiện tƣợng biến nạp đƣợc chứng minh lần vi khuẩn Streptococcus pneumoniae Fred Griffiths, năm 1928, sau đƣợc kiểm chứng lại Avery cộng năm 1944 (viện Rocketfeller) Chủng vi khuẩn mà Griffiths Avery sử dụng có trạng thái khả nạp tự nhiên, chúng có khả hấp thu DNA tự nhiên có sẵn mơi trƣờng sống Nguồn DNA có đƣợc từ tế bào chết hay tế bào bị phân hủy Kết thu đƣợc vi khuẩn thể vài tính trạng mới, tính trạng ổn định có khả di truyền Từ nghiên cứu Griffiths Avery tế bào vi khuẩn phải trạng thái sinh lý đặc biệt có khả hấp thu DNA, “trạng thái khả nạp” Trạng thái khả nạp xuất tự nhiên vài loài vi khuẩn mà nồng độ chất dinh dƣỡng oxy môi trƣờng sống chúng giảm xuống thấp Trong thực tế nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào vi khuẩn để chúng có khả hấp thu DNA 2.1.2 Vai trò ứng dụng biến nạp gen 2.1.2.1 Vai trò Hiện tƣợng biến nạp giúp lồi vi khuẩn có thêm tính trạng dễ thích nghi với mơi trƣờng sống Đó sở tiến hóa đa dạng vi sinh vật 2.1.2.2 Ứng dụng Biến nạp DNA vào vi khuẩn bƣớc đầu kỹ thuật DNA tái tổ hợp Từ lâu, vi sinh vật đƣợc xem sử dụng nhƣ nhà máy sinh học (lyving factories) tạo sản phẩm sinh học phục vụ nhu cầu ngƣời, ví dụ kháng sinh Penicillyn đƣợc chiết xuất từ nấm Penicillyum Streptomycin tạo từ vi khuẩn Streptomyces griseus Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển gen từ động vật, trồng vào vi khuẩn lƣợng lớn sản phẩm mong muốn gen đƣợc tạo ra, sau kết hợp với phƣơng pháp chiết xuất tinh để phục vụ cho mục đích ngƣời Nhiều loại vaccine dùng y học thú y, nhiều giống trồng chứa gen kháng bệnh đƣợc tạo thay cho phƣơng pháp cổ điển Biến nạp gen vào vi khuẩn giúp thực hiên nghiên cứu khác nhƣ đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản ổn định đọan gen đƣợc dễ dàng 2.2 Cơ sở sinh hóa tế bào học hiên tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi thể gen mã hóa cho thành phần mà DNA gắn vào, sau đƣợc hấp thụ Trong tự nhiên, nồng độ chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sống vi khuẩn, lúc tế bào bị thay đổi cấu trúc nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến hình thành kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA theo kênh vào nhờ việc tiếp xúc với màng nhận đƣợc hỗ trợ hệ thống vận chuyển bên tế bào Hệ thống vận chuyển đƣợc hình thành sở enzym gây biến tính số protein màng Enzym ComC có chất peptidase phân cắt protein ComG màng tế bào làm cho khơng cịn tính trọn vẹn protein màng, từ chúng đƣợc hoạt hố Có protein dạng với ComG, tất chúng tạo cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA ComEA thể nhận để DNA vào tế bào ComEC tạo kênh vận chuyển dạng dịch qua DNA vào tế bào (Leendert W.Hamoen cộng sự, 1998) ComFA dạng helycase có chức phối hợp với ComEA ComEC để đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào Trong trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl ComEA đƣợc phân thành đoạn dƣới tác động endonuclease (hiện xác định NucA), phần đầu cuối đƣợc cắt đƣợc đƣa tới ComEC ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào Sự phiên mã gen “late competence” mã hoá cho máy gắn kết hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) nhƣ yếu tố cần cho tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi yếu tố có khả kých hoạt phiên mã ComK yếu tố hoạt hoá phiên mã ComK đƣợc điều chỉnh xác biểu Sự biểu ComK đƣợc quy định mạng lƣới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR MecAB Trong thí nghiệm thực năm 1998, Leendert W.Hamoen cộng ComK nhận biết vùng trình tự ngắn giàu A/T, đƣợc xếp khung đọc đặc trƣng lynh động dọc theo sợi xoắn DNA Phân tích footfrinting gốc hydroxyl ComK bám vào addAB promoter cho phép họ kết luận ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T AAAAN5TTTT ComK đƣợc điều hoà âm bám vào AbrB CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng AbrB, sinR, DegU CodY GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP nội bào nhƣ thị dinh dƣỡng, điều hồ phiên mã phần đầu phare ổn định phiên mã gen quy định hình thành bào tử Từ đó, cho phép tế bào thích nghi với giới hạn dinh dƣỡng DegU giúp cho ComK bám chặt vào ComK promoter, điều đảm bảo phiên mã xác nồng độ ComK thấp 2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly 2.3.1 Khái niệm biến nạp nhân tạo Biến nạp nhân tạo việc đƣa đoạn DNA vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số lƣợng sao, phục vụ cho mục đích nghiên cứu khác Trong phịng thí nghiệm, nhằm mục đích tăng cƣờng khả biến nạp, ngƣời ta thƣờng xử lý tế bào chủ phƣơng pháp hóa học hay vật lý Tế bào chủ sau đƣợc xử lý phƣơng pháp gọi tế bào khả nạp Tế bào E.coly tế bào chủ đƣợc sử dụng rộng rãi cấu trúc di truyền tƣơng đối đơn giản, thông tin di truyền đƣợc biết tƣờng tận nên dễ dàng phát tế bào có mang gen lạ E.coly vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 2,5µm, có roi (flagella) gen gồm 4639221 cặp base mã hố cho 4000 gen Giống nhƣ tất loài vi khuẩn gram âm khác E.coly khơng có màng nhân nhiễm sắc thể phân tử sợi đơi dạng vịng lớn với vị trí gắn màng vị trí khởi đầu chép Các tế bào E.coly hỗ trợ chép plasmid DNA chọn lọc DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay phức hợp màu với X-gal 2.3.2 Sự điều hoà gen operon Lac E.coly Trong trƣờng hợp có glucose, E.coly tăng trƣởng nhanh chóng Nếu thay glucose lactose (β-galactisido-glucose), E.coly ngừng tăng trƣởng hồi phục sau nhờ tổng hợp đƣợc enzym Permerase kých thích thấm lactose Acetylase (vai trị chƣa rõ) Β-galactosidase xúc tác thuỷ giải lactose thành galactose glucose Ba enzym đƣợc tổng hợp cần để phóng thích glucose từ lactose; chúng đƣợc cảm ứng lactose Jacobs Monod (1961) giải thích cảm ứng qua mơ hình hoạt động operon Lac (lactose operon) Operon Lac đoạn DNA chứa: Ba gen cấu trúc lacZ (mã hoá β- galactosidase), lacY (mã hố permerase) lacA (mã hố acetylase) Một trình tự nucleotide gọi promoter (vùng khởi động: P), đánh dấu điểm khởi đầu chép gen Một trình tự nucleotide gọi operator (vùng hoạt động: O) nằm promoter gen mã hoá enzym Operator địmh RNA polymerase không lyên kết hay lyên kết với promoter di chuyển dọc theo gen (trích dẫn Bùi Trang Việt, 2002) gen điều hồ Gen điều hoà Vùng cấu trúc gen lac operon cấu trúc gen cấu trúc gen cấu trúc gen Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac vi khuẩn E.coly Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002 Ngƣời ta gọi nhóm gen với chức lyên hệ với promoter operator operon Operon có procaryote; tập hợp gen operon giúp gen lyên hệ biểu nhanh chóng (do thay đổi mơi trƣờng), chúng đƣợc kiểm sốt “nút đóng mở” (đó operator) Trƣớc operon lacZ gen điều hồ I, gen mã hố repressor, tức protein có vai trị kìm hãm biểu gen Hoạt động operon Lac đƣợc chứng minh nhƣ sau: Khi có glucose (và khơng có lactose), gen điều hồ I hoạt động (I có promoter riêng) để tạo repressor; repressor nhận biết lyên kết với operator, cản lyên kết RNA polynerase promoter Khi có lactose (và khơng có glucose), lactose ln kết với repressor làm biến đổi hình thể repressor, repressor khơng ln kết với operator: operon Lac mở, RNA polymerase lyên kết với promoter trƣợt dài theo gen operon; mRNA (mã hoá cho enzym) đƣợc tạo thành đƣợc dịch mả thành polypeptide riêng biệt Với hỗn hợp glucose lactose, E.coly dùng glucose trƣớc, dùng lactose bị đàn áp: “kìm hãm dị hố” Khi glucose giảm, ngƣời ta chứng minh cAMP gia tăng cố định protein gọi CAP (catabolyte gen activator protein) hay CRP (cAMP recepter protein) phức hợp cAMPCAP cố định promoter làm tăng khả lyên kết RNA polymerase với promoter Nhằm trì tồn vector bacteriophage tế bào chủ, thông thƣờng E.coly dùng để biến nạp đƣợc cải tiến thành chủng chủ theo hƣớng loại bỏ hệ thống sửa đổi hạn chế hệ thống can thiệp vào chép DNA lạ tế bào vi khuẩn DNA lạ bị phân giải thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích luỹ tế bào Thông thƣờng ngƣời ta gây đột biến gen endA (endA-) gen mã hóa cho endonuclease I Việc endonuclease làm tăng sản lƣợng plasmid cải thiện chất lƣợng DNA chiết tách phƣơng pháp sinh hố chuẩn (trích dẫn Bùi Trang Việt, 2002) 2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp Có hai phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp 2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý Phƣơng pháp sử dụng xung điện tác động lên tế bào chủ từ gây nên thay đổi cấu trúc tế bào tính thấm màng Ƣu điểm phƣơng pháp tiến hành nhanh chóng, tế bào sau xử lý có hiệu suất biến nạp cao 2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học Là phƣơng pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết hợp với nhiệt độ) Phƣơng pháp thực lâu, hệ số biến nạp tế bào sau xử lý thấp nhƣng đơn giản dễ thực Hiện để tạo tế bào E.coly khả nạp theo phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta tiến hành theo cách khác Thứ nhất, phƣơng pháp Hanahan cho phép tạo tế bào E.coly khả nạp có hiệu biến nạp cao (5x108 khuẩn lạc/µg plasmid DNA) Thứ hai, phƣơng pháp Inoue dễ lặp lại phƣơng pháp Hanahan tạo tế bào khả nạp có hiệu biến nạp từ 1x108 đến 3x108 khuẩn lạc/µg plasmid DNA Thứ ba, phƣơng pháp Calcium chloride, phƣơng pháp đƣợc phát triển từ 30 năm qua tạo tế bào khả nạp có hiệu biến nạp từ 5x106 đến 2x107 khuẩn lạc/µg plasmid DNA Thơng thƣờng, ngƣời ta xử lý tế bào vi khuẩn dung dịch muối lạnh kim loại hoá trị II nhƣ CaCl2, MgCl2, RbCl2 Việc biến nạp DNA plasmid vào E.coly đạt hiệu cao có diện ion Ca2+ nhiệt độ thấp (0-4oC) Ion Ca2+ gây xáo trộn màng tế bào làm cho DNA xâm nhập tế bào E.coly dễ dàng Giai đọan sốc nhiệt để kých thích chuyển phân tử DNA vào tế bào, mơi trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau cho phép tế bào phục hồi DNA tiến hành mã, dịch mã để tạo protein tƣơng ứng 2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp plasmid tái tổ hợp Sau xâm nhập, plasmid tái thể gen kháng kháng sinh tế bào chủ Điều giúp tế bào chủ có khả sinh trƣởng mơi trƣờng có kháng sinh Do đó, trải E.coly biến nạp lên mơi trƣờng chứa kháng sinh, tế bào thu nhận plasmid biểu gen kháng kháng sinh sinh trƣởng Các tế bào không tiếp nhận plasmid không sinh trƣởng đƣợc Tuy vậy, kết phản ứng nối đoạn DNA vector đƣợc mở vòng tổ hợp bao gồm nhiều kết nối, vector-vector, vector-DNA chèn Do vậy, có thể biến nạp có khả sinh trƣởng mơi trƣờng chứa kháng sinh nhƣng không mang gen mục tiêu Việc sàng lọc thể biến nạp mang gen mục tiêu đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp Phổ biến phƣơng pháp sau: Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa việc quan sát màu xanh hay trắng khuẩn lạc α-complementation Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc) Xác định gen đích plasmid thể biến nạp PCR (PCR khuẩn lạc) Thơng thƣờng, để phân tích dịng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp khảo sát plasmid tái tổ hợp cách tạo đồ cắt giới hạn giải trình tự tồn đoạn gen đích Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGem plasmid có nguồn gốc từ họ plasmid này) mang đoạn ngắn DNA E.coly chứa trình tự điều hịa mã hóa cho α-protein β-galactosidase (đầu amin) Việc chèn vào đoạn trình tự MCS chứa vị trí cắt giới hạn (vẫn trì khung đọc) tạo thêm vài amino axit α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức lacZ Các vector loại đƣợc sử dụng với chủng chủ thể phần đầu carboxyl βgalactosidase Hiện tƣợng α-complementation xảy hai protein bất hoạt βgalactosidase E.coly (α, ω-protein ) kết hợp với để tạo thành enzym có chức Các khuẩn lạc có α-complementation dễ dàng đƣợc phát việc xuất khuẩn lạc màu xanh mơi trƣờng có chứa chất tạo màu X-gal (5-Bromo- 4chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside) Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt β-galactosidase galactose dẫn xuất indoxyl Dẫn xuất này, đến lƣợt nó, bị oxy hóa khơng khí để tạo dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh Để có biểu β-galactosidase cần có chất kých hoạt IPTG (đồng phân galactose không bị nhận biết β-galactosidase), đóng vai trị nhƣ chất kých hoạt gen lacZ Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS vector (ví dụ pBluescript) làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin Do đó, tƣợng α-complementation khơng thể xảy Vì vậy, khuẩn lạc thể biến nạp hình thành có màu trắng 2.3.5 Chiết tách DNA plasmid Với mong muốn thu nhận số lƣợng lớn plasmid, ngƣời ta sử dụng máy di truyền tế bào chủ Thơng qua đó, plasmid đƣợc chép với số lƣợng lớn tốc độ nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng tế bào chủ Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau ni cấy tế bào chủ mơi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ cơng đoạn cuối nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh Các quy trình tách chiết có bƣớc phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối tủa DNA Tuỳ theo phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sử dụng tác nhân khác cơng đoạn q trình tách chiết Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ: Phƣơng pháp nhiệt độ cao Phƣơng pháp Lythium Phƣơng pháp SDS-kiềm 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3.6.1 Giới thiệu phản ứng PCR Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực chế tự nhân đôi DNA invitro Quá trình đƣợc tiến hành nhờ enzym DNA polymerase Phản ứng PCR gồm bƣớc chủ yếu sau: Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn nhiệt độ 94-95oC Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp Primer mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự Primer, thơng thƣờng khoảng 40 – 50oC Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp DNA đƣợc tiến hành 72oC Mỗi chu kỳ gồm bƣớc đƣợc lập lại nhiều lần Lặp lại n lần Biến tính 72o C 94–95o C Kéo dài 45-56o C Ủ bắt cặp 10 Hình 2.2 Các chu kỳ phản ứng PCR 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR Taq polymerase Taq polymerase enzym tham gia vào q trình tổng hợp mạch DNA Enzym cịn có khả phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung nucleotide vào mạch DNA Taq polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng thermus aquaticus Enzym có tính chịu nhiệt cao, chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C Nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động Taq polymerase khoảng 70 – 72o C Trong phản ứng PCR nồng độ enzym thấp không đủ lƣợng enzym xúc tác cho phản ứng tạo sản phẩm PCR không mong muốn 10 Nếu trƣờng hợp khơng đủ hố chất để tách chiết plasmid theo quy trình sử dụng SDS - Kiềm nên tách chiết plasmid theo phƣơng pháp xử lý nhiệt gồm bƣớc sau : Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ ống cho vào eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối 10000 vòng/phút phút 200c Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, phút 200c, lặp lai hết dịch ni cấy ống nghiệm Bƣớc3: Hồ tan kết tủa 500μl TE, vortex để làm tan hết phần kết tủa Bƣớc 4: Ly tâm 1000 vòng/phút phút, hút bỏ dung dịch TE thu lấy kết tủa Bƣớc 5: Hoà tan kết tủa 500 μl dung dịch STET đƣợc làm lạnh Bƣớc 6: Thêm 30 – 50 μl dung dịch men lysozyme, vortex làm hoà tan Bƣớc 7: Cho vào bồn nƣớc đƣợc đun sôi 1- phút Bƣớc 8: Ly tâm 14000 vòng/phút 15 phút 40C Bƣớc 9: Thu phần dịch bên cho vào eppendorf Bƣớc 10: Thêm 170 – 200 μl dung dịch ammonium acetate 7.5 M thêm 550μl dung dịch isopropanol Trộn để nhiệt độ phòng 10 phút Bƣớc 11: Ly tâm 14000 vòng/phút 15 phút 40C, thu lấy kết tủa Bƣớc 12: Thêm 500μl ethanol 70% lạnh vào, ly tâm 14000 vòng/phút 15 phút 40 C Bƣớc 13: Loại bỏ dịch thu lấy kết tủa làm khơ nhiệt độ phịng Bƣớc 14: Hồ tan kết tủa TE với lƣợng thích hợp Bƣớc 15 : Điện di kiểm tra kết tách chiết plasmid 60 TÀI LYỆU THAM KHẢO Tài lyệu tiếng việt Bùi Trang Việt, 2002, Bài giảng sinh học phân tử ( chƣơng trình cao học), NXB đại học quốc gia TPHCM Đinh Duy Kháng, 7-2005, Bài giảng gen cloning thị phân tử, Tài lyệu lƣu hành nội trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng,2002, Sinh học phân tử, NXB giáo dục Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật Trần Lynh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại học quốc gia TPHCM Tài lyệu tiếng nƣớc T.A Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH Sambrook J, E F Fritsch, T Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH Wolgang Schumann, 1995, Genetic Enginereering Techniques Các website http://faculty.plattsbuggh.edu/donald-slysh/transformation.html 12.http://www.mun.ca/Biochem/course/4103/topic/transrormation.html 13.http://cc.suny.edu/faculty/ 14.http://www.fermentas.com/catalog/kits/kittransformaid.html 15.http://www.kings.edu/Biology/lux/bacterial.html 16.http://fruitfly4.aecom.edu/labmanual/27.html 17.http://core.eai.edu/biol/foruvellm/farwelebpage/Biotech3100/pvector.200.pfd http://lybrary.thinkquest.org/19697/data/ovpc6b.html http://www.web.books.com/mobio/free/ch9a4.html 61 10 http://www.personal.umd.umich.edu/~mpasson/474/cloning 11 http://www.unn.edu/biology/Bial395-s-05/lab4a.html 12 http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW4/ html 13 http://www.ornl.gov/sci/techresourses/human 14 http://www_biology.ucsd.edu/classes/bimm100.FACO/03cloning.html 15 http://bioprotocol.endlex.com/protocols/lygation.html 16 http://www.soton.ac.uk/~kpa/molecal/clone.html 17 http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/methods/lazo/pcr_cloning.html 18 http://brahms.chem.uic.edu/~cgpage/protocol/cloning.html 62 PHỤ LỤC Công thức pha số mơi trƣờng dùng thí nghiệm Mơi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Thêm nƣớc 1000 ml Hấp khử trùng 1210c 20 phút Môi trƣờng LB agar Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc 1000 ml Hấp khử trùng 1210c 20 phút Môi trƣờng LB + Ampicillyn Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc 1000 ml Hấp khử trùng 1210c 20 phút, sau để nguội đến 40-450c bổ sung Ampicillyn nồng độ cuối 60µg/ml, 100µg/ml Mơi trƣờng LB + Ampicillyn + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coly) Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillyn, dùng que trang, trang đĩa, mặt thạch khô Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đĩa khô mặt thạch Các dung dịch dùng cho chiết tách DNA plasmid 63 Dung dịch I Tris – HCl 25mM pH8 Glucose 50mM EDTA 10mM Dung dịch II (nên pha trƣớc dùng) Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl NaOH 5N 40µl Nƣớc cất lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25% Glycerol TAE 1X 40% Dung dịch Lysozyme: Hoà tan 10mg 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0 Dung dịch STET (sodium chloride, Tris, EDTA, Triton) Sucrose 8% Triton X - 100 0.5% EDTA pH 8.0 50mM Tris- HCl pH 8.0 10mM Dung dịch X-gal 20mg/ml Cân 20 mg X-gal hoà tan 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch độc, phải cẩn thận thao tác) Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock) 64 Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan ml nƣớc khử ion, sau lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,2μm Dung dịch kháng sinh Ampicillyn 100mg/ml Cân 100mg ampicillyn dạng bột, hoà tan 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,45μm Các loại buffer PCR buffer 10X Tris-HCl pH 8.4 200mM (NH4)2SO4 166mM MgCl2 67mM DTT 100mM NP 40 0,1% Tween-20 0,1% Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt) Tris-HCl 100mM NaCl 1M MgCl2 50mM 2-Mercaptoethanol 10mM NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer enzym DNA polymerase I large fragment) NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 10mM DTT 1mM Lygation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl2 66mM DTT 100mM ATP 660μM 65 Hình 1: Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) 66 Hình : Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) 67 MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách hình viii Danh sách bảng, biểu đồ sơ đồ x PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt Vấn Đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung thực 1.3.1 Phần 1.3.2 Phần PHẦN TỔNG QUAN TÀI LYỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp vi khuẩn 2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp 2.1.2 Vai trò ứng dụng biến nạp gen 2.1.2.1 Vai trò .3 2.1.2.2 Ứng dụng 2.2 Cơ sở sinh hóa tế bào học hiên tƣợng biến nạp 2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly 2.3.1 Khái niệm biến nạp nhân tạo 2.3.2 Sự điều hoà gen operon Lac E.coly .5 2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp 2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý 2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học .7 2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp plasmid tái tổ hợp .8 2.3.5 Chiết tách DNA plasmid 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 10 68 iii 2.3.6.1 Giới thiệu phản ứng PCR 10 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR 10 2.3.7 Điện di DNA 14 2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA 14 2.4.1 Plasmid 15 2.4.2 Nhiễm sắc thể virút .16 2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA 16 2.5.1 Các enzym cắt giới hạn 16 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA 19 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) .19 2.5.2.2 Terminal transferase .19 2.5.2.3 Các DNase 20 2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá 20 2.5.4 Các enzym nối DNA .20 2.5.3.1 E.coly DNA lygase 20 2.5.3.2 T4 DNA lygase .21 2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp tăng bội 21 2.6.1 Với plasmid 21 2.6.2 Với DNA phage 21 2.7 Các nghiên cứu lyên quan đến khóa luận 21 PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 3.1 Thời gian địa điểm thực khoá luận tốt nghiệp 23 3.2 Vật lyệu phƣơng pháp dùng thí nghiệm 23 3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm 23 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α 23 3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) 23 3.2.1.3 Đoạn DNA 24 3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm .24 3.2.3 Các thiết bị máy móc 24 3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn 24 3.2.5 Các loại hóa chất dùng thí nghiệm 25 69iv 3.2.6 Các loại enzym dùng thí nghiệm 25 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .26 3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 26 3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α kiểm tra .27 3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn cách đo OD600nm kết hợp với phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 28 3.3.3.1 Nguyên tắc 28 3.3.3.2 Cách tiến hành 28 3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp .29 3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt 30 3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn tính hiệu suất biến nạp 31 3.3.7 Chiết tách plasmid sử dụng enzym cắt để kiểm tra 31 3.3.7.1 Chiết tách plasmid 31 3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid 33 3.3.7.3 Quy trình điện di gel agarose 34 3.3.8 Tinh plasmid đoạn DNA từ sản phẩm PCR .34 3.3.9 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR 35 3.3.10 Thiết lập phản ứng nối plasmid đoạn DNA đầu (phản ứng nối blunt-end) .36 3.3.11 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp 37 3.3.12 Kiểm tra kết chiết tách plasmid sử dụng enzym BamHI Hind III, thực phản ứng PCR plasmid với cặp primers (T3, T7) (ITS4, ITS5) .38 PHẦN 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .39 4.1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính 39 4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 43 4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60µg/ ml 43 4.2.2 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml 45 4.3 Tách chiết DNA plasmid .47 4.4 Phản ứng cắt plasmid enzym cắt giới hạn EcoRV 50 4.5 Tinh đoạn DNA plasmid cắt enzym EcoRV .50 70 v 4.5.1 Tinh đoạn DNA .50 4.5.2 Tinh plasmid 52 4.6 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp 52 4.7 Kết tách chiết plasmid tái tổ hợp 54 4.8 Kết phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp 55 4.9 Kết kiểm tra kĩ thuật PCR 56 PHẦN : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 5.1 Kết luận 58 5.2 Đề nghị 59 TÀI LYỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 63 71 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac vi khuẩn E.coly Hình 2.2 Các chu kỳ phản ứng PCR 10 Hình 2.3 Mơ hình plasmid sử dụng cho cloning 15 Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn vi khuẩn 18 Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu (blunt-end) cho đoạn DNA 36 Hình 4.1 Kết cấy vi khuẩn nồng độ pha loãng khác sau 5, nuôi cấy .39 Hình 4.2 Kết cấy vi khuẩn nồng độ pha loãng khác sau 7, nuôi cấy .39 Hình 4.3 Kết cấy vi khuẩn biến nạp sốc nhiệt 90 giây 43 Hình 4.4 Kết cấy vi khuẩn biến nạp sốc nhiệt 60 giây .44 Hình 4.5 Kết cấy vi khuẩn biến nạp đối chứng 45 Hình 4.6 Kết cấy vi khuẩn biến nạp tỉ lệ thể tích 30 : 46 Hình 4.7 Kết cấy vi khuẩn biến nạp tỉ lệ thể tích 10 : 46 Hình 4.8 Kết cấy vi khuẩn biến nạp tỉ lệ thể tích : 0.5 46 Hình 4.9 Sản phẩm tách chiết plasmid gel agarose 0.8% (lần 1) 48 Hình 4.10 Sản phẩm tách chiết plasmid gel agarose 0.8% ( lần 2) 49 Hình 4.11 Sản phẩm tách chiết plasmid gel agarose 0.8% ( lần 3) 49 Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid EcoRV gel agarose 0.8% 50 Hình 4.13 Kết qủa điện di sản phẩm tinh trực tiếp đoạn DNA cột GFX .51 Hình 4.14 Kết qủa điện di sản phẩm tinh đoạn DNA phƣơng pháp cắt gel thu hồi lại cột GFX .51 Hình 4.15 Kết qủa điện di sản phẩm plasmid tinh trực tiếp cột GFX .52 Hình 4.16 Kết cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629 bp môi trƣờng LB/amp(100μg/ml)/ X-gal/IPTG 53 72 viii Hình 4.17 Kết cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp môi trƣờng LB/amp/ X-gal/IPTG .53 Hình 4.18 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp .54 Hình 4.19 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp 55 Hình 4.20 Sản phẩm cắt plasmid tách chiết mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp .56 Hình 4.21 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp 57 Hình 1: Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) .66 Hình : Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) 67 73 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Các vấn đề thƣờng gặp PCR phƣơng pháp khắc phục 12 Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MSC plasmid pBluescript II SK (+/-) 24 Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 26 Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α kiểm tra 27 Sơ đồ 3.4 Quy trình pha lỗng dịch vi khuẩn 28 Bảng 4.1 Gía trị đo OD số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 40 Bảng 4.2 Gía trị đo OD số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 40 Biểu đồ Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giá trị OD600 nm LgA pha loãng tế bào nƣớc cất .41 Biểu đồ 4.2 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giá trị OD600 nm LgA pha loãng tế bào nƣớc muối sinh lý 41 74 x ... plasmid,kiểm tra Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 26 3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α kiểm tra + CaCl2 Vi khuẩn Ecoly DH5α Khả nạp Plasmid Bluescript... thể biến nạp PHẦN TỔNG QUAN TÀI LYỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp vi khuẩn 2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp Biến nạp tƣợng tiếp nhận DNA từ bên vào tế bào vi khuẩn Hiện tƣợng biến nạp đƣợc chứng minh lần vi. ..đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α? ?? khoá luận tốt nghiệp 1.2 Mục tiêu đề tài Thiết lập quy trình chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescipt
