Đang tải... (xem toàn văn)
Sàng lọc và kiểm tra cây ngô chuyển gen
SÀNG LỌC VÀ KIỂM TRA SÀNG LỌC VÀ KIỂM TRA CÂY NGÔ CHUYỂN GENCÂY NGÔ CHUYỂN GENTS. Phạm Thị Lý ThuViện Di truyền nông nghiệp Lây nhiễm vi khuẩn với phôi và nuôi cộng sinhNuôi phục hồi phôi biến nạpChuẩn bị dịch vi khuẩn QUY TRÌNH TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GENQUY TRÌNH TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GENTạo và chọn lọc mô sẹo chuyển genTạo chồi và Chọn lọc chồi chuyển genTái sinh và Chọn lọc cây chuyển gen hoàn chỉnhChuyển genKiểm tra, phân tích cây chuyển genSàng lọc 0 AS0 AS200uM AS200uM ASQuá trình Chuyển Gen đã được thực hiện chưa? Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen Tác nhân chọn lọc: kháng sinh / PPT / mannose Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen NGUYÊN TẮC•So với các tế bào Eukaryot khác, tế bào thực vật có thêm lớp thành xenlulose vững chắc ở bên ngoài. Do đó, việc tách ADN tổng số từ thực vật gặp phải những phức tạp và khó khăn. Có rất nhiều phương pháp tách chiết, tinh sạch ADN khác nhau và cũng thành công trên nhiều đối tượng thực vật. Nguyên tắc chung của các phương pháp này là:•Sử dụng các biện pháp cơ học (nghiền mô trong đá khô, nitơ lỏng, . bằng chày cối sứ) để phá vỡ thành tế bào thực vật, giải phóng các thành phần bên trong.•Sử dụng chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng ADN.•Sử dụng các hoá chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ ADN khỏi các nuclease nội bào.•Sử dụng các hoá chất (chloroform, isoamyl alcohol, phenol, .) để loại protein và các tạp chất ra khỏi dung dịch chứa ADN.•Thu hồi ADN bằng tủa (trong cồn hay isopropanol) và ly tâm.PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ QUY TRÌNH•Bước 1: Ủ sẵn 5ml đệm chiết ở 600C trong bình ổn nhiệt (30 phút).Thành phần đệm chiết: •CTAB 2% (W/V)•Mercaptoetanol 0,2% (V/V)•EDTA 0,5M pH8.•Tris HCl, 1M pH7,5.•NaCl 5M.•Bước 2: Nghiền 0,75 (g) mô lá thực vật bằng Nitơ lỏng (bằng chày thuỷ tinh hoặc sứ .) cho đến khi thành dạng bột mịn.•Bước 3: Hoà tan mẫu đang nghiền trong đệm chiết, nghiền thêm một chút để tạo dạng đồng chất.•Bước 4: Ủ mẫu ở 650C trong 30 phút (lắc đều, đảo nhẹ 3-5 lần) trong quá trình ủ.•Bước 5: Thêm một thể tích dung dịch bao gồm chloroform và isoamyl alcohol (C:I) theo tỷ lệ 24:1, lắc đều.•Bước 6: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. •Bước 7: Chuyển pha trên sang ống sạch và thêm một thể tích dung dịch C:I, lắc đều.•Bước 8: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.•Bước 9: Chuyển pha trên sang ống sạch. Thêm 2/3 thể tích EtOH 100% có bổ sung CH3COONa, 3M (pH = 5,2) hoặc tốt hợp là thêm 2/3 thể tích isopropanol.•Bước 10: Để mẫu ở -200C từ 3 giờ trở lên và ly tâm 13.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 40C thu tủa.•Bước 11: Rửa tủa bằng EtOH 80%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C.•Bước 12: Để khô không khí, hoà tan trong dung dịch TE 0,1X.•Bước 13: Thêm RNase A để đạt nồng độ cuối cùng là 100mg/ml, ủ 370C trong 1 giờ. •ADN tích điện âm. Trong điện trường sẽ di chuyển về cực dương.•Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước và độ tích điện.Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước và độ tích điện.• ADN thường được điện di trên hai loại gel: agarose và ADN thường được điện di trên hai loại gel: agarose và acrylamid (gel acrylamid có độ phân giải cao hơn).acrylamid (gel acrylamid có độ phân giải cao hơn).ĐIỆN DI ADN [...]... Xylencyanol FF và glycerol (hoặc đường saccarose) • Bromophenol blue, Xylencyanol FF: mầu xanh, tím xẫm • Giúp tra mẫu ADN vào giếng điện di và theo dõi hướng, khoảng cách di chuyển của ADN trong gel • Các chất mầu di chuyển tương đương đoạn ADN 0,5kb nên có thể quan sát để dừng điện di ở thời gian thích hợp • Glycerol, đường có trọng lượng riêng lớn, chìm trong dung dịch đệm điện di làm ADN bị dìm và giữ... Ethydium bromide chứa nhóm Plariar xen vào giữa các base của ADN tạo liên kết nhuộm • Chiếu tia cực tím vào gel ==> ADN hấp phụ tia 260nm, liên kết nhuộm hấp phụ 300 - 360 nm ==> huỳnh quang tia 590nm (đỏ da cam) ==> nhìn và chụp ảnh được • Trong gel polyacrilamide: gel được ngâm trong dung dịch nitrat bạc, ADN sẽ tương tác khi bổ sung formaldehyt ở pH kiềm, ion bạc chuyển thành nguyên tử bạc (Ag) tạo... ứng dụng của PCR • Giúp tách nhanh và chính xác từng gen hoặc từng đoạn ADN riêng biệt • Chẩn đoán nhanh, nhạy tất cả các bệnh di truyền và nhiễm trùng (ung thư, virus, vi khuẩn, nấm ) • Xác định nhanh với độ chính xác cao các thủ phạm hỡnh sự, quan hệ di truyền từ những dấu vết rất nhỏ: giọt máu, nước bọt, sợi tóc • Xác định trinh tự ADN tự động • Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại... (oligo đặc hiệu/suy biến, số mẫu, độ dài) 2 Lựa chọn phương pháp đánh đấu (phóng xạ hay huỳnh quang) 3 Tiến hành phép lai cho mục đích sàng lọc hay nhận dạng Các bước lai ADN a) Phân tách các đoạn ADN bằng điện di trên gel agarose b) Làm biến tính ADN bằng kiềm và chuyển hay thẩm tách các băng lên màng nylon hay nitrocellulose c) Cố định ADN sợi đơn trên màng bằng nhiệt hay UV d) Tiền lai màng với... bản: 1 Biến tính hay tách sợi ADN kép thành sợi đơn (denaturing) Nhiệt độ: 94-95oC Thời gian: vài chục giây đến 1 phút 2 Gắn mồi vào sợi ADN (annealing) Nhiệt độ tuỳ thuộc Tm của mồi Thời gian: 30 - 60 giây 3 Kéo dài chuỗi mới (extending) Nhiệt độ: 72oC (sau khi có Taq ADN Polymerase) Thời gian: 30 giây đến vài phút Một số bước phụ: Khởi động nóng (hot start) Kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi Làm lạnh... 2,0 0,1 - 3 Nồng độ agarose thường dùng phụ thuộc vào kích thước sản phẩm ADN cần phân giải (dao động từ 0,5% - 3%) • Chuẩn bị: Agarose dạng bột hoà trong dung dịch điện di TBE (Tris Borat EDTA) hoặc TAE (Tris Acetat EDTA) Đun nóng, đổ vào khuôn Đệm điện di: • TAE thường gây kiềm hoá cực dương, axit hoá cực âm sau mỗi lần điện di cần trộn • Điện thế và thời gian điện di: • Là hai yếu tố liên quan lẫn... ADN (Southern hybridization) (mang tên Southern E.M phát minh ra) Nguyên tắc: Dựa vào sự ghép cặp Watson-Crick đặc hiệu giữa hai đoạn ADN có trình tự bổ sung để nhận biết các (mẫu) ADN đích Nếu một oligo có chiều dài n nucleotit thì khả năng lai đặc hiệu (trong điều kiện khắt khe) là A/4n Trong đó A là kích thước của hệ gen đối tượng cần lai tính bằng bp Các bước tiến hành: 1 Thiết kế mẫu dò (oligo đặc... f) Phát hiện các mẫu lai bằng tự chụp phóng xạ hay huỳnh quang g) Đối chiếu kết quả trên bản film để tìm ra các băng ADN laiđặc hiệu với mẫu dò Phân tách ADN bằng điện di và lai với mẫu dò A Sau khi điện di 1 2 3 B Sau khi lai và hiện ảnh 1 2 3 Lai ADN ( DNA Hybridisation) 5’ GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ |||||||||||||||||||||||| 3’ CCCTCTCCTACATCGGACGAAGCA…5’ Target + 5’ GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’... Phân tích PCR (Polymerase Chain Reaction) • Bản chất của kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp, phản ứng chuỗi nhờ polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh chưa từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt (máy PCR) • Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh 1985 Các yêu cầu cần thiết cho PCR • 2 mồi tổng hợp oligonucleotide (20-30 nucleotide) có... polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase) • 4 loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) • Mg++, dung dịch đệm thích hợp, pH, Chu trình PCR Khuôn ADN được biến đổi thành 2 sợi đơn (94 0C, 5 phút) Gắn primer vào đầu đoạn ADN (55 0C, 30 giây) Biến đổi để tách sợi ADN mới thành 2 đơn (94 0C, 30 giây) Tổng hợp chuỗi ADN mới (65-75 0C, 2-5 phút) Các yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu quả PCR • Độ tinh sạch của ADN . mô sẹo chuyển genTạo chồi và Chọn lọc chồi chuyển genTái sinh và Chọn lọc cây chuyển gen hoàn chỉnhChuyển genKiểm tra, phân tích cây chuyển genSàng lọc . SÀNG LỌC VÀ KIỂM TRA SÀNG LỌC VÀ KIỂM TRA CÂY NGÔ CHUYỂN GENCÂY NGÔ CHUYỂN GENTS. Phạm Thị Lý ThuViện Di truyền nông