Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ

Thông tin tài liệu

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) là cây rau được gieo trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao. Quả cà chua ngoài tác dụng làm các món ăn, làm quả tươi tráng miệng, nước gi

Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị LoanM UC chua (Lycopersicon esculentum Mill) l cõy rau c gieo trng rng rói nhiu ni trờn th gii v cú giỏ tr kinh t cao. Qu c chua ngoi tỏc dng lm cỏc mún n, lm qu ti trỏng ming, nc gii khỏt v nhng dng thc phm ch bin cung cp dinh dng, vitamin, v cht khoỏng, cũn cú tỏc dng cha bnh thiu vitamin C, bnh v tim mch, ung th. Din tớch trng c chua liờn tc tng lờn trong nhng nm gn õy. T nm 1990 n 2002 din tớch c chua trờn th gii t 2,8 triu ha tng lờn 3,7 triu ha v sn lng t 76 triu tn tng lờn 100 triu tn. Vit Nam, nm 1996 din tớch trng c chua khong 8 nghỡn ha thỡ n nm 2001 lờn n 18 nghỡn ha, úng gúp hng trm t ng vo nn kinh t quc dõn [1].Nng sut c chua b gim sỳt ỏng k do nhiu nguyờn nhõn nh: ging, iu kin canh tỏc, ch chm súc, bnh do nm, vi khun, tuyn trựng. Trong ú bnh do vi rỳt c xỏc nh l tỏc nhõn gõy hi nghiờm trng. Bnh do vi rỳt khụng nhng lm gim nng xut m cũn lm gim cht lng ca sn phm. Xon lỏ c chua do vi rỳt (Tomato yellow leaf curl virus-TYLCV) gõy ra l bnh ph bin v gõy thit hi nng n nht cỏc nc nhit i v cn nhit i [24].Vic s dng cỏc bin phỏp canh tỏc, cỏch li vựng b bnh, loi b cõy b bnh, phun thuc tr sõu phũng tr bnh vi rỳt va hiu qu thp va gõy nh hng n cõy trng, mụi trng v c con ngi. Nhng bin phỏp ny ch lm gim s lan truyn ca bnh v mang tớnh cht phũng ch khụng th ngn chn bnh mt cỏch trit . Hin nay, cựng vi s tin b ca Cụng ngh sinh hc, to cõy chuyn gen khỏng li vi rỳt c coi l mt bin phỏp hu hiu nht ngn chn v hn ch tỏc hi do vi rỳt gõy ra ng thi ỏp ng yờu cu phỏt trin mt nn nụng nghip sch v bn vng. Vn t ra l cỏc ging cõy chuyn gen thng cú tớnh khỏng c hiu. Cỏc ging cõy chuyn gen c to ra bng cỏch s dng cỏc vt liu di truyn t cỏc vi rỳt gõy bnh (gen CP, gen mó hoỏ replicase .) ch khỏng li c cỏc dũng vi rỳt gõy bnh cú gen c s dng to cõy chuyn gen hoc l cỏc dũng vi rỳt cú quan h di truyn gn gi. Xut phỏt t thc t trờn, chỳng tụi ó tin hnh nghiờn cu ti: ỏnh giỏ tớnh a dng ca cỏc virus gõy bnh xoan lỏ c chua Vit Nam thong qua tỏch dũng, xỏc nh v so sỏnh trỡnh t on gen mó húa cho protein v vi mc ớch thu c hiu bit sõu sc mc di truyn phõn t ca cỏc vi rỳt gõy bnh xon lỏ c chua ca Vit Nam t ú lm c s cho vic hoch nh cỏc chin lc thớch hp cho nghiờn cu to cõy chuyn gen khỏng bnh xon lỏ c chua Vit Nam.1 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị LoanChơng 1. Tổng quan tài liệu1.1. Đặc điểm phân loại, nguồn gốc, sự phân bố và giá trị sử dụng của cây Cà chua 1.1.1. Phân loại Cà chua thuộc họ Cà (Solanaceae), chi Lycopersicon. Chi này gồm 12 loài, tất cả đều có nguồn gốc từ châu Mĩ. Đã có nhiều tác giả đa ra các hệ thống phân loại cho cà chua, nhng cho đến nay hệ thống phân loại của Breznep (1955) đợc sử dụng rộng rãi và đơn giản nhất [21]. Chi Lycopersicon có 2 chi phụ: - Chi phụ Eriopersicon: quả luôn xanh, có sọc tía, có lông, hạt nhỏ. Chi này có 5 loài hoang dại:Lycopersicon hisrutum HumbLycopersicon peruviarum Mill Lycopersicon cheesmaniiLycopersicon chilenseLycopersicon glandulosum- Chi phụ Eulycopersicon: quả chín đỏ hoặc vàng, hoa to. Chi này có 2 loài: Lycopersicon esculentum: cà chua thông thờngLycopersicon pimpinellifolium: cà chua bán hoang dại. 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố Tổ tiên của cà chua trồng ngày nay là cà chua anh đào (L. esculentum var. cerrasiforme) đợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới châu Mĩ. Từ châu Mĩ, cà chua đợc các thơng gia Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha đa sang trồng ở châu Âu, châu á. Từ châu Âu, cà chua đợc chuyển sang châu Phi nhờ những thực dân đi khai phá thuộc địa. ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu cho rằng cà chua đợc ngời Pháp du nhập vào và nó đã nhanh chóng trở thành một loại rau quả phổ biến và đợc a chuộng. Hiện nay, cà chua đợc trồng ở hầu hết các tỉnh, trong đó diện tích trồng tập trung chủ yếu ở các tỉnh Hng Yên, Hải Dơng, Bắc Ninh, Hà Tây, Nam Định, v.v[1].2 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan1.1.3. Giá trị sử dụng Cà chua rất dễ trồng. ở Việt Nam, do điền kiện thời tiết thuận lợi, có thể trồng cà chua ở hầu hết các tỉnh và đợc trồng gần nh quanh năm. Vụ sớm từ tháng 7 đến tháng 12, vụ chính từ tháng 9 đến tháng 2 năm sau, vụ muộn từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau, vụ xuân hè từ tháng 1 đến tháng 6 [6].Trong quả cà chua chín có nhiều chất dinh dỡng nh: đờng, vitamin A, vitamin C và các chất khoáng quan trọng nh: canxi, sắt, phospho, kali, magiê, v.v . Thành phần hoá học trong quả cà chua chín gồm có: nớc (94-95%), chất khô (5-6%), trong đó: 55% đờng, 21% chất không hoà tan trong rợu (nh protein, xenlulôzơ, pectin, polisaccarit), 12% axit hữu cơ (nh xitric, malic, galacturonic, pirolidoncacboxilic), 7% chất vô cơ và 5% các chất khác (nh carotenoit, axit ascorbic, chất dễ bay hơi, amino axit, v.v ) [1].Cà chua không những đợc dùng nh rau cung cấp vitamin, chất khoáng mà còn có nhiều tác dụng về mặt y học. Trong cà chua có chất licopen (thành phần tạo màu đỏ của cà chua) có khả năng giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Theo Võ Văn Chi (1997), quả cà chua có vị ngọt, tính mát, có tác dụng tạo năng lợng, làm cân bằng tế bào, khai vị, giải nhiệt, chống hoại huyết . Hàng ngày, mỗi ng ời sử dụng 100-200 g cà chua sẽ thỏa mãn nhu cầu vitamin và chất khoáng cần thiết [3].1.2. Bệnh xoăn lá cà chua do vi rút1.2.1. Đặc điểm của bệnh xoăn lá cà chua do vi rút Bệnh xoăn lá cà chua do vi rút (Tomato yellow leaf curl) rất phổ biến ở khu vực Đông Nam châu á, các nớc Trung Cận Đông và Đông Phi. Đây là một trong những bệnh do vi rút gây thiệt hại nặng nề nhất cho cà chua. Theo thống kê của Polston và Anderson (1997), từ năm 1988 đến năm 1995, bệnh đã làm giảm 5% đến 95% sản lợng cà chua ở nớc Cộng hòa Dominica, Venezuela và một số nớc ở Trung Mĩ, làm thiệt hại cho nền kinh tế tổng cộng 140 triệu đô la Mĩ [28]. Bệnh lan truyền qua vật truyền trung gian là loài bọ phấn (Bemisia tabaci). Bọ phấn chích hút nhựa cây chủ yếu ở ngọn và lá non, mang TYLCV [4]. Cây bị bệnh có triệu chứng xoăn ngọn lá, làm cho lá co quắt, cây thấp nhỏ, hoa phát triển kém, dễ bị rụng. Cây còn nhỏ nếu bị nhiễm bệnh sẽ còi cọc, không thể phát triển [8].3 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loanở Việt Nam, bệnh xoăn lá cà chua do vi rút phát triển mạnh trong vụ cà chua sớm và vụ xuân hè. Khi nhiệt độ không khí từ 25-300C, độ ẩm hơn 70%, bọ phấn nở rộ, mật độ bọ phấn trên một cây tăng dẫn đến tăng khả năng truyền bệnh [8]. 1.2.2. Vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua1.2.2.1. Đặc điểm phân loại 4b)c)Hình 1. Bọ phấn Bemisia tabaci [34]Hình 2. Biểu hiện hình thái của bệnh xoăn lá trên cây cà chuaa) Cây đối chứng không bị bệnh; b) Cây bị nhiễm bệnh xoăn lá; c) Ruộng cà chua bị bệnh xoăn lá Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị LoanVi rút gây bệnh xoăn lá cà chua Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) thuộc họ Geminiviridae, chi Begomovirus. Dựa vào sự tơng đồng về trình tự nucleotit, tác nhân truyền bệnh và phổ vật chủ, họ Geminiviridae đợc chia thành bốn chi: Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus và Topocuvirus [37]. Trong đó Begomovirus là chi có số lợng loài lớn nhất trong họ, tác nhân truyền bệnh là bọ phấn (Bemisia tabaci), vật chủ là cây 2 lá mầm nh: đậu, da hấu, bông, hồ tiêu, thuốc lá, khoai tây và cà chua [25]. Khác với các chi khác trong họ đều có hệ gen gồm một vòng ADN sợi đơn, hệ gen của các loài trong chi Begomovirus tìm thấy ở châu Mĩ có thể gồm hai vòng ADN sợi đơn. Trong khi đó, hệ gen của những loài tìm thấy ở châu á, châu âu và châu Phi có thể có một vòng hoặc hai vòng ADN sợi đơn [36]. 1.2.2.2. Đặc điểm cấu tạo Geminivirus đợc Goodman mô tả lần đầu tiên vào năm 1977. TYLCV có dạng hình chày, kích thớc khoảng 18 nm x 30 nm. Lớp protein vỏ có trọng lợng khoảng 28-34 x 103 đvc gồm 22 capsom giống nhau, mỗi capsom gồm 5 phân tử protein vỏ [25].TYLCV lần đầu tiên đợc phân lập hoàn chỉnh vào năm 1991 ở Sardinia [19] và Israel [26]. Hệ gen gồm một vòng ADN sợi đơn, có kích thớc khoảng 2,8 Kb, gồm sáu gen nằm trong hai vùng dịch mã ngợc chiều, ngăn cách bởi một vùng liên gen có khoảng 300 nucleotit. Họ Geminiviridae có vùng khởi đầu sao chép nằm trong vùng liên gen đều có trình tự là TAATATTAC (vùng có dấu chấm đen) [25], [37].5Hình 3. ảnh chụp vi rút xoăn lá cà chua dới kính hiển vi điện tử [17] Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị LoanBốn gen: C1, C2, C3, C4, có chiều dịch mã ngợc chiều với hai gen V1 và V2. Trong đó gen V1 mã hóa loại protein cần thiết cho sự tạo vỏ ngoài genom, sự lan truyền và nhận ra vectơ truyền nhiễm ; gen C1 mã hóa loại protein cần thiết cho quá trình sao chép của cả hai vùng dịch mã ; gen C2 mã hóa protein có vai trò hoạt hóa quá trình phiên mã gen V1 và V2 ; gen C3 mã hóa loại protein có tác dụng hoạt hóa quá trình sao mã và cùng với gen C1 tăng cờng khả năng phân chia hệ gen của vi rút ; gen C4, V2 mã hóa protein liên quan đến sự gây bệnh đối với thực vật và sự vận chuyển của vi rút [37].1.2.2.3. Sự đa dạng về hệ gen của các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chuaBởi những thiệt hại nghiêm trọng do TYLCV gây ra, nghiên cứu về TYLCV đợc nhiều nớc quan tâm nh: Thái Lan, Australia, Trung quốc, Brazil, Mĩ, ấn Độ, Đài Loan, Nhật Bản . Hiện nay, ngoài loại vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua có một vòng ADN sợi đơn ngời ta còn phát hiện ra loại vi rút có hai vòng ADN sợi đơn kí hiệu là vòng ADN-A và vòng ADN-B [15], [27]. Trong đó, vòng ADN-A gồm các gen mã hoá protein cần thiết cho sự sao chép và lắp ráp của vi rút, còn vòng ADN-B gồm các gen mã hoá protein cần thiết cho sự lan truyền của vi rút [36].6Hình 4. Cấu trúc hệ gen của TYLCV có một vòng ADN sợi đơn [25] Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị LoanCó loại vi rút cũng có hai vòng ADN sợi đơn, một là vòng ADN-A còn vòng thứ hai không phải là vòng ADN-B mà vòng ADN-B đợc thay thế bằng một vòng ADN vệ tinh, gọi là vòng ADN-beta [20]. Trình tự nucleotit của vòng ADN-beta đợc phân lập ở những vùng khác nhau có sự khác nhau rõ rệt. Ngời ta còn thấy rằng, với những cây cà chua bị nhiễm TYLCV có vòng ADN-beta thì biểu hiện bệnh nặng hơn cây nhiễm TYLCV không mang vòng ADN-beta [40]. Chowda Reddy và cộng sự (2005) đã tiến hành thí nghiệm với 103 mẫu cà chua từ những vùng trồng cà chua chính ở ấn độ, có 81 mẫu cho kết quả dơng tính với vi rút TYLCV. Trong đó 65 mẫu, hệ gen vi rút gồm hai vòng ADN sợi đơn, một vòng là ADN-A, vòng thứ hai hoặc là vòng ADN-B hoặc là vòng ADN-beta [13]. Li và cộng sự (2004) đã tiến hành thí nghiệm với 14 mẫu cà chua thu từ ba huyện trong tỉnh Vân Nam, Trung Quốc. Cả 14 mẫu đều cho kết quả dơng tính với TYLCV và những chủng TYLCV này thuộc vào bốn nhóm khác nhau. Nhóm I và III hệ gen đều có vòng ADN-beta. Khi phân lập hoàn chỉnh trình tự nucleotit vòng ADN-beta với ba mẫu ở nhóm III, thì ngời ta thu đợc những trình tự ADN-beta khác với những vòng ADN-beta công bố trớc đó [23]. ở Nhật Bản Shimizu và Ikeami (1999) đã tiến hành phân lập hệ gen của chủng vi rút TYLCV có một vòng ADN sợi đơn. Qua kết quả so sánh cho thấy trình tự nucleotit của chủng vi rút phân lập giống nhất là với TYLCTwV (TYLCV ở Đài Loan) (76%), so với các chủng vi rút khác thì chúng có sự khác nhau tơng đối [32]. Trình tự các gen cấu trúc của vi rút nh gen C1, C2, C3, C4, V1, V2 mã hoá các protein chức năng tơng ứng của vi rút cũng có sự khác nhau ở những loại vi rút xâm nhiễm ở cây trồng khác vùng. Có loại vi rút có vùng trình tự các nucleotit hoàn toàn không giống với những vùng tơng ứng của những loại vi rút đã phát hiện trớc đó [39]. Xie và Zhou (2003) ở Trung Quốc đã phân lập hoàn chỉnh vòng ADN-A của 7Hình 5. Cấu trúc hệ gen của TYLCV gồm hai vòng ADN sợi đơn [30] Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị LoanTYLCV thì kết qủa cho thấy ADN-A giống nhất với TYLCThV (TYLCV ở Thái Lan) giống 84%. Vòng ADN-A của chủng vi rút phân lập có vùng từ nucleotit 74-2071 là giống 95% với TYLCThV, vùng nucleotit 2071-2457 giống 91% với PeLCBDV (Pepper leaf curl virus from Bangladesh), và vùng còn lại thì rất khác với những chủng vi rút đợc công bố trình tự trớc đó [39]. Qua những nghiên cứu trên chúng ta có thể thấy rằng các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua có độ đa dạng rất lớn về bộ gen. Ngoài ra các nghiên cứu này còn cho thấy có xảy ra sự tái tổ hợp của các chủng TYLCV để hình thành các chủng mới.1.2.2.4. Cơ chế lây truyền của vi rútTYLCV xâm nhập vào cây trồng qua bọ phấn trắng (Bemisia tabaci). Khi nhiễm vào tế bào thực vật, phần ADN vòng đơn của vi rút sẽ xâm nhập vào nhân của tế bào chủ và sử dụng những nguyên liệu của vật chủ để sao chép và tổng hợp ra protein vỏ, hoàn thiện cấu trúc vi rút. Theo Revington và cộng sự (1989), sự sao chép hệ gen của vi rút bắt đầu từ một vị trí đặc biệt trong vùng mở đầu gồm khoảng 30 nucleotit và diễn ra theo 2 hớng quanh phân tử, tạo thành hai vòng khép kín [28]. Một nuclease cắt một trong hai vòng và đầu 3-OH của sợi bị cắt sẽ làm mồi để gắn thêm các nucleotit. Sợi nguyên vẹn bổ sung đợc làm khuôn. Nh vậy, đầu 5-OH bị thay thế và sau đó đợc sao chép. Theo cách này phân tử sợi kép đợc tổng hợp có thể dài gấp nhiều lần NST của vi rút, sau đó bị cắt thành những NST của hạt vi rút. Các NST này sẽ đợc dịch mã để tạo các protein cần thiết cho vi rút [35].8Hình 6. Sơ đồ minh họa cơ chế phiên mã ADN sợi đơn dạng vòng [35] Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan1.3. cây chuyển gen kháng vi rút và một số thành tựu đ đạt đã ợc trong cải tiến giống cây trồng bằng công nghệ gen1.3.1. Cơ chế kháng bệnh vi rút của cây chuyển genCây trồng có tính kháng khác nhau với các loại vi rút khác nhau, nó có thể là vật chủ hoặc không là vật chủ của những loại vi rút xác định. Vi rút có thể xâm nhiễm vào cây chủ, lan truyền gây bệnh làm cây chủ giảm hay mất khả năng sinh tr-ởng, phát triển, sinh sản. Trong quá trình tiến hóa, vi rút dần hình thành những cơ chế bảo vệ khỏi tính kháng tự nhiên của vật chủ để dễ dàng xâm nhập và gây bệnh [5].Với cây chuyển gen, chúng ta đã tạo ra tính kháng tích cực và hiệu quả cho cây trồng chống lại vi rút. Có nhiều cách giải thích về tính kháng của cây chuyển gen, theo Baulcombe (1996) tính kháng của cây chuyển gen gọi là tính kháng có đ-ợc nhờ chính yếu tố gây bệnh-PDR (pathogen-derived resistance) [12]. Gen đợc chuyển vào cây là những gen có chức năng khác nhau của vi rút nh: gen mã hóa protein vỏ, gen mã hóa protein vận chuyển , hay gen đ ợc thiết kế có đầu là những đoạn lặp lại ngợc chiều. PDR có thể có cơ chế thông qua protein (post translation), sản phẩm của những gen đợc chuyển vào sẽ cản trở quá trình tạo lớp protein vỏ, làm quá trình lắp ráp không xảy ra đợc và cản trở sự lan truyền của vi rút trong cây. PDR có thể có cơ chế thông qua ARN (post transcription). Mặc dù cơ chế của nó cha đợc xác định rõ, xong có thể là liên quan đến ARN sợi đôi và những sợi ARN đơn ngắn, RdRps, ARN helicases và RNase [16]. Khi vi rút TYLCV xâm nhập, trong tế bào xuất hiện tín hiệu bảo vệ, sợi ARN đôi đợc tạo thành từ những ARN của vi rút và ARN của những gen chức năng của vi rút TYLCV đã đợc chuyển vào cây trớc đó d-ới tác dụng của RdRp. Sợi ARN này sẽ bị cắt thành những đoạn ARN đôi ngắn, với hai đầu có 2-3 nucleotit nhô ra, dới tác dụng của Dicer (một nuclease). Những đoạn ARN ngắn này có tác dụng làm mồi để tổng hợp nên những sợi ARN đôi, dựa vào những ARN lạ làm khuôn (chính là những ARN của vi rút), và nó còn tạo phức RNase, khi kết hợp với protein elF2C (nhân tố khởi đầu), ARN helicase, Dicer (một loại nuclease). Phức này có thể cắt những ARN đôi tiếp tục lại tạo thành những ARN đôi ngắn với hai đầu có 2-3 nucleotit nhô ra, ARN này lại làm mổi, để loại bỏ dần những ARN lạ. Nh vậy theo mô hình kháng này thì hiệu quả của nó phụ thuộc vào độ tơng đồng của những đoạn ARN làm mồi với ARN lạ. 9 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan1.3.2. Một số thành tựu đã đạt đợc trong cải tiến giống cây trồng bằng công nghệ genViệc chuyển gen vào cây trồng cho đến nay không là vấn đề còn phải tranh cãi nữa mà đã trở thành kĩ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50 loại gen đã đợc chuyển nạp vào cây trồng và ít nhất có khoảng 400 loại cây mang gen biến nạp đợc trồng thử ở điều kiện đồng ruộng nh cà chua, bông, cải dầu, ngô, khoai tây [2], với các đặc tính nh : kháng vi rút, kháng côn trùng, chín chậm, chống chịu chất diệt cỏ, tăng hàm lợng chất dinh dỡng [10]. Đến hết năm 2002 đã có trên 52,6 triệu ha cây trồng chuyển gen đợc canh tác trên thế giới [18]. Các quốc gia hiện nay trồng các cây chuyển gen nh: Achentina, úc, Bungary, Canada, Trung Quốc, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây Ban Nha, Nam Phi, Urugoay, Brazil và Mỹ [10]. Bên cạnh những vấn đề cha rõ về cây chuyển gen nh: mối nguy cơ trong việc vô tình đa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dỡng sản phẩm, khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang dại , thì chúng ta không thể phủ nhận những giá trị kinh tế của nó đem lại. Do các đặc tính u việt của nó, cây chuyển gen ngày càng đợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi.1.4. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu bệnh vi rút1.4.1. Kĩ thuật PCRKĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction-chuỗi phản ứng trùng hợp nhờ Polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Đây là kĩ thuật nhân nhanh một đoạn ADN, dựa vào một ADN khuôn (là một đoạn ADN mang đoạn ADN ngắn cần nhân) và cặp mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ enzym ADN polimerase (ngày nay sử dụng phổ biến loại enzym bền với nhiệt nh Taq polimerase) xúc tác nối dài mồi để thành mạch mới, trong sự có mặt của các nucleotit tự do (dNTP), Mg2+. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp. Mỗi chu kì gồm ba bớc:+ Bớc 1 -Biến tính ADN- ADN đợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ Tm của phân tử, thờng khoảng 94-950C trong vòng từ 30 giây đến 1 phút, để tạo ADN sợi đơn.+ Bớc 2 -Bắt cặp- Mồi bắt cặp với ADN, ở nhiệt độ từ 40-700C, tùy thuộc vào tỉ lệ và số lợng từng loại nucleotit của đoạn mồi và kéo dài khoảng 30 giây-1 phút.10 [...]... bảo chất lợng và số lợng để tiến hành xác định trình tự 3.4 Kết quả xác định trình tự nucleotit Để xác định trình tự gen CP, chúng tôi tách và tinh sạch plasmit từ 12 dòng khuẩn lạc trắng Các plasmit này là nguyên liệu cho phản ứng PCR xác định trình tự Trình tự gen đợc xác định trên máy xác định trình tự nucleotit tự động ABI PRISMđ3100 Advant Genetic Analyzer của hãng Applied Biosystems cùng với bộ... đợc tiến hành so sánh sử dụng chức năng Blast với các trình tự trong ngân hàng dự liệu gen (NCBI), kết quả cho thấy có độ tơng đồng cao với trình tự gen mã hoá cho protein vỏ (CP) của các TYLCV Điều này chứng tỏ chúng tôi đã tách dòng thành công đoạn gen CP của các dòng TYLCV của 6 tỉnh ở miền Bắc Việt Nam Các trình tự thu đợc đã đợc chúng tôi gửi đang ký vào ngân hàng dữ liệu gen và có các số đăng ký... xoăn lá ở Việt Nam 35 Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Loan Kết luận và kiến nghị Kết luận -Nhân dòng và tách dòng thành công đoạn gen mã hóa protein vỏ (CP) của các dòng virut gây bệnh xoăn lá cà chua thu thập ở sáu tỉnh miền Bắc Việt Nam bao gồm Quảng Ninh, Hải Dơng, Bắc Ninh, Hng Yên, Hà Nội và Thái Bình -Xác định đợc trình tự nucleotit đoạn gen CP tơng ứng cho 6 dòng virut nghiên cứu Các đoạn gen này... Xác định đợc vị trí, số lợng các enzym hạn chế trên trình tự ADN + Giải mã trình tự nucleotit sang trình tự axit amin theo một trong các khung đọc mở, xác định vị trí mở đầu và kết thúc dịch mã + Lập cây phân loại và bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tơng đồng di truyền của 6 trình tự nucleotit của gen CP của 6 dòng TYLCV nghiên cứu với nhau và với trình tự gen CP của các TYLCV từ nhiều khu vực khác... quả so sánh trình tự 3.5.1 Kết quả so sánh trình tự nucleotit Sử dụng chơng trình Aligment của phần mềm DNAstar để so sánh trình tự gen CP của 6 mẫu nghiên cứu với nhau và với 43 trình tự gen CP của TYLCV khác nhau và một số vi rút khác thuộc chi Begomovirus từ nhiều khu vực trên thế giới đã đợc công bố trong ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) Hình 15 trình bày kết quả so sánh trình tự nucleotit gen CP của. .. phút Các mẫu đợc tra vào các giếng của khay đựng mẫu và điện di trong ống mao quản (80 cm x 50 àl) với polymer POP-4TM của hãng ABI, Mỹ 2.2.10 Phơng pháp xử lý trình tự gen thu đợc Sử dụng chơng trình phần mềm DNAstar để phân tích, so sánh trình tự gen thu đợc Các bớc tiến hành nh sau: + So sánh trình tự gen đợc đọc từ hai đầu xuôi và đầu ngợc để xác định trình tự đầy đủ và đúng của gen + Xác định. .. gen có phổ kháng rộng đối với các loại TYLCV cho Việt Nam thì một việc làm cần thiết là phải tiến hành các nghiên cứu một cách toàn diện về tính đa dạng di truyền của các virut gây bệnh xoăn lá cà chua của Việt Nam Nghiên cứu của chúng tôi là một nghiên cứu đầu tiên đợc tiến hành ở Việt Nam theo hớng này và là một đóng góp ban đầu góp phần cho việc nghiên cứu tạo cây cà chuyển gen kháng bệnh xoăn lá. .. 576 bp mã hoá cho các polypeptit tơng ứng dài 191 axit amin Trình tự các đoạn gen này đã đợc đăng ký vào Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế với số đăng ký là AJ972379 - AJ972384 -Kết quả so sánh cho thấy, các trình tự gen CP của 6 dòng virut gây bệnh xoăn lá cà chua thu thập ở sáu tỉnh miền Bắc Việt Nam có hệ số tơng đồng với nhau từ 86,8% (TB so với QN) đến 98,8% (TB so với HY) ở mức độ nucleotit và từ... Độ và Thái Lan trên cây cà chua có biểu hiện triệu chứng bệnh xoăn cho thấy có rất nhiều loài virut khác nhau thuộc chi Begomovirus cùng gây ra bệnh xoăn lá cho cây cà chua [13], [23], [32] Từ kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng đã có thể kết luận sơ bộ về tính đa dạng của các virut gây bệnh xoăn lá trên cà chua của Việt Nam, tuy nhiên vẫn còn cần phải có các nghiên cứu một cách toàn diện hơn về các. .. thớc gen CP chúng tôi đã dự tính khi thiết kế mồi Từ kết quả trên, chúng tôi sơ bộ kết luận đã phân lập đợc gen CP của vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua ở sáu tỉnh: Hà Nội, Thái Bình, Hng Yên, Quảng Ninh, Hải Dơng, Bắc Ninh Để có kết luận chính xác chúng tôi tiến hành tách dòng và đọc trình tự gen CP 3.3 Tách dòng gen mã hóa protein CP 3.3.1 Kết quả thôi gel Quá trình tách dòng đợc thực hiện bằng cách . hệ gen của vi rút ; gen C4, V2 mã hóa protein liên quan đến sự gây bệnh đối với thực vật và sự vận chuyển của vi rút [37].1.2.2.3. Sự đa dạng về hệ gen của. phút. 2.2.9. Xác định trình tự gen bằng máy phân tích trình tự nucleotid tự độngGen đợc xác định trình tự trên máy tự động ABI PRIMSđ 3100 Avant Genetic Analyzer,

Ngày đăng: 30/10/2012, 14:53

Xem thêm: Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ, Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ, Phân loại Nguồn gốc và phân bố Giá trị sử dụng, Đặc điểm cấu tạo Sự đa dạng về hệ gen của các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua, Đặc điểm của bệnh xoăn lá cà chua do vi rút Cơ chế kháng bệnh vi rút của cây chuyển gen, Kĩ thuật PCR Kỹ thuật tách dòng, Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc colony-PCR Kỹ thuật xác định trình tự ADN, VËt liÖu thùc vËt, Hoá chất, môi trờng nuôi cấy vi khuẩn và thiết bị sử dụng Tách chiết ADN tổng số, Nhân gen đặc hiệu bằng phơng pháp PCR Điện di phân tích ADN trên gel Agarose Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM-T Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5, Kiểm tra sự có mặt của gen CP trong vectơ tách dòng Tách vectơ tái tổ hợp ADN plasmit tái tổ hợp từ E.coli Xác định trình tự gen bằng máy phân tích trình tự nucleotid tự động, Phơng pháp xử lý trình tự gen thu đợc, Kết quả thôi gel Kết quả biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5