Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme protease từ vi sinh vậ
LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ thời cổ xưa, vi sinh vật người sử dụng để chế biến sản xuất thực phẩm, phận phần ăn người loài vật nuôi Ngày việc sản xuất protein từ nguồn vi sinh vật khơng nhằm mục đích sử dụng để làm thức ăn, mà sản xuất protein từ vi sinh vật nhiều lĩnh vực khác Protease enzyme sử dụng nhiều số ngành sản xuất như: Chế biến thực phẩm ( đông tụ sữa dùng làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Protease phân bố thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme vi sinh vật phong phú có nhiều ưu điểm như: có hầu hết vi sinh vật vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…, có hoạt tính mạnh cần lượng nhỏ chuyển hóa lượng chất lớn, có cường độ sinh sản mạnh tổng hợp enzyme với tốc độ nhanh chóng, thời gian ngắn thu lượng enzyme lớn….Có thể nói vi sinh vật nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất enzyme quy mô lớn dùng công nghệ đời sống Đây lý em chon đề tài “ Nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme protease từ vi sinh vật” Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan enzyme 1.1.1 Định nghĩa enzyme[1] co nga Enzyme protein có khả xúc tác đặc hiệu cho phản ứng hóa học, chất xúc tác sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng như: cường lực xúc tác lớn, chuyển hóa chất mạnh… 1.1.2 Thành phần cấu tạo enzyme[2]co nga Cũng protein, enzyme protein đơn giản protein phức tạp Trên sở đó, người ta phân enzyme thành hai nhóm: Enzyme thành phần (enzyme cấu tử) enzyme hai thành phần (enzyme hai cấu tử) Phần protein enzyme hai thành phần gọi apoprotein hay apoenzyme, cịn phần khơng phải protein gọi nhóm ngoại coenzyme Phần khơng phải protein thường chất hữu đặc hiệu gắn chặt vào phần protein liên kết lỏng lẻo tách khỏi phần protein cho thẩm tích qua màng Một phức hợp hoàn chỉnh gồm apoenzyme coenzyme gọi holoenzyme Trong coenzyme trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác làm tăng độ bền apoenzyme yếu tố gây biến tính Cịn apoenzyme có tác dụng nâng cao hoạt tính xúc tác coenzyme định tính đặc hiệu enzyme 1.1.3 Phân loại enzyme http://www.web-books.com/MoBio/Free/Ch2E1.htm Dựa phản ứng xúc tác, Ủy ban danh pháp Liên minh quốc tế Hóa sinh Sinh học phân tử (IUBMB) đề nghị việc phân loại sau Oxidoreductases xúc tác cho loạt phản ứng oxy hóa giảm Các tên thường gặp bao gồm dehydrogenase, oxidase, reductase catalase Transferases xúc tác chuyển giao nhóm (acetyl, methyl, phosphate, vv) Các tên thường gặp bao gồm acetyltransferase, protein kinase methylase, polymerase Ba lớp đóng vai trị quan trọng quy định q trình tế bào Phản ứng hóa học họ thể tronghình 2-E-1 Polymerase điều cần thiết cho tổng hợp DNA RNA Hydrolases xúc tác phản ứng thủy phân phân tử chia thành hai nhiều phân tử nhỏ cách cho thêm nước Ví dụ phổ biến đưa Protease chia tách phân tử protein Ví dụ: HIV protease caspase HIV protease điều cần thiết cho nhân HIV không Caspase đóng vai trị quan trọng q trình apoptosis Nucleases chia tách axit nucleic (DNA RNA) Căn vào loại chất nền, họ chia thành RNase DNase RNase xúc tác thủy phân RNA DNase hành vi DNA Họ chia thành exonuclease endonuclease.Exonuclease tách khỏi nucleotide từ đầu DNA RNA Endonuclease chia tách DNA RNA trang web nội Phosphatase xúc tác dephosphorylation (loại bỏ nhóm phosphate) Ví dụ:calcineurin Các ức chế miễn dịch thuốc FK506 Cyclosporin A chất ức chế calcineurin Lyases xúc tác phân tách CC, CO, CS CN trái phiếu phương tiện khác so với thủy phân trình oxy hóa Tên gọi thơng thường bao gồm decarboxylase, aldolase Isomerase xúc tác tái xếp nguyên tử phân tử Ví dụ rotamase, isomerase disulfide protein (PDI), epimerase racemase Ligases xúc tác cho phản ứng mà tham gia hai phân tử Các ví dụ bao gồm enzym tổng hợp peptide, aminoacyl-tRNA synthetase, DNA ligase RNA ligase 1.1.4 Trung tâm hoạt động enzyme[2]co nga Trung tâm hoạt động enzyme phần phân tử enzyme trực tiếp kết hợp với chất, tham gia việc tạo thành chuyển hóa phức chất trung gian enzyme chất để tạo thành sản phẩm phản ứng Trung tâm hoạt động bao gồm nhiều nhóm chức khác amino acid, phân tử nước liên kết nhiều có cofactor hữu (coenzyme) vơ Theo quan niệm Fisher trung tâm hoạt động enzyme hình thành sẵn với cấu tạo định cho phép chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào Do ví tương ứng ”ổ khóa với chìa khóa” Cịn theo Koshland đặc điểm vùng trung tâm hoạt động mềm dẻo linh hoạt , nhóm chức trung tâm hoạt động enzyme tự chưa tư sẵn sàng hoạt động, tiếp xúc với chất, nhóm chức phần trung tâm hoạt động phân tử enzyme thay đổi vị trí khơng gian, tạo thành hình thể khớp với hình thể chất Cũng vậy, người ta gọi mơ hình mơ hình “tiếp xúc cảm ứng” “khớp cảm ứng” Giữa chất trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, dễ dàng bị cắt đứt trình phản ứng để giải phóng ezyme sản phẩm phản ứng 1.1.5 Tính đặc hiệu enzyme[2] co thnah nga Mỗi enzyme có khả xúc tác cho chuyển hóa hay số chất định theo kiểu phẩn ứng định Đặc tính tác dụng lựa chọn cao gọi tính đặc hiệu tính chuyên hóa enzyme Tính đặc hiệu đặc tính quan trọng enzyme Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu: đặc hiệu kiểu phản ứng đặc hiệu chất 1.1.5.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng Phần nhiều enzyme có tính đặc hiệu với loại phản ứng định Những chất có khả xảy nhiều loại phản ứng hóa học loại phản ứng phải enzyme đặc hiệu xúc tác Ví dụ: Amino acid có khả xảy phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin cách oxy hóa phản ứng vận chuyển nhóm amin Vì phản ứng cần có enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ tự decarboxylase, aminoacid oxydase aminotransferase 1.1.5.2 Đặc hiệu kiểu chất Mỗi enzyme xúc tác cho chuyển hóa chất định Mức độ đặc hiệu chất enzyme khác không giống nhau, người ta thường phân biệt thành mức sau: a) Đặc hiệu tuyệt đối Một số enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa chất định xúc tác cho phản ứng mà thơi Ví dụ: Urease phân giải ure, ngồi cịn hydroxyure tốc độ thấp 120 lần b) Đặc hiệu nhóm tuyệt đối Các enzyme tác dụng lên chất có kiểu cấu trúc phân tử, kiểu liên kết có yêu cầu xác định nhóm nguyên tử phần liên kết chịu tác dụng Ví dụ:Maltase thuộc nhóm α-glucosidase xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết glucoside tạo thành từ nhóm OH glucoside αglucose với nhóm OH monose khác c) Đặc hiệu nhóm tương đối Mức độ đặc hiệu enzyme thuộc nhóm nhóm Enzyme có khả tác dụng lên kiểu liên kết hóa học định phân tử chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo phần tham gia tạo thành mối liên kết Ví dụ: Lipase có khả thủy phân tất mối liên kết este d) Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể) Hầu tất enzyme có tính đặc hiệu khơng gian chặt chẽ, nghĩa enzyme tác dụng với hai dạng đồng phân khơng gian chất Ví dụ: Phản ứng khử nước malic acid để tạo thành fumaric acid tác dụng fumarathydratase xảy L-malic acid mà không tác dụng lên D-malic acid 1.2 Tổng quan enzyme protease 1.2.1.Giới thiệu chung protease 1.2.1.1 Định nghĩa enzyme protease Protease enzyme thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-)n phân tử protein giải phóng acid amin, pepton ditripepton Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme protease 1.2.1.2 Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) Protease [7] Trong TTHĐ Protease vi sinh vật gốc acid amin đặc trưng cho nhóm cịn có số gốc acid amin khác Các kết nghiên cứu chung TTHĐ số Protease vi sinh vật cho phép rút số nhận xét chung sau: - TTHĐ Protease đủ lớn bao gồm số gốc aa số trường hợp cịn có cofactơ kim loại + Các Protease kim loại có TTHĐ lớn vào khoảng 21 0A, phân biệt thành sáu phần TTHĐ (subsite), phần TTHĐ tương ứng với gốc aa phân tử chất + Đối với Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ tinh thể Protease acid Phizopus chinenis Endothia parasilica cho thấy phân tử Protease gồm có hai hạt, chúng có khe hở vào khoảng 20 0A Khe hở phần xúc tác E, gốc Asp-35 Asp-215 xếp đối diện khe - Đối với Protease khơng chứa cysteine, TTHĐ chúng có tính mềm dẻo cấu trúc khơng gian chúng không giữ vững cầu disulphide Mặc dù TTHĐ Protease vi sinh vật có khác enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo chế chung sau: E+S enzyme – S enzyme – S + P1 enzyme + P2 Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme Trong đó: E: enzyme, S: chất, enzyme - S: Phức chất enzym- chất, P 1: Là sản phẩm phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai phản ứng 1.2.2 Phân loại protease http://www.scribd.com Sơ đồ phân loại enzyme protease: Peptidase ( protease) Exopeptidase Endopeptidase Aminopeptidase Serine proteinase Carboxypeptidase Cystein proteinase Aspartic proteinase Metallo proteinase Hình 1.3 Sơ đồ phân loại protease Protease phân chia thành hai loại: endopeptidase exopeptidase * Dựa vào vị trí tác động mạch polypeptide, exopeptidase phân chia thành hai loại: + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu N tự chuỗi polypeptide để giải phóng amino acid, dipeptide tripeptide + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu C chuỗi polypeptide giải phóng amino acid dipeptide * Dựa vào động học chế xúc tác, endopeptidase chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: proteinase chứa nhóm –OH gốc serine trung tâm hoạt động có vai trị đặc biệt quan trọng hoạt động xúc tác enzyme + Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trung tâm hoạt động Như: papayin, bromelin, vài protein động vật proteinase ký sinh trùng + Aspartic proteinase: Hầu hết aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Có chứa nhóm carboxyl trung tâm hoạt động thường hoạt động mạnh pH trung tính + Metallo proteinase: Là nhóm proteinase tìm thấy vi khuẩn, nấm mốc vi sinh vật bậc cao Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính hoạt độ giảm mạnh tác dụng EDTA Ngoài ra, protease phân loại cách đơn giản thành ba nhóm: - Protease acid: pH 2-4 có nhiều tế bào động vật, nấm men, thấy vi khuẩn - Protease trung tính có pH 7-8 papain từ đu đủ, bromelain từ dứa - Protease kiềm có pH 9-11 * Ngồi phân thành loại khác: - Enzyme protease nội bào enzyme tiết từ bên ngồi ngoại biên màng protein trích ly vào mơi trường kỹ thuật trích ly - Enzyme protease ngoại bào thu nhận từ trình lên men, q trình lên men mơi trường rắn Enzyme thu nhận q trình lên men hồn tất trình lên men diễn 1.2.3 Tình hình nghiên cứu enzyme protease http://bookluanvan.vn/f52/ung-dung-cuaenzyme-protease-trong-san-xuat-bia-30369/?langid=1 1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu enzyme nước Hầu phản ứng hoá học thể sống cần phải có vai trị xúc tác enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vậy, nghiên cứu enzyme thu hút quan tâm cán hoá sinh học, sinh học thực nghiệm nhiều nhà nghiên cứu lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh enzyme, tạo chế phẩm có độ khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan cấu trúc hoạt tính sinh học enayme, khả ứng dụng enzyme thực tế [3] Và gần sáng tạo mẽ, mang tính ứng dụng lớn sử dụng rộng rãi như: + Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm Protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)” thực năm 2006 Nghiên cứu khảo sát q trình trích ly tinh enzyme Protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti) Dịch chiết protease kiềm thu từ ruột có tổng hoạt tính cao 15,79UI/gCKNT (chất khơ nội tạng) điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút [14] + Tối ưu số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp QN6 sinh tổng hợp Prơtease thực Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH chứng minh điều kiện thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp QN6 sinh tổng hợp Prơtease [15] + Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh tiến hành “Tinh khảo sát đặc điểm Serine Protease từ Trùn Quế” ( 2007) Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn protease dịch chiết enzyme thơ tinh sơ tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ khoảng 30-80% Nhiệt độ pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động chất casein 55 0C pH khoảng kiềm 10 -12 [16],[4] Thường hợp chất hữu chủ yếu gluxit, tùy thuộc vào đặc tính enzyme nịi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp - Có nhiều hợp chất hydratcacbon hợp chất khác nguồn cacbon thích hợp nấm mốc sinh enzyme Protease có hoạt lực cao Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease Asp oryzae 79có thể theo thứ tự: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza - Tinh bột nguồn cacbon nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease b) Nguồn nitơ [1] Nguồn nitơ sử dụng phong phú, bao gồm nhóm: vơ hữu Đối với số loài nấm mốc thuộc họ (A oryzae, A awamori, A niger, A flavus) mơi trường có nguồn nitơ hữu sinh tổng hợp Protease axit cao Nhiều kết nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme nâng cao mơi trường có đồng thời nguồn nitơ hữu nitơ vô Cho thêm vào mơi trường có cám mì, bột đậu tương tách chất béo, nguồn nitơ hữu hoạt lực enzyme Protease tăng 2274% Còn trường hợp dùng nguồn nitơ vô môi trường dẫn đến ngừng sinh tổng hợp Protease nói chung Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật Glyxin, alanin, metionin lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực Protease chủng đột biến A oryzae 251- 90 đến 6- 9% nguyên chủng A oryzae 132- 63 tới 7- 24% Ngoài ra, bazơ purin A (adenin), G (guanin) dẫn xuất chúng, ARN sản phẩm thuỷ phân làm tăng đáng kể sinh tổng hợp proteinza VSV c) Nguồn nguyên tố khống yếu tố kích thích sinh trưởng [1] ... subtilizin… [11] Các Protease vi sinh vật ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, từ năm 1918- 1919 Waksman phát khả phân giải Protein Xạ khuẩn Trong 10 năm số cơng trình nghiên cứu Protease vi sinh vật tăng lên... vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh, … - Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm, … 1.3 Tổng quan vi sinh vật 1.3.1 Giới thiệu chung vi. .. tách chiết nghiên cứu Thời gian gần nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu Protease vi sinh vật đạt nhiều thành tựu to lớn lĩnh vực (Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu enzyme toàn