Đang tải... (xem toàn văn)
Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus. Chúng tôi sử dụng phương pháp đếm số lượng tế bào, xác định hoạt độ enzyme amylase, protease và khả năng tạo độ chua của
1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, người có xu hướng trở dần với tính chất thiên nhiên thơng qua việc sử dụng số chất có hoạt tính sinh học hay phương pháp sinh học để ứng dụng công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường để chữa bệnh Lý đơn giản người hiểu mặt trái sử dụng chất hóa học, chất kháng sinh Những chất có hiệu nhanh chóng hậu mà mang lại lớn Trong chăn nuôi nuôi trồng thủy sản trước người ta thường dùng chất kháng sinh để phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm tôm, cá Việc sử dụng kháng sinh thời gian dài để lại nhiều hậu không mong muốn kháng thuốc vi khuẩn rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng dẫn đến khó điều trị Nghiêm trọng tồn dư kháng sinh thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại lớn chăn nuôi Để khắc phục tình trạng này, nhà khoa học nghiên cứu sử dụng trực tiếp vi sinh vật sống, có lợi thường gọi “probiotic” Kết chứng minh lợi ích vi khuẩn có lợi việc phịng điều trị số bệnh chăn nuôi, thủy sản cho người Điều quan trọng khơng để lại hậu hay di chứng sử dụng loại hóa chất thuốc kháng sinh Xuất phát từ vấn đề tiến hành đề tài “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ chăn nuôi thủy sản 1.2 MỤC ĐÍCH Xác định mơi trường tối ưu vi khuẩn Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng chăn nuôi thú y nuôi trồng thủy sản 1.3 YÊU CẦU 1.3.1 Đối với Bacillus subtilis Thực việc nuôi cấy Bacillus subtilis nhiều loại môi trường khác để xác định xem môi trường làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease amylase nhiều Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Kiểm tra chất lượng chế phẩm vừa sản xuất sau thời gian bảo quản 1.3.2 Đối với Lactobacillus acidophilus Phân lập từ chế phẩm Antibio Hàn Quốc sản xuất Tìm mơi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối độ chua cao Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Kiểm tra chất lượng chế phẩm vừa sản xuất sau thời gian bảo quản Phần TỔNG QUAN 2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1 Lịch sử Bacillus subtilis phát lần phân ngựa vào năm 1941 tổ chức y học Nari Đức Lúc đầu chủ yếu sử dụng để phòng bệnh lị cho binh sĩ Đức chiến đấu Bắc Phi Năm 1949 – 1957 Henry cộng tách chủng khiết Bacillus subtilis Từ “Subtilistherapie” có nghĩa thuốc subtilin đời trị chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy rối loạn tiêu hóa 2.1.2 Phân loại đặc điểm 2.1.2.1 Phân loại Theo khóa phân loại Bergey vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.1.2.2 Đặc điểm Vi khuẩn Bacillus subtilis trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dng (G+), kớch thc 0,5 - 0,8 àm ì 1,8 – µm Đứng thành Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis chuỗi ngắn đơn lẻ, di động, sinh bào tử nhỏ tế bào vi khuẩn nằm tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8 µm Phát triển cách nảy chồi nứt bào tử Chúng loại vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng 36 - 50oC, tối đa khoảng 60oC, bào tử chịu nhiệt cao Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển Bacilluss subtilis 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000) Chúng phân bố rộng rãi ngoại cảnh, bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây) Một đặc điểm dùng để phân biệt với vi khuẩn khác làm tan chảy gelatine nhanh chóng Sữa cấy Bacillus subtilis trước tiên sau cấy men lactic trở nên acid nhanh chóng sữa cấy men lactic Vi khuẩn tác động protease làm hình thành paraprotein từ casein, sữa cấy Bacillus subtilis bị kết tủa cho vào clorua calci (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) Khi nuôi cấy môi trường thạch đĩa Bacillus subtilis có khuẩn lạc trịn, khơng hay phân tán Đường kính khuẩn lạc – mm, phát triển chậm, màu vàng xám sậm màu, rìa có cưa Sau – ngày bề mặt nhăn nheo, màu nâu Trong môi trường canh (nutrian broth) chúng phát triển làm đục môi trường, tạo thành màng nhăn bề mặt, lắng cặn, khơng tạo nhớt Bacillus subtilis cho số phản ứng sinh hóa: Lên men không sinh loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose Indol (-), VP (+), nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), có khả di động hiếu khí 2.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LACTIC Theo hệ thống phân loại Bergey năm 1979 vi khuẩn lactic phân loại sau: Họ: Lactobacteriaceae Họ phụ: Streptococcaceae Giống: Streptococcus Leuconostoc Họ phụ: Lactobacteriaceae Giống: Lactobacterium 2.2.1 Giới thiệu vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 2.2.1.1 Lịch sử Lactobacillus acidophilus lần phân lập Moro (1900) từ phân trẻ sơ sinh qua phẫu thuật Ơng mơ tả đặc điểm trao đổi chất, phân loại chức vi khuẩn Năm 1906 Metchnikoff xuất “The prolongation of life optinistic studies” Ông chứng minh vi khuẩn lactic yoghurt bulgarian nhân tố chống lại thối rữa ruột lão hóa Tuy nhiên sau người ta khám phá chủng vi khuẩn khơng thể sống sót qua dày ruột Do người ta nhanh chóng thay chủng vi khuẩn chủng L acidophilus probiotic ruột Họ thấy có nhiều vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình dị hình sống ruột, miệng âm đạo chiếm ưu số lồi Lactobacillus lên men đồng hình tạo thành nhóm gọi phức hợp Lactobacillus acidophilus 2.2.1.2 Đặc điểm Lactobacillus acidophilus thuộc họ vi khuẩn lactic Chúng có dạng trực khuẩn dài chịu nhiệt Tế bào hình que, đầu trịn, kích thước 0,6 - 0,9 × 1,5 – µm đứng riêng rẻ, xếp thành đôi hay thành chuỗi ngắn, không di động, không sinh bào tử, tế bào non bắt màu Gram dương nhuộm, tế bào già trở thành Gram Hình 2.2 Lactobacillus acidophilus âm Vi hiếu khí, nhiệt độ thích hợp 37oC, khơng phát triển 20 - 22oC 43 - 48oC Trên môi trường nước chiết cà chua hay nước chiết nấm men khuẩn lạc có dạng trịn, nhỏ dày đục mép ngồi Trong mơi trường thạch sâu khuẩn lạc nhỏ có hình dạng khơng ổn định Trên mơi trường thạch nghiêng khuẩn lạc khơ, phát triển giới hạn theo vết cấy Lên men lactic đồng hình, tích tụ 2,2% acid lactic mơi trường, không phát triển môi trường hydratcarbon, môi trường khoai tây, phát triển tốt môi trường dịch thể cao nấm men L acidophilus dạng probiotic sử dụng thường xuyên Là vi khuẩn có lợi cư trú ruột, âm đạo, phân người động vật Chúng có khả sinh Bacteriocin chất có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột L acidophilus có khả lên men loại đường: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose không lên men xylose, arabinose, ramnose, glycerol, mannitol, sorbitol, inositol Cho phản ứng: methyl red (+), indol (-), VP (-), citrate (-), catalase (-), khả đơng vón sữa (+) 2.2.1.3 Quá trình trao đổi chất Hiện thành viên phức hợp Lactobacillus acidophilus phân vào nhóm lên men đồng hình bắt buộc Hexose lên men để tạo thành acid lactic theo đường EMP Chúng có enzyme aldolase thiếu phosphoketolase, không lên men gluconat pentose Tất loài tạo đồng phân dạng D L acid lactic (Lê Thị Hồng Tuyết, 2004) 2.2.1.4 Sự thay đổi thành phần sữa trình lên men Trong trình lên men sữa tạo thành sản phẩm sữa chua có thay đổi sâu sắc loại đường, casein thành phần khác Sự thay đổi đường sữa Vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển hóa lactose thành glucose galactose Lactase endoenzyme nên lactose muốn chuyển hóa phải qua màng vi khuẩn Lactose chuyển hóa theo hai đường: Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase (hay enzyme galactosidase) để bẻ gãy H chuyển lactose thành glucose galactose Lactose oxi hóa thơng qua enzyme lactosehydrogenase thành lactosebionat sau phân giải tiếp thành gluconat galactose qua giai đoạn diễn biến phức tạp, giai đoạn enzyme chuyên biệt phụ trách Sự thay đổi protein sữa Trong trình lên men, lượng acid hữu loại tích lũy làm tăng q trình tách calci khỏi casein tạo pH đẳng điện Do đó, casein bị vón lại làm tăng q trình lên men tạo pepton sản phẩm khác Con đường chuyển hóa chủ yếu q trình lên men sữa Lactose glucose galactose ATP ADP ATP ADP Glucose-6 phosphat e Fructose-6 phosphat Fructose-1,6 phosphat Glyceraldehyd-3 phosphat NAD+ NADH Dihydroxyaceton phosphat 1,3 diphosphoglycerat ADP ATP acid pyruvic 2H acid malic + +2H CO2 + Aldehyd acetic citric acid lactic -CO2 Acetyl- CoA Chu trình acid citric Rượu etylic acid propionic acid malic 2.2.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược nhiều chế biến bảo quản thực phẩm 2.2.2.1 Trong công nghiệp Vi khuẩn lactic sử dụng để lên men thu acid lactic Có vị chua dễ chịu có đặc tính bảo quản nên làm gia vị loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt Chúng dùng để acid hóa rượu vang hoa nghèo acid, ngồi cịn sử dụng cơng nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn chất dẻo 2.2.2.2 Trong nông nghiệp môi trường Vi khuẩn lactic có khả hạn chế phát triển Fusarium loại nấm gây bệnh quan trọng nông nghiệp Nấm Fusarium phát triển làm yếu hội gây bệnh cho trồng Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh có góp phần vi khuẩn lactic Hiệu chế phẩm cải tạo đất, tăng suất trồng giải vấn đề ô nhiễm môi trường 2.2.2.3 Trong y dược Vi khuẩn lactic sử dụng y học để chữa bệnh đường ruột, dùng phẫu thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa… 2.2.2.4 Trong bảo quản chế biến thực phẩm Trong bảo quản chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic sử dụng để làm dưa chua, làm chua mà không làm màu tự nhiên Dùng sản xuất tương, đậu phụ hay lên men sữa chua 2.3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI SINH VẬT Trong q trình ni cấy vi sinh vật mơi trường lên men phải có chứa đầy đủ thành phần sau (Lê Xuân Phương, 2001) Glucid: Là nguồn dinh dưỡng quan trọng để vi sinh vật thực trình trao đổi chất xây dựng đổi mới, ngồi glucid cịn đóng vai trị chủ chốt việc tạo lượng cho tế bào Glucid thường sử dụng dạng dịch chiết có đường, mật rỉ, tinh bột (phải thủy phân thành đường trước lên men) Phosphat vơ cơ: Đóng vai trị quan trọng trao đổi lượng tổng hợp acid nucleic Trong lên men muối phosphat vô dùng phổ biến phosphat amon phosphat kali Nitơ: Tham gia vào trình tạo protein, acid nucleic chất có đặc tính sinh học khác tế bào vi sinh vật Nitơ thường sử dụng lên men dạng muối nitrat, hợp chất amon số chất có nguồn gốc vi sinh vật Các chất sinh trưởng nguyên tố vi lượng: Vitamin nguyên tố vi lượng chất cần thiết cho hoạt động sống vi sinh vật Chúng thường sử dụng với lượng nhỏ tác dụng lớn đa dạng thiếu hoạt động sống bình thường vi sinh vật 2.3.1 Đối với Bacillus subtilis 2.3.1.1 Tuyển chọn vi sinh vật có khả sinh enzyme cao Khơng phải tất vi sinh vật có khả sinh enzyme chủng giống khơng hoạt tính sinh tổng hợp enzyme Vì tuyển chọn vi sinh vật phải tiến hành tìm kiếm, phân lập lựa chọn hàng chục, hàng trăm giống vi sinh vật để có chủng có hoạt độ cao việc tạo thành enzyme cần thiết Người ta thấy enzyme thu nhận từ vi khuẩn có nhiệt độ tối ưu khả chịu nhiệt cao enzyme thu nhận từ nấm mốc (Lương Đức Phẩm, 1998) Trong đất có nhiều bào tử tế bào vi sinh vật số người ta nhận thấy vi khuẩn Bacillus subtilis có khả tổng hợp enzyme α-amylase protease 2.3.1.2 Nguyên liệu để sản xuất enzyme α-amylase từ vi khuẩn Nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme từ vi sinh vật nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm Vi sinh vật khơng địi hỏi q khắc khe yếu tố dinh dưỡng môi trường vi sinh vật tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận α-amylase dùng tinh bột, maltose, saccarose, glucose glycerin Ngồi người ta cịn cho thêm acid amin dạng phức hợp riêng chất (pepton, protein thủy phân dịch chiết mầm mạch, acid amin ) Nếu mơi trường có CaCO3 làm tác nhân điều chỉnh pH pepton α-amylase tổng hợp gấp hai lần Trong phân tử gam α-amylase Bacillus subtilis có 4g nguyên tử calci Trong thành phần dinh dưỡng ion Ca có tác dụng nâng cao khả tổng hợp α-amylase, làm ổn định enzyme có tác dụng bảo vệ enzyme protease (Lương Đức Phẩm, 1998) Trong môi trường dinh dưỡng vi sinh vật sinh enzyme nói chung cần phải có mặt nguyên tố khoáng dạng muối magie, phospho, kali, ion mangan, kẽm, nguyên tố vi lượng khác Nồng độ thích hợp để tổng hợp α-amylase MnSO4 0,05% Thiếu muối α-amylase khơng hình thành Hoạt độ α-amylase nâng cao nồng độ KH2PO4 1% Ion Mg2+ có tác dụng ổn định amylase nhiệt độ cao Lưu huỳnh có tác dụng đến sinh tổng hợp α-amylase Các nguồn lưu huỳnh acid amin (methionin, sistein, sistin) muối sunfat (trừ sunfat đồng), nguồn lưu huỳnh tốt methionin 10 2.3.1.3 Nguyên liệu để sản xuất enzyme protease từ vi khuẩn Trong mơi trường ni cấy vi sinh vật sinh protease cần phải có chất cảm ứng, nguồn nitơ hữu (bột ngơ, bột đậu tương, bột mì, cám mì, mầm mạch, dịch chiết nấm men, pepton, protein ) Vi khuẩn Bacillus subtilis tổng hợp protease có hoạt độ cao mơi trường có tinh bột, giảm nồng độ tinh bột từ – 2% hoạt độ protease giảm vài lần Ngoài nguồn nitơ hữu nguồn nitơ vơ ảnh hưởng đến khả tổng hợp protease HNO3, HNO2 Trong số nguồn nitơ vơ ta thấy có phosphat amon dibazic tốt Những muối khác NH 4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3, Ca(NO3)2 làm giảm hoạt độ protease tới 30 – 50% α-amylase giảm tới – 10 lần Trong mơi trường có nguồn nitơ hữu hoạt độ protease amylase thấp mơi trường đối chứng có (NH 4)2HPO4 nước chiết đậu tương (Lương Đức Phẩm, 1998) Các acid amin ức chế đến tổng hợp enzyme protease Bacillus subtilis methionin, acid glutamic, alanin, leucin 2.3.1.4 Phương pháp ni cấy vi sinh vật có khả sinh enzyme Phương pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển bề mặt môi trường Môi trường sử dụng môi trường lỏng sử dụng môi trường đặc (môi trường bán rắn) Môi trường lỏng vi sinh vật phát triển bề mặt môi trường tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng pha khí Vi sinh vật sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành q trình tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Ở môi trường đặc để tăng khả xâm nhập khơng khí vào lịng mơi trường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường Vi sinh vật phát triển bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường sinh tổng hợp enzyme nội bào ngoại bào Độ ẩm thích hợp mơi trường đặc 55 – 65% Ưu điểm phương pháp bề mặt dễ thực bị nhiễm vi sinh vật lạ thường xảy tượng nhiễm cục ta dễ dàng xử lý Nhưng nhược điểm tốn nhiều diện tích khó giới hóa, tự động hóa Phương pháp ni cấy chìm Phương pháp người ta sử dụng mơi trường lỏng thực thùng lên men Trong thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống ... ĐÍCH Xác định mơi trường tối ưu vi khuẩn Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng chăn nuôi thú y nuôi trồng thủy sản 1.3 YÊU CẦU 1.3.1 Đối với Bacillus. .. subtilis Thực vi? ??c nuôi cấy Bacillus subtilis nhiều loại môi trường khác để xác định xem môi trường làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease amylase nhiều Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis... chua cao Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Kiểm tra chất lượng chế phẩm vừa sản xuất sau thời gian bảo quản 3 Phần TỔNG QUAN 2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
