Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài được thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò b
1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Escherichia coli (E coli) vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu hệ vi sinh vật đường ruột người động vật Tuy nhiên, có điều kiện thích hợp, số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng người gia súc, đặc biệt gia súc non E coli xem vi khuẩn danh ô nhiễm thực phẩm nước dựa vào số lượng chúng E coli thải qua phân môi trường bên ngồi Nếu q trình vệ sinh E coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, q trình giết mổ Từ việc bảo quản chế biến thực phẩm khơng thích hợp ngộ độc thực phẩm E coli hồn tồn xảy E coli chia thành nhiều nhóm STEC, EPEC, ETEC, EAEC Trong đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E coli) mang nhiều gen độc lực gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh độc tố shiga gây hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uraemic syndrome) người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng tiêu chảy heo cai sữa Trong đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli ) mang gen lt sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) gen st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy người vật ni Nhóm EPEC (Enteropathogenic E coli) mang gen eae sản sinh protein intimin, … Trước đây, để phát E coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống Phương pháp gặp khó khăn tốn thời gian, dịch bệnh lây lan có kết Hơn nữa, E coli vi khuẩn bình thường đường ruột thường có mặt thực phẩm nên việc phân lập vi khuẩn E coli phân để tìm nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn thực phẩm hồn tồn khơng phản ánh khả gây độc chúng Do vậy, việc phát gen gây độc E coli kỹ thuật PCR bước cần thiết góp phần đánh giá nguy gây bệnh vật nuôi người PCR phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết thời gian ngắn, kịp thời phát mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại dịch bệnh Do đó, đồng ý Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm TP HCM, hướng dẫn PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang, thực đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát gen độc lực vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy thịt bò” 1.2 Mục tiêu - Phát số gen độc lực E coli kỹ thuật multiplex – PCR từ mẫu phân tiêu chảy bò, bê, heo mẫu bề mặt thịt bò 1.3 Mục đích - Góp phần chẩn đốn kiểm soát bệnh E coli gây cho động vật người Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn E coli 2.1.1 Định nghĩa - Vi khuẩn Escherichia coli tên đặt theo tên nhà bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông người phân lập mô tả vi khuẩn vào năm 1885 - Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ thống phân loại Bergey) - E coli trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng 1,5 m x 0,5 m, khơng hình thành bào tử có giáp mơ (Trần Thanh Phong, 1996) E coli có mặt thường xuyên chiếm ưu ruột người động vật máu nóng, phần cuối ruột non ruột già Nó vừa vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa vi khuẩn gây nhiều bệnh đường ruột quan khác 2.1.2 Nuôi cấy đặc điểm sinh hóa - Nhiệt độ ni cấy thích hợp 35 -37 oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu 7,2 – 7,4) - E coli phục hồi dễ dàng từ mẫu có nguồn gốc khác mơi trường chọn lọc 37oC điều kiện hiếu khí E coli thường phân lập môi trường Mac Conkey (MAC) eosin methylene blue agar (EMB) Trên môi trường thạch EMB, E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; môi trường thạch Mac Conkey, E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng Ngồi ra, ta sử dụng mơi trường SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol Trên môi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, nhầy, cịn nhóm E coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002) - E coli mọc tốt môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24 hình thành khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, trịn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng – 3mm - Trong môi trường lỏng, sau – giờ, E coli làm đục nhẹ mơi trường, để lâu đục, có mùi thối; sau vài ngày có ván mỏng mặt môi trường - Để phân biệt E coli vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate) E coli cho kết + + - (biotype 1) - + - - (biotype 2) (FAO, 1992) 2.1.3 Yếu tố kháng nguyên Phân loại huyết học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng nguyên H (flagellar) kháng nguyên bề mặt K (capsular) Có 700 loại serotype E coli công nhận dựa vào kháng nguyên O, H, K Theo Jay (2000), E coli có 200 type kháng nguyên công nhận tồn khoảng 30 type kháng nguyên H 2.1.4 Cơ chế chung khả gây tiêu chảy E coli Có ba chế chung khả gây tiêu chảy E coli: - Sản xuất độc tố: Gồm nhóm ETEC, EAEC, STEC - Tấn cơng – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC - Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm nhóm EPEC, EHEC Tuy nhiên, tác động qua lại thể vật chủ màng nhầy ruột đặc hiệu cho loại (Nataro Kaper, 1998) 2.1.5 Phân loại E coli Dựa đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, tác động khác lên màng nhày ruột, hội chứng lâm sàng bệnh khác mặt dịch tễ bệnh), E coli chia thành nhóm sau: STEC (Shiga toxin – producing E coli) VTEC (Vero toxingenic E coli) EHEC (Enterohaemorrhagic E coli) EPEC (Enteropathogenic E coli) EAEC (Enteroaggregative E coli) ETEC (Enterotoxigenic E coli) Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy: - EIEC (Enteroinvasive E coli) - DAEC (Diffusely adherent E coli) 2.1.5.1 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC a Danh pháp Những hướng khác nghiên cứu đưa danh pháp khác để đặt tên cho nhóm E coli này: - Tên gọi Verotoxigenic E coli Vero cytotoxin producing E coli (VTEC) Konowalchuk cộng đặt cho nhóm phát nhóm sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997 Tên gọi VTEC sử dụng rộng rãi Anh nhiều tổ chức khoa học Châu Âu - Tên gọi Enterohaemorrhagic E coli (EHEC) đặt dòng gây viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro Kaper, 1998) - Tên Shiga toxin - producing E coli (STEC) (trước gọi Shiga like toxin - producing E coli - SLTEC) rõ khả sinh độc tố gây độc tế bào giống độc tố Shiga (Calderwood ctv, 1997) Tên gọi STEC sử dụng nhiều tạp chí khoa học Mỹ STEC VTEC hai thuật ngữ tương đương hai nhóm E coli sản sinh hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào Mặc dù vậy, khơng phải có gen sản sinh độc tố gây bệnh khơng có yếu tố độc lực khác Những dòng E coli mang gen sản sinh độc tố diện ruột gia súc khỏe mạnh với số lượng ít, dòng thiếu vài hay tất yếu tố độc lực khác STEC (Beutin ctv, 1995) Do đó, khơng phải tất STEC có khả gây bệnh (Nataro Kaper, 1998) b Shiga toxin yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh STEC * Shiga toxin Những dịng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay gọi Verotoxins (VT) Shiga – like toxins (Slt) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm khơng phản ứng chéo với Stx1 Stx2, mã hóa gen stx1 stx2 Cả hai độc tố cấu tạo từ tiểu đơn vị B (được mã hóa stxB) tiểu đơn vị A (được mã hóa stxA) Cả hai gen stxA stxB định vị bacteriophage ơn hịa chèn vào nhiễm sắc thể (NST) STEC Một dòng STEC sản xuất độc tố Stx1, Stx2, hai, chí nhiều dạng Stx2 Ba dạng Stx2 xác định: Stx2, Stx2c, Stx2e (Pierard ctv, 1998) Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng heo gây bệnh người Nhưng dịng phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas ctv, 1994) Nhiều người ta thay thuật ngữ Stx VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood ctv, 1997) Hầu hết phương pháp chẩn đoán phân tử có mục tiêu phát gen mã hóa Stx nhóm STEC (Cocolin ctv, 2000) * Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh STEC Những yếu tố độc lực khác STEC enterohaemolysin (Ehly) heat – stable enterotoxin (EAST1) Gen mã hóa Ehly nằm plasmid 60 – MDa mà plasmid tìm thấy nhiều dòng O157:H7 diện dòng STEC khơng phải O157 Ở Đức, gần 90% dịng STEC phân lập từ bệnh nhân có gen mã hóa Ehly (Beutin ctv, 1994) Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly yếu tố độc lực khó đánh giá, nghiên cứu tác giả này, E coli có Stx âm tính Ehly dương tính nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 Hela in vitro (Beutin ctv, 1989) EAST1 mơ tả EAEC tìm thấy nhiều dòng STEC EAST1 mầm bệnh STEC khơng biết, liên quan đến số bệnh tiêu chảy khơng có máu thường xuyên tìm thấy người bị nhiễm STEC (Nataro Kaper, 1998) Yếu tố bám dính STEC đóng vai trị quan trọng cho vi khuẩn định vị tế bào ruột Đó intimin - loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Protein intimin mã hóa gen eae (E coli attaching effacing) Intimin gây tổn thương dạng bám dính phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ruột già vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg ctv, 1993) Gen eae tìm thấy nhóm EPEC Gen eae số gen nằm vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE STEC chứa gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ thể để vận chuyển intimin Tir (translocated intimin receptor) số gen khác Vùng LEE không điều kiện cần mà điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E Tuy nhiên, khơng phải tất STEC có gen eae, tất EHEC có gen eae (Nataro Kaper, 1998) Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác protein màng vi khuẩn (protein intimin) protein Tir Protein Tir tiết khỏi vi khuẩn, chuyển vị vào màng tế bào vật chủ (Kenny ctv, 1997) Hầu hết ổ dịch STEC gây dòng O157:H7, nên người ta cho serotype độc dễ lây truyền serotype khác Dấu hiệu sinh hóa cho dịng STEC O157:H7 lên men sorbitol không tạo - glucuronidase Vì thế, nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC dựa vào việc phát E coli không lên men sorbitol O157:H7 serotype O157 liên quan đến việc gây bệnh người gồm O26:H11, O103:H2, O111:H NM O113:H21 (WHO, 1994) c Nguồn lây nhiễm STEC tìm thấy phân nhiều lồi động vật trâu, bị, cừu, dê, heo, chó, mèo (Beutin ctv, 1993; Chapman ctv, 1997) ngựa (Chalmers ctv, 1997) chim hải âu (Makino ctv, 2000) Loài động vật quan trọng việc lây nhiễm cho người bò Đường lây nhiễm chủ yếu STEC vào chuỗi thực phẩm việc vấy nhiễm thành phần ruột phân trình giết mổ (Butler, 1996) STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước từ người sang người khác Hầu hết trường hợp bệnh ăn thực phẩm bị nhiễm, đặc biệt thực phẩm có nguồn gốc động vật Trong thịt bị ngun nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001) 2.1.5.2 Nhóm EPEC Thuật ngữ enteropathogenic E coli gọi tên Neter ctv (1955) để dòng E coli gây tiêu chảy trẻ em a Đặc điểm Cũng STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột gây hư hại (A/E); EPEC không sản xuất độc tố Shiga b Sự bám dính phá hủy (AE) dòng EPEC Dấu hiệu nhiễm bệnh EPEC hình thành bệnh tích kiểu A/E, quan sát mẫu sinh thiết ruột từ bệnh nhân hay thú bị nhiễm nuôi cấy tế bào (Nataro Kaper, 1998) Dạng tổn thương đặc trưng hư hại vi nhung mao kết dính chặt vi khuẩn màng tế bào biểu mô Tổn thương khác với dạng tổn thương ETEC Vibrio cholerae (ETEC V cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao) Gen cần thiết cho việc tạo tổn thương A/E gen eae mã hóa intimin Protein yếu tố độc lực cần thiết EPEC (Donnerberg ctv,1993) Theo Nataro Kaper (1998), gen eae diện tất chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium Hafnia alvei, không diện dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông thường c Dịch tễ nhiễm EPEC Cũng E coli gây bệnh khác, truyền lây EPEC qua đường miệng, với vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm Điểm đáng ý mặt dịch tễ bệnh EPEC phân bố lứa tuổi Bệnh thường biểu cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng trẻ em Người trưởng thành trẻ em lớn có phần đề kháng với bệnh mà nguyên nhân thụ thể đặc hiệu Tuy nhiên, EPEC gây tiêu chảy người lớn số lượng vi khuẩn đủ cao 2.1.5.3 Nhóm ETEC a Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm định độc lực độc tố ruột (enterotoxin) yếu tố định vị (colonization factor – CF) Độc tố ruột enterotoxin Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) độc tố ruột chịu nhiệt (LT) (1) Độc tố chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT): Độc tố LT E coli oligopeptide có liên hệ gần gũi mặt cấu trúc chức với độc tố gây bệnh tả người (cholera toxin – CT) Vibrio cholerae tiết LT CT giống nhiều đặc tính cấu trúc, trình tự acid amin (giống khoảng 80%), tương đồng thụ thể, hoạt tính enzyme, kiểu tác động động vật hay ni cấy tế bào LT có hai serogroup LT-I LT-II LT-I LT-II khơng có phản ứng chéo mặt miễn dịch - LT-I: Được tiết dòng E coli gây bệnh người thú LT-I oligopeptide khoảng 86 kDa, cấu tạo tiểu đơn vị A 28 kDa tiểu đơn vị B 11,5 kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm enzym, gồm peptide A1 peptide A2 liên kết cầu nối disulfur Những tiểu đơn vị B xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắn với ganglioside GM liên kết lỏng lẻo với GD1b vài glycoprotein ruột (các thụ thể LT) Hai loại LT-I có liên hệ gần phản ứng chéo phần với LTp (LTp-I) phân lập từ heo LTh (LTh- I) phân lập từ người Gen mã hóa cho LT elt hay lt-I nằm plasmid mà plasmid chứa gen mã hóa ST / gen mã hóa kháng nguyên yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA) Sau bám vào màng tế bào niêm mạc ruột vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập qua màng tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) tế bào cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng không hoạt động thành dạng hoạt động Điều dẫn đến phosphoryl kênh chloride hoạt động mức bình thường màng tế bào biểu mơ Kết kích thích tế bào mào ruột tiết Cl - cách tích cực, đồng thời ức chế hấp thu NaCl tế bào nhung mao (villus) Đây nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dội (Nataro Kaper, 1998) - LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I CT khoảng 55 – 57% tiểu đơn vị A, không giống với LT-I CT tiểu đơn vị B LT-II làm gia tăng cAMP tế bào qua chế tương tự LT-I, LT-II không liên quan đến bệnh người thú (2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST) Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ cầu nối disulfur giải thích cho khả chịu nhiệt độc tố ST chia thành hai nhóm STa STb Hai nhóm khác cấu trúc chế hoạt động Gen mã hóa cho hai nhóm tìm thấy chủ yếu plasmid vài gen mã hóa ST tìm thấy transposon Độc tố STa (hay gọi ST-I) ETEC sản sinh vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica V cholerae khơng phải O1 ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 EAEC Một số báo cáo gần cho vài dịng thuộc nhóm ETEC ngồi việc sản sinh STa, cịn sản sinh độc tố EAST1 Trong đó, STb tìm thấy ETEC - STa: STa peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử khoảng kDa STa chia thành hai loại STp (ST porcine STIa) từ E coli phân lập heo STh (ST human STIb) E coli phân lập người Cả hai độc tố tìm thấy dịng ETEC người Thụ thể STa enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C) STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động cuối dẫn đến gia tăng tiết Cl - / ngăn cản hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng ruột, gây tiêu chảy 10 - STb: STb chủ yếu tạo dòng ETEC phân lập từ heo, vài chủng ETEC phân lập từ người sản sinh STb Không STa, STb gây tổn thương mặt mô học lớp biểu mô ruột tế bào nhung mao lớp biểu mô ruột teo nhung mao phần Thụ thể STb chưa biết rõ gần người ta cho độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước vào bên tế bào Không gây tiết Cl - STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào STb cịn kích thích phóng thích PGE serotonin, từ người ta cho hệ thần kinh ruột liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây độc tố (Hitotsubashi ctv, 1992) Yếu tố định vị (colonization factor – CF) Cơ chế mà ETEC kết dính cư trú lớp màng nhầy ruột nghiên cứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lơng bề mặt vi khuẩn, gọi yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens) CFA phân loại dựa đặc tính hình thái Có loại gồm loại lơng hình que cứng, lơng hình que mềm dạng bó, lơng có cấu trúc mảnh mềm Có 20 loại CF ETEC người Hầu hết, chúng mã hóa gen nằm plasmid, nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra Svennerholm, 1996) Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội tiểu đơn vị có tính kháng ngun mạnh b Dịch tễ Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trẻ em bú nước phát triển tiêu chảy khách du lịch Dịch tễ bệnh ETEC định nhiều yếu tố: (1) miễn dịch màng nhầy khác cá thể nhiễm ETEC, (2) người nhiễm khơng có biểu triệu chứng thải lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm đạt liều gây nhiễm cao Ba đặc tính tạo nên tình trạng nhiễm ETEC mơi trường vùng có dịch hầu hết trẻ em vùng đương đầu với ETEC thời kì thơi bú Trẻ em tuổi đến trường người lớn có nguy tiêu chảy ETEC thấp Dòng ETEC sản sinh ST nguyên nhân hầu hết trường hợp bệnh ... ? ?Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát gen độc lực vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy thịt bò? ?? 1.2 Mục tiêu - Phát số gen độc lực E coli kỹ thuật multiplex –. .. mẫu Phân bò Phân tiêu Phân bê chảy Phân heo Thịt Bò Tổng cộng Số lượng 10 9 36 3.3.2 Nuôi cấy, phân lập ly trích DNA vi khuẩn E coli 3.3.2.1 Mơi trường nuôi cấy - Môi trường nuôi cấy, phân lập vi. .. trích DNA E coli phân lập - Thực phản ứng multiplex – PCR để phát gen gây độc E coli 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Lấy mẫu - Mẫu phân tiêu chảy Được lấy từ trực tràng tăm cho vào môi trường