Đang tải... (xem toàn văn)
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
VIII.Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Bn chất của kỹ thuật PCR (phn ứng chuỗi trùng hợp, phn ứng chuỗi nhờ polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh chưa từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt (máy PCR). Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh 1985 Khỏi nim Các yêu cầu cần thiết cho PCR 2 mồi (primer) tổng hợp oligonucleotide ( mỗi mồi có khong 20 30 nucleotide) có trỡnh tự bổ sung với trỡnh tự ở 2 đầu của đoạn ADN cần nhân dòngADN khuụn (đoạn ADN cần nhõn dũng)ADN polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase, có thể chịu được nhiệt độ tới 95 0C hoặc cao hơn) 4 loại nucleotide dATP, dGTP, dCTP, dTTP Mg++, dung dch m thớch hp, pH, . Khuôn ADN được biến đổi thành 2 sợi đơn (94 0C, 5 phút)Gắn primer vào đầu đoạn ADN (55 0C, 30 giây)Tổng hợp chuỗi ADN mới (65-75 0C, 2-5 phút)Biến đổi để tách sợi ADN mới thành 2 đơn (94 0C, 30 giây)Chu trình PCR Việc thiết kế mồi cần phải có thông tin về trình tự ADN cần nhân dòng Các lưu ý khi thiết kế mồi cho PCR : Mồi có trảnh tự phù hợp với khuôn, khoảng cách giữa các mồi xuôi và ngược không dài quá 1 kb Tránh hiện tựợng tự bắt cặp giữa các mồi mồi xuôi và ngược cần có trình tự không bổ sung với nhau Có khoảng 45- 60% G/C Các mồi có kích thước ít khác nhau, có Tm (nhiệt độ gắn mồi) gần giống nhau tăng hiệu quả của PCR Thiết kế primer cho PCR Các yếu tố ảnh hưởng đếnTm của primer:•Chiều dài của primer•Hàm lượng G/C •Đối với các primers có 15 - 26 nucleotides, tính Tm theo công thức Wallace (1989): •Tm = [2(A+T) + 4(G+C)] ° C . VIII .Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Bn chất của kỹ thuật PCR (phn ứng chuỗi trùng hợp, phn ứng chuỗi. hiện trong máy chu kỳ nhiệt (máy PCR) . Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh 1985 Khỏi nim Các yêu cầu cần thiết cho PCR 2 mồi (primer) tổng hợp oligonucleotide