TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP -Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37 ±1 o C trong thời gian từ 24- 48 giờ. Số lượng vi khuẩn hiếu khi trong 1g hoặc 1ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm đựơc từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng. PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi THIẾT BỊ DỤNG CỤ Các thiết bị thông thường của phòng VSV thực phẩm: • Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm • Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn. • Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1 o C. • Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 ±1 o C. • Tủ sấy khô. • Nồi hấp áp lực . • Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml. • Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn . • pH met hoặc giấy đo pH. HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG • Thạch dùng cho vi sinh vật • Pepton dùng cho vi sinh vật • Muối tinh khiết (NaCl) • Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4) • Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4) • Natri hydroxit tinh khiết (NaOH) • Cao thịt. • Cao men • Trypton • Glucose tinh khiết CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ • Chuẩn bị môi trường - Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110 o C/30 phút hoặc 121 o C/15 phút). • Chuẩn bị mẫu - Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. • Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH • Pha loãng mẫu - Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, trộn đều để thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo • Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy 2 đĩa petri và dùng một pipet đã tiệt khuẩn riêng. • Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri, mỗi đậm độ nuôi cấy vào 2 đĩa petri • Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ±1 o C trong điều kiện vô khuẩn. Rót vào từng đĩa 12-15ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. • Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang. • Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút • Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên bề mặt • Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 37 ± 1 o C từ 24- 48 giờ. ĐỌC KẾT QUẢ • Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức. • Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy. TÍNH KẾT QUẢ dnn C ).1,0( 21 + ∑ Chọn những đĩa có từ 15-300 khuẩn lạc của hai đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả N = TÍNH KẾT QUẢ • C:Số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn • n 1 ,n 2 : Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ hai • d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất • Sau đó làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n ( n là số mũ thích hợp của 10). VD: - Ở đậm độ pha loãng 10 -2 có 150 và215 khuẩn lạc - Ở đậm độ pha loãng 10 -3 có 16 và 25 khuẩn lạc 150+215+16+25 N = ---------------------- = 18480 = 1,8 x 104 CFU/g/ml (2+0,1 x 2) x 10 -2 * Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng, VD - Ở đậm độ pha loãng 10 -2 có 180 và 250 khuẩn lạc - Ở đậm độ pha loãng 10 -3 có 60 và 75 khuẩn lạc Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn (10 -2 )để tính kết quả. 180 + 250 N = --------------- = 21500 2 x 10-2 Kết quả: 2,0 x102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm * Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu (10 -1 ) có ít hơn 15 khuẩn lạc, tính kết quả theo trung bình cộng các khuẩn lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính cho 1g hay 1ml sản phẩm. VD - Ở đậm độ pha loãng 10 -1 của sản phẩm đặc có 12 và 8 khuẩn lạc - Ở đậm độ pha loãng 10 -2 có 6 và 7 khuẩn lạc Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn 10 -2 để tính kết quả. 12 + 8 N = --------------- = 100 2 x 10-1 Kết quả :1,0 x 102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm * Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như sau: - Ít hơn 1 vi sinh vật hiếu khí trong 1ml sản phẩm loãng - Ít hơn 1x1/d vi sinh vật hiếu khí trong 1g sản phẩm khác d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu (thường là10 -1 ) BÁO CÁO KẾT QUẢ • Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được số vi khuẩn hiếu khí có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm kiểm tra • Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của phương pháp từ 12 đến 37% . như sau: - Ít hơn 1 vi sinh vật hiếu khí trong 1ml sản phẩm loãng - Ít hơn 1x1/d vi sinh vật hiếu khí trong 1g sản phẩm khác d: hệ số pha loãng của đậm. TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP -Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt