MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT 1. Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn hydratcarbon duy nhất. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi màu của chỉ thị màu – Cấy vi khuẩn vào môi trường Citrat Simmons, ủ 35 – 37 o C/24 h – Phản ứng dương tính: màu xanh nước biển – Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu • E. coli • Enterobacter aerogenes • Dương tính: môi trường đổi màu xanh lá cây sang xanh nước biển • Âm tính: không đổi màu 2. Thử nghiệm Catalase Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý - Lấy một ít vi khuẩn vào que cấy và nhúng vào giọt H 2 O 2 . Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện Phản ứng âm tính (-): không có bọt khí xuất hiện - Không nên sử dụng vi khuẩn cấy trên thạch máu vì dễ dương tính giả 3. Thử nghiệm Oxydase Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzym cytochrome c oxidase của vi khuẩn - Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae và Campylobacter jejuni là những vi khuẩn gây bệnh có Oxydase (+) - Lấy một ít chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần bôi lên một tờ giấy lọc. Nhỏ thuốc thử(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) - Phản ứng dương tính: có màu tím. Đọc kết quả trong vòng 10 giây đầu • Phản ứng Oxydase sử dụng thuốc thử (N,N,N',N'-tetramethyl-p- phenylenediamine dihydrochloride) • Phản ứng dương tính: có màu tím. • Phản ứng xuất hiện trong vòng 10 giây đầu. 4. Thử nghiệm phân giải Ure Nguyên tắc: phát hiện enzym urease phân giải urea thành ammonia và carbondioxide. Ammonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường. – Là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus. – Cấy vi khuẩn vào canh thang Ure. Ủ 37 o C/24 – 48 h – Phản ứng dương tính: môi trường có màu tím đỏ. Phản ứng âm tính: không chuyển màu • Dương tính: môi trường chuyển thành màu tím • Âm tính: không màu 5. Thử nghiệm Coagulase (đông huyết tương) Nguyên tắc: Phát hiện sự có mặt của men Coagulase bằng phản ứng đông huyết tương thỏ – Là phản ứng phân biệt tụ cầu gây bệnh và không gây bệnh – Cho vào ống nghiệm 0,5 ml huyết tương thỏ và 0,5 ml dịch cấy vi khuẩn. Ủ ấm 37 o C/4-24h – Phản ứng dương tính: xuất hiện khối đông tụ. Nếu sau 24h không thấy xuất hiện khối đông tụ: phản ứng âm tính. Dương tính: hình thành khối đông huyết tương 6. Thử nghiệm sinh Idol Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzym tryptophanase chuyển hóa trypton tạo thành indol - Cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ 37 o C/24 h - Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, phản ứng dương tính: có vòng màu đỏ cánh sen nổi lên trên (do Indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal dehyde trong thuốc thử Kovacs), nếu không có màu hoặc màu vàng: phản ứng âm tính - Với các chủng sinh Indol chậm: thử sau 48 h – Dương tính: màu đỏ cánh sen – Âm tính: màu vàng 7. Thử nghiệm MR Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid bền. - VK có phản ứng MR dương tính: pH môi trường ngày càng giảm - VK có phản ứng MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính acid tạo thành lại chuyển hóa tạo thành các sản phẩm trung tính) - Cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP. Ủ 37 o C từ 2-5 ngày - Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay. Phản ứng (+) có màu đỏ, âm tính màu vàng 8. Thử nghiệm VP Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzym chuyển hóa 2,3 butanediol thành acetoin khi có ô xy và chuyển hóa tiếp acetoin thành diacetyl – Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diacetyl – guanidin có màu đỏ – Cấy vi khuẩn vào môi trường MR – VP. Ủ 37 o C/24 – 48 h – Nhỏ 6 giọt thuốc thử A (5% α naphtol) và 2 giọt thuốc thử B( KOH 40%). Lắc nhẹ – Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 h – Phản ứng (+): có màu đỏ trên mặt môi trường 9. Thử nghiệm lên men đường Nguyên tắc:Vi khuẩn có khả năng lên men đường sẽ làm giảm pH dẫn đến thay đổi màu của môi trường * PHƯƠNG PHÁP MPN: - Định lượng các vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose sinh hơi - Cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng chọn lọc có ống Durham. Ủ 37 o C/24 – 48 h - Vi khuẩn lên men đường lactose sinh hơi sẽ làm thay đổi màu môi trường và có bóng hơi trong ống Durham * Thử khả năng lên men đường A. Lactose broth • Escherichia coli • Proteus vulgaris • Phản ứng dương tính: màu vàng, sinh hoặc không sinh hơi • Phản ứng âm tính: không đổi màu • Sinh hơi ◊ hình thành bóng hơi trong ống durham * LÊN MEN ĐƯỜNG, SINH H 2 S (TSI) • Gồm ba đường: Lactose, succrose, glucose • Cấy hai bước - Đầu tiên cấy trên mặt nghiêng - Thứ hai: cấy đâm sâu vào chân thạch. Ủ 37 o C/24h • Nếu chỉ lên men Glucose. - Một lượng nhỏ glucose trong môi trường lên men trong giờ đầu nuôi cấy. - Sau đó, vi khuẩn lấy năng lượng trong quá trình oxy hóa peptone ◊ phần thạch nghiêng có màu đỏ (hiện tượng kiềm hóa môi trường) - Peptone ở phần chân thạch không được sử dụng vì không có O2 ◊ phần chân vẫn giữ nguyên màu vàng * LÊN MEN ĐƯỜNG TRÊN TSI • Nếu lên men cả glucose, sucrose và/hoặc lactose - Từ 18 – 24h, toàn bộ phần chân và mặt nghiêng thạch có màu vàng - Sau 24 h: kiềm hóa môi trường do vi khuẩn sử dụng pepton, môi trường chuyển màu đỏ (chỉ ở phần mặt nghiêng vì pepton chuyển hóa trong điều kiện hiếu khí. - Nếu lên men sinh hơi sẽ thấy các bọt khí hoặc nứt thạch - Phân giải sodium thiosulfate thành hydrogen sulfide: phần chân thạch có màu đen (H 2 S +) 10. Thử nghiệm khử nitrat Nguyên tắc: Phát hiện enzym nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrit và ni tơ phân tử - Một số vi khuẩn có khả năng khử NO 3 thành NO 2 và các hợp chất chứa Nitơ khác như amonia (NH 3 ) và khí Nitơ (N 2 ) NO 3 ----> NO 2 ----> NH 3 or N 2 - Nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang nitrat,ủ ở 370 C/24h. Sau đó nhỏ thuốc thử có chứa alpha-napthylamine và sulfanilic acid . Hai hợp chất này kết hợp với nitrit để tạo thành HC có màu đỏ (phản ứng dương tính). * Tuy nhiên, nếu sản phẩm phân giải là amoniac và khí nitơ, ống thử nghiệm sẽ không chuyển màu nhưng vẫn được báo cáo là phản ứng nitrat dương tính. Trường hợp này cần tiến hành tiếp bước sau: - Cho thêm một ít bột kẽm vào ống thử, kẽm sẽ chuyển hóa nitrat thành nitrit và ống thử sẽ có màu đỏ. Như vậy, kết luận phản ứng âm tính - Nếu ống thử không chuyển màu, phản ứng dương tính (vi khuẩn đã chuyển hóa hết nitrat có trong môi trường) 11. Thử nghiệm phân giải hồng cầu (tan máu) - Một số vi khuẩn có khả năng phân giải hồng cầu có thể quan sát thấy trên thạch máu.Vùng tan máu được hình thành xung quanh khuẩn lạc. Có ba dạng tan máu: Tan máu (ß): vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc Tan máu (α): vùng xám xanh xung quanh khuẩn lạc Tan máu (γ): không có vùng tan máu 12. Thử nghiệm khả năng di động Nguyên tắc: phát hiện khả năng di của vi khuẩn nhờ có roi ở đầu tế bào. – Có thể thử khả năng di động bằng cách cấy đâm sâu trong thạch mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ 37 o C từ 18-24h – Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có thể di động xung quanh đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch 13. Thử nghiệm hóa lỏng gelatin Nguyên tắc: phát hiện vi khuẩn có men gelatinase phân giải và hóa lỏng gelatin, quan sát thấy ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn 28 o C • Có hai phương pháp xác định sự có mặt của men gelatinase - Cấy vi khuẩn vào thạch dinh dưỡng gelatin, ủ nhiệt độ phòng trong 14 ngày • Phương pháp gelatin Strip - Sử dụng dải màu có phủ gelatin. Nếu phản ứng dương tính, có sự thay đổi màu. Một số chủng có khả năng hóa lỏng gelatin chậm nên giữ lại thử nghiệm trong hai tuần. . MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT 1. Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử. Ammonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường. – Là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus. – Cấy vi khuẩn vào canh thang Ure. Ủ 37 o C/24 – 48 h – Phản ứng dương