Đang tải... (xem toàn văn)
Tnguyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau- Đồng Hỷ- Thái Nguyên
MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Tìm thuốc để chữa bệnh cho người, từ lâu mơ ước nhân loại Năm 1928, A Fleming phát Penicillin - chất kháng sinh (CKS) có nguồn gốc từ nấm Penicillium Nhưng phải 10 năm sau, vào năm 1940, nhóm nhà khoa học tách chiết thành cơng Penicillin Kể từ đó, Penicillin thức dùng để chữa bệnh cho người Đây thành tựu vĩ đại nhân loại kỷ XX Sự đời CKS có vai trị quan trọng nhiều lĩnh vực sản xuất đời sống Trong y học, CKS sử dụng để phòng chữa bệnh cho người Trong chăn nuôi, CKS sử dụng để chữa bệnh tăng trọng cho vật nuôi Trong nông nghiệp, CKS sử dụng để thay thuốc hóa học dùng làm chất kích thích sinh trưởng Ngồi ra, CKS sử dụng để bảo quản thực phẩm…[1] Tuy nhiên, việc sử dụng CKS không hợp lý dẫn đến xuất ngày nhiều VSV gây bệnh có khả kháng lại thuốc kháng sinh có, đặc biệt nhiều lồi VSV có khả kháng chéo nhiều CKS có cấu trúc tương tự Do việc tìm CKS mới, CKS có cấu trúc hóa học tự nhiên VSV tiết cần quan tâm nhiều Hàng năm có khoảng vài trăm CKS phát nay, người ta phát khoảng 17000 CKS có nguồn gốc VSV, 30000 CKS bán tổng hợp, số CKS có - 2% sử dụng y học [15, 21] Trong số VSV có khả sinh CKS xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, chiếm 80% CKS mơ tả [18] XK nhóm sinh vật nhân sơ (Prokaryote) với số lượng loài lớn phân bố nhiều vùng sinh thái khác giới Nhóm VSV biết đến với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo sản phẩm trao đổi thứ cấp có giá trị sử dụng cao enzym thủy phân hợp chất cao phân tử, chất kháng sinh nhiều hợp chất y dược khác Thái Nguyên tỉnh giàu tiềm nơng, lâm, ngư nghiệp nên có khu hệ VSV phong phú Đồng thời, Thái Nguyên nằm vùng sinh khống, có nhiều loại hình khống sản phân bố tập trung Các hoạt động khai thác khoáng sản có tác động đáng kể đến mơi trường đất qua chắn có ảnh hưởng đến hệ VSV đất khu vực mà chưa nghiên cứu Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, từ xu hướng nghiên cứu giới để góp phần khai thác nguồn VSV vô phong phú Thái Nguyên, thực đề tài: “Tuyển chọn nghiên cứu hoạt tính sinh học số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất bị nhiễm quặng khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên” Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn nghiên cứu số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh có nhiều triển vọng ứng dụng thực tế - Tuyển chọn nghiên cứu số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzym ngoại bào Nội dung nghiên cứu - Phân lập khiết XK từ mẫu đất - Kiểm tra HTKS chủng XK phân lập với VSVKĐ để tuyển chọn chủng có HTKS cao - Kiểm tra khả sinh enzym ngoại bào để chọn chủng có hoạt tính enzym cao - Xác định khả chịu nhiệt dịch enzym Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu xạ khuẩn 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên Theo hệ thống phân loại nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn G (+) XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) siêu giới nhân sơ (Prokaryota) [32] Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi 1000 lồi có 478 loài thuộc chi Streptomyces 500 loài thuộc chi cịn lại xếp vào nhóm XK [11, 36] Xạ khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên tìm thấy hầu hết mơi trường: đất, nước, khơng khí, chí môi trường mà vi khuẩn nấm mốc không phát triển XK phân bố nhiều đất, đóng vai trị quan trọng chu trình tuần hồn vật chất tự nhiên Chúng sử dụng acid humic chất hữu khó phân giải khác đất [36] Theo Waksman gam đất có khoảng 29.000 2.400.000 mầm XK, chiếm - 45% tổng số VSV [34] Sự phân bố XK phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật Sự phân bố XK cịn phụ thuộc nhiều vào độ pH mơi trường, chúng có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu axit yếu 6,8 - 7,5 XK có lớp đất kiềm axit lớp đất kiềm, số lượng XK đất thay đổi theo thời gian năm Một đặc tính quan trọng XK khả hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% XK phân lập từ đất có khả sinh CKS [15] Ngồi ra, XK tham gia tích cực vào q trình chuyển hố nhiều hợp chất đất, nước Dùng để sản xuất nhiều enzym proteaza, amylaza, cellulaza… số axit amin axit hữu Một số XK gây bệnh cho người, động vật [8] 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn * Cấu tạo tế bào xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn G (+), toàn thể tế bào bao gồm thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân thể ẩn nhập Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng trì hình dáng khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm lớp: lớp ngồi dày khoảng 60 ÷ 120A0, già đạt tới 150 ÷ 200A 0, lớp rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp dày khoảng 50A0 Các lớp chủ yếu cấu tạo từ lớp glucopeptide bao gồm gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic liên kết 1,4 - β glucozit Thành tế bào XK không chứa cellulose kitin chứa nhiều enzym tham gia vào trình trao đổi chất trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào Căn vào thành phần hoá học, thành tế bào XK chia thành nhóm [5, 9] Bao gồm: Nhóm I: Thành phần thành tế bào axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm Nhóm II: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 diaminopimelic (meso - ADP) glyxin Thuộc nhóm gồm giống: Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella… Nhóm III: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 diaminopimelic Thuộc nhóm có giống: Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia… Nhóm IV: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 diaminopimelic, arabinose galactose Thuộc nhóm gồm giống: Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…[10] Dưới lớp thành tế bào màng sinh chất dày khoảng 50 nm cấu tạo chủ yếu thành phần photpholipit protein Chúng có vai trị đặc biệt quan trọng q trình trao đổi chất trình hình thành bào tử XK Tế bào chất XK có chứa mezoxom, thể nhân, vật thể ẩn nhập gồm hạt poliphotphat polixacarit Nhân tế bào XK cấu trúc điển hình, nhiễm sắc thể khơng có màng Khi cịn non, tồn tế bào có nhiễm sắc thể sau hình thành nhiều hạt rải rác toàn hệ khuẩn ty [25] * Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn Xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh khơng có vách ngăn (trừ cuống bào tử hình thành bào tử) Hệ sợi XK có đường kính thay i khong 0,2 ữ àm n ÷ µm, chiều dài đạt tới vài cm [11] XK phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh theo kiểu 30 µm nhánh Độ dài khuẩn ty XK giai đoạn phát triển 11µm [35] Khuẩn ty XK bắt màu gram dương, hiếu khí, hoại sinh, khơng hình thành nha bào, khơng có lơng giáp mơ, đa hình thái dạng hình chùy, dạng phân nhánh hay dạng sợi dài, dạng phân nhánh thành chùm, thành bó gọi khuẩn ty thể (mycelium) Kích thước khối lượng khuẩn ty thường khơng ổn định phụ thuộc vào loại điều kiện nuôi cấy [31] Hệ sợi XK có màu sắc đa dạng: xanh, đỏ, trắng, vàng, lục, lam, tím, hồng… Các khuẩn ty non khuẩn ty có mang bào tử thường lớn khuẩn ty già khuẩn ty khơng mang bào tử Các lồi XK khác có kiểu cấu tạo hệ sợi, khác chỗ có lồi có hệ sợi dài, thẳng hay sóng phân nhánh, có lồi lại có hệ sợi ngắn, thường phân nhánh, thẳng xoắn Khi nuôi cấy môi trường đặc khuẩn ty XK phát triển thành loại Một loại cắm sâu vào môi trường gọi hệ sợi chất (khuẩn ty chất substrate mycelium) với chức chủ yếu dinh dưỡng Một loại phát triển bề mặt thạch gọi hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức chủ yếu sinh sản [28] Một số XK sợi khí sinh mà có sợi chất, làm cho bề mặt XK nhẵn khó tách cấy truyền Loại có sợi khí sinh ngược lại, dễ tách toàn khuẩn lạc khỏi môi trường [25] Hệ sợi XK phát triển mạnh tạo thành khuẩn lạc Hình thái khuẩn lạc XK khác nhau, kích thước hình dạng chúng thay đổi phụ thuộc vào môi trường điều kiện nuôi cấy như: thành phần mơi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Khuẩn lạc thường có đường kính 0,5 ÷ mm, có khuẩn lạc có đường kính đạt tới cm lớn Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, không trơn ướt vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thơ ráp, khơng suốt, xù xì, có dạng vôi, dạng nhung tơ hay màng dẻo… với nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, trắng, xanh… [8], có nếp tỏa theo hình phóng xạ bám sâu vào thạch Khuẩn lạc thường có cấu tạo lớp: lớp vỏ ngồi có dạng sợi bện chặt, lớp tương đối xốp lớp có cấu trúc tổ ong Các sản phẩm trình trao đổi chất CKS, độc tố, enzym… tích lũy sinh khối tế bào XK hay tiết môi trường lên men Hệ sợi chất tiết vào mơi trường loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen… có sắc tố tan nước, có sắc tố tan dung môi hữu [38] * Bào tử xạ khuẩn Bào tử XK hình thành nhánh phân hóa khuẩn ty khí sinh (gọi cuống sinh bào tử) Đó quan sinh sản đặc trưng cho XK Trên cuống sinh bào tử mang từ 30 ÷ 100 bào tử, đơi mang tới 200 bào tử, có mang bào tử hai bào tử Sự hình thành bào tử XK xảy kết đoạn (fragmenlation) cắt khúc (segmentation) cuống sinh bào tử Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với kích thước trung bình khong 0,7 ữ 0,9 ì 0,7 ữ 1,9 àm Kớch thước bào tử thay đổi khác tùy loài, tùy cá thể lồi chí chuỗi bào tử Bề mặt bào tử XK nhẵn (Sm Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like [10] Bào tử XK bao bọc màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 ÷ 400A0 gồm có lớp, lớp giúp cho bào tử tránh ảnh hưởng bất lợi ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm, pH… Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử cấu trúc màng thay đổi ni cấy mơi trường có nguồn nitơ khác [14] * Đặc điểm sinh lý, sinh hóa XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipit, protein nhiều hợp chất hữu khác để làm nguồn cacbon, muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ Tuy nhiên khả hấp thụ chất không giống loài hay chủng khác Phần lớn XK nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, số ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 25 - 30 0C Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường nằm khoảng 18 - 28 0C Độ ẩm thích hợp XK dao động khoảng 40 - 50%, giới hạn pH khoảng 6,8 - 7,5 XK khơng có giới tính [28] XK có khả hình thành enzym CKS nên ứng dụng vào nhiều lĩnh vực đời sống 1.2 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Một đặc điểm quan trọng XK khả hình thành CKS Trong số 8000 CKS biết giới có 80% có nguồn gốc từ XK [5] Một tính chất CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung từ XK nói riêng có tác dụng chọn lọc Mỗi CKS có tác dụng với nhóm VSV định Hầu hết CKS có nguồn gốc XK có phổ kháng khuẩn rộng Khả kháng khuẩn CKS đặc điểm quan trọng để phân loại XK Có nhiều quan điểm khác khả hình thành CKS, có hai giả thuyết ủng hộ là: - Việc tổng hợp CKS nhằm tạo ưu phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ chúng tiêu diệt hay kìm hãm phát triển loài khác tồn phát triển hệ sinh thái cục - Việc tổng hợp CKS đặc tính cần thiết đảm bảo cho khả sống sót cao chủng sinh CKS tự nhiên, lồi có bào tử [2] Mặc dù CKS có cấu trúc khác VSV sinh chúng đa dạng, trình sinh tổng hợp chúng theo số đường định - CKS tổng hợp từ chất chuyển hóa sơ cấp chloramphenicol, kháng sinh thuộc nhóm nucleoside - CKS hình thành từ hai ba chất trao đổi bậc khác lincomycin, novobiocin - CKS hình thành đường polyme hóa chất trao đổi bậc một, sau tiếp tục biến đổi qua phản ứng enzym khác Nhiều chủng xạ khuẩn có khả tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học có tác dụng tương tự Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào chế điều khiển đa gen, gen chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, cịn có gen chịu trách nhiệm tổng hợp tiền chất, enzym cofactor [15] 1.3 Phương pháp phân loại xạ khuẩn 1.3.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống Cũng vi khuẩn, việc phân loại xạ khuẩn chủ yếu dựa vào phân tích trình tự gen mã hóa cho 16S rRNA Bên cạnh đặc điểm hóa phân loại, hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường kết hợp để định danh xạ khuẩn cách xác đến tên lồi Trong đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học thành tế bào coi đặc điểm quan trọng Các đặc điểm hóa phân loại khác thành phần đường, menaquinone, photpholipit, axit béo tế bào tỷ lệ GC ADN genom mang tính đặc trưng cho lồi có ý nghĩa quan trọng phân loại xạ khuẩn Các đặc điểm sinh lý, sinh hoá thường kết hợp sử dụng phân loại xạ khuẩn khả đồng hoá nguồn cacbon nitơ, nhu cầu chất kích thích sinh trưởng, khả phân hủy chất khác nhờ hệ thống enzym Bên cạnh đó, tiêu khác mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả chịu muối yếu tố khác môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng phát triển khác nhau, tính chất đối kháng nhạy cảm với CKS, khả tạo thành CKS sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác XK tiến hành phân tích đồng thời [10] 1.3.2 Phân loại theo phương pháp đại Các nhà khoa học giới cho mức độ tương đồng trình tự rRNA phản ánh mối quan hệ tiến hóa cá thể VSV Tất lồi VSV sinh giới sử dụng cách tổng hợp protein nhờ riboxom Vì người ta tiến hành so sánh trình tự nucleotit gen mã hoá rRNA VSV khác để xác định mối quan hệ chúng rRNA phân tử lý tưởng cho nghiên cứu tiến hoá VSV vì: - Phân tử có mặt tế bào VSV - Thực chức cấu thành nên riboxom, máy tổng hợp protein tế bào - Có kích thước vừa phải (1500 bp) để tiến hành nghiên cứu phả hệ - Là cao phân tử xuất sớm lịch sử tiến hóa Cấu trúc rRNA thay đổi chậm theo thời gian, hay nói cách khác gen mã hoá cho chúng bảo tồn tốt q trình tiến hố Mặc dù mang tính bảo thủ cao, gen mã hố cho rRNA chứa vùng có mức độ bảo thủ thấp hơn, dễ có sai khác lồi sinh vật khác Dựa vào vùng bảo thủ gen mã hoá cho rRNA, nhà khoa học thiết kế cặp mồi vạn để khuếch đại toàn chiều dài gen, bao gồm vùng biến đổi So sánh khác biệt vùng này, người ta khác biệt loài gần gũi [26] Hiện phân loại XK vi khuẩn nói chung tiến hành dựa so sánh trình tự gen mã hóa cho phân tử 16S rRNA kết hợp với đặc điểm khác theo phân loại cổ truyền Các nhà phân loại học thường lấy ngưỡng 98% độ tương đồng trình tự 16S rRNA để phân biệt hai lồi khác Bên cạnh đó, phép lai ADN genom thường tiến hành thí nghiệm bổ sung để khẳng định vị trí phân loại tới mức độ loài Hai chủng XK (hay vi khuẩn nói chung) coi hai lồi riêng biệt chúng có độ tương đồng ADN genom thấp 70% Dựa mức độ tương đồng trình tự 16S rRNA người ta dựng phát sinh chủng loại (cây phả hệ) thể mối tương quan loài nghiên cứu với lồi có họ hàng gần tổ tiên chúng Trong đa số trường hợp, phân tích hóa phân loại sinh lý, sinh hóa có tương đồng cao so với phân loại theo trình tự 16S rRNA [27] 1.4 Ứng dụng chất kháng sinh 1.4.1 Ứng dụng y học Kể từ CKS sử dụng cứu sống bệnh nhân bị nhiễm trùng máu năm 1941 [21], đến hàng loạt CKS phát ứng dụng y học đóng góp phần khơng nhỏ cơng tác phòng điều trị bệnh tật, bệnh nhiễm khuẩn người Nhờ có CKS mà y học làm giảm bớt mối lo cho nhân loại bệnh nhiễm trùng, điều trị loại bỏ mối nguy hiểm số bệnh thường gặp thương hàn, dịch hạch, dịch tả, thấp khớp, bệnh miệng, mắt, mũi Hiện loại bệnh phổ biến nấm gây nấm da, nấm tóc, móng chân, móng tay… sử dụng kháng sinh để điều trị cách bôi trực tiếp lên da bị nhiễm bệnh cách uống Có nhiều loại thuốc sử dụng để điều trị bệnh như: nystatin, natamicin, hamicin, rimocyclin… Phần lớn CKS sử dụng y học có nguồn gốc từ XK, có tới 1/3 CKS XK sinh Trong y học, kháng sinh dùng kết hợp lúc nhiều loại kháng sinh nhằm mang lại hiệu cộng hợp - tăng liều gấp hai loại kháng sinh (khi kết hợp hai kháng sinh hãm khuẩn) [21] 10 ... “Tuyển chọn nghiên cứu hoạt tính sinh học số chủng xạ khu? ??n phân lập từ đất bị nhiễm quặng khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn nghiên cứu số chủng xạ khu? ??n. .. LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các mẫu đất lấy địa điểm khác thuộc khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên Từ phân lập 92 chủng xạ khu? ??n 2.2 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Xạ. .. khu? ??n có hoạt tính kháng sinh có nhiều triển vọng ứng dụng thực tế - Tuyển chọn nghiên cứu số chủng xạ khu? ??n có hoạt tính enzym ngoại bào Nội dung nghiên cứu - Phân lập khiết XK từ mẫu đất - Kiểm
