Đang tải... (xem toàn văn)
enzym xylanase trong công nghệ thực phẩm
Enzyme cơng nghệ thực phẩm Nhóm – 49k hố thực phẩm gồm thành viên : Hồng Thị Phương Anh Nguyễn Thị Bảy Đinh Thị Quỳnh Bé Nguyễn Thị Chung Lê Thị Dung Nguyễn Thị Dung Nguyễn Cảnh Dũng Trần Anh Dũng Lê Thị Duyên 0852049105 0852040449 0852045283 0852045298 0852040456 0852040434 0852049081 0852040452 0852040429 Mở đầu Từ trước kỉ 17, lồi người chưa biết enzyme, người ta biết sử dụng rộng rãi quy trình enzyme thực tế làm bánh mì, bia, rượu, muối dưa… Việc sử dụng enzyme giai đoạn mang tính chất kinh nghiệm túy sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống Ngày với phát triển mạnh mẽ Công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: chế biến thực phẩm,nông nghiệp,chăn nuôi,y tế… Hàng năm luợng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300.000 với 500 triệu USD,được phân phối lĩnh vực khác Phần lớn enzyme sản xuất quy mô công nghiệp thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy.Khoảng 75% chế phẩm enzyme thủy phân sử dụng cho việc thủy phân chất tự nhiên Enzyme pectinase enzyme xúc tác thủy phân pectin Nó sản xuất chủ yếu nấm mốc Aspergillus sp., Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora crassa… Enzyme pectinase thường dùng công nghiệp thực phẩm dược phẩm đặc biệt sử dụng nhiều sản xuất nước , sản xuất rượu vang, trích ly đông dược ( sắc thuốc ), chăn nuôi Chương : Tổng quan enzyme pectinase 1.1 Giới thiệu chung enzyme pectinase Enzyme pectinase enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester liên kết glucoside có mạch polyme pectin 1.1.1 Cơ chất pectin Hình 1: phân tử pectin + Pectin hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ kết hợp acid galacturonic qua liên kết -1,4-glucoside Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80000-200000 Pectin khơng hịa tan rượu dung môi hữu khác Pectin hoà tan nước, amoniac, dung dịch kiềm, carbonate natri glycerine nóng Độ hịa tan pectin nước tăng lên mức độ ester hóa phân tử tăng khối lượng phân tử pectin giảm + Pectin tên chung gọi cho hỗn hợp chứa thành phần khác nhau, pectinic acid thành phần chủ yếu Các pectin tự nhiên định vị thành tế bào liên kết với cấu trúc polysaccaride protein để tạo thành proto pectin khơng hịa tan Có thể phân hủy để làm cho pectin tan nước cách đun nóng pectin mơi trường acid Vì thế, pectin tan thu nhận kết phân hủy phân tử pectin không tan chúng không đồng dạng với + Trong thực vật, pectin tồn dạng: pectin hòa tan, pectinic acid protopectin - Pectin hòa tan ester methylic acid polygalacturonic pectin, tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl polygalacturonic acid ester hóa methanol Pectin ester hóa cao tạo gel đặc dung dịch acid dung dịch đường có nồng độ 65% Enzyme pectinase tác động lên pectin có khối lượng phân tử khác cấu trúc hóa học khơng đồng dạng Cấu trúc hóa học pectin -D-galacturonan hay -D-galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ đơn vị D-galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu -1,4) Mặt khác, mức độ oxy hóa phân tử polymer khác nhau, số định nhóm carboxyl bị ester hóa nhóm methoxyl Trong số trường hợp, chẳng hạn pectin củ cải đường, có ester hóa nhóm carboxyl nhóm acetyl - Pectinic acid polygalacturonic acid có phần nhỏ nhóm carboxyl ester hóa methanol Pectinate muối pectinic acid Pectic acid polygalacturonic hồn tồn giải phóng khỏi nhóm methoxy, tức có chứa nhóm carboxyl tự đơn vị polygalacturonic acid Pectate muối pectic acid - Protopectin tạo độ cứng cho xanh, khơng tan nước có cấu tạo hóa học phức tạp Trong thành phần pectin có phân tử pectin, phân tử cellulose ion Ca2+, Mg2+, gốc phosphoric acid, acetic acid đường Protopectin bị thủy phân acid giải phóng pectin hòa tan Protopectin (Insoluble ) + H2O Pectin (Soluble ) 1.1.2 Enzyme pectinase: Hình 2: cấu trúc phân tử pectinase Enzyme pectinase enzyme xúc tác phân hủy polymer pectin Sự phân hủy pectin tự nhiên thường xảy trái chín Những enzyme có vai trị quan trọng trình bảo quản trái rau 1.2 Phân loại enzyme pectinase Hiện hệ thống enzyme pectinase chia làm nhóm : hydrolase, transeliminase với đặc điểm chung làm giảm độ nhớt dung dịch pectin làm giảm phân tử lượng sản phẩm tạo thành 1.2.1 Enzyme hydrolase Thuộc nhóm có enzyme chủ yếu : pectinesterase polygalacturonase - Pectinesterase - gọi tắt PE : enzyme xúc tác thủy phân liên kết este phân tử pectin hóa axit pectinic để giải phóng sản phẩm methanol axit polygalacturonic PE phân cắt nhóm metoxyl đứng cạnh nhóm –COOH tự Pectinesterase thu từ nguồn khác có giá trị pH tối ưu khác Nếu thu từ nguồn VSV pH tối ưu từ 4.5-5.5, cịn từ nguồn thực vật có pH tối ưu từ 5.0-8.5 Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu 30-45 0C bị vô hoạt 55-620C Pectinesterase thường hoạt hóa ion Ca2+ Mg2+ - Polygalacturonase - gọi tắt PG : ( poly 1-4 - galacturonit glucanhydronase ) xúc tác phân cắt mối liên kết -1,4-glycosid Các exo-PG (exo-poly (1,4--Dgalacturonide) galacturonohydrolase, EC 3.2.1.67), phân cắt từ đầu không khử, endo-PG (endo-poly (1,4--D-galacturonide) glycanohydrolase, EC 3.2.1.15) công ngẫu nhiên vào mạch chất Enzyme gặp thực vật, chủ yếu gặp vi khuẩn nấm mốc Đây phức hệ enzyme thường có tính đặc hiệu cao chất Dựa vào người ta chia kiểu sau : + Polymetyl – galacturonase ( PMG – Poly - 1-4 – galacturozit – metyl este glucanhydrolase ) PMG phân thành nhóm nhỏ phụ thuộc vào vị trí phân cắt liên kết 1,4 hay cuối đầu mạch Endo glucozidase polymetyl galactunase kiểu I ( endo- PMG – I ) Đây enzyme có tính chất dịch hóa , pectin có mức độ metyl hóa cao ( nhiều gốc metoxy – OCH3) bị thủy phân nhanh triệt để Trong môi trường có mặt pectinesterase ( PE ) enzyme bị giảm hoạt lực Endo – PMG – I phổ biến nấm mốc : Asp , Niger , Asp.Awamori, Botrytis cinezea , Neurispora crassa Cơ chế tác dụng hình vẽ : Exo - glucozidase polymetyl galacturonase kiểu III ( exo- PMG – III ) Đây enzyme có tính chất đường hóa, có khả cắt gốc monome axit galacturonic khỏi mạch đầu khơng khử có nhóm metoxy (-OCH3 ) Cơ chế tác dụng hình vẽ : + Enzyme tác dụng lên axit pectinic hay axit pectit - gọi polygalacturonase ( PG ) phân thành nhóm nhỏ : Endo glucozidase polygalacturonase kiểu II ( endo- PG – II ) Đây enzyme có tính chất dịch hóa, thủy phân chất có mặt nhóm –COOH tự Hoạt độ endo – PG- II tăng lên nhiều chất xử lý trước pectinesterase ( dể tạo nhiều gốc –COOH tự ) Nấm mốc vi khuẩn tổng hợp enzyme Cơ chế tác dụng hình vẽ : Enxo – glucozidase polygalacturonase kiểu IV ( exo- PG- IV ) Thủy phân liên kết gắn với nhóm –COOH tự đầu hay mối mạch 1.2.2 Transeliminase ( TE ) Đây nhóm enzyme tìm cách chưa lâu ( khoảng năm 1960-1961) bao gồm protopectinase xúc tác phân cắt araban , galactan khỏi protopectin để tạo thành pectin hòa tan enzyme transeliminase phân cắt phi thủy phân ( khơng có tham gia phân tử nước ) pectin để tạo gốc galacturonic có nối kép C 4, C5 Phản ứng xảy dễ dàng mơi trường trung tính hay kiềm yếu 1.3 Các nguồn thu nhận enzyme pectinase 1.3.1 Sơ lược chung Có hai loại enzyme là: nội bào ngoại bào, enzyme địi hỏi phải có phương pháp tách thu nhận riêng: Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) vi sinh vật tiết môi trường nuôi cấy ngồi tế bào, thường hịa tan nước dễ trích ly tinh Enzyme nội bào: enzyme sản xuất bên tế bào vi sinh vật không tiết môi trường bên Những tế bào vi sinh vật sau nuôi cấy tách phá vỡ tế bào Mục đích việc giải phóng tồn chất có tế bào gồm enzyme nội bào Hỗn hợp thu đem ly tâm tách tạp chất chất có phân tử lượng lớn; enzyme kết tủa cồn hay muối Enzyme sau đem tinh B Enzyme nội bào Enzyme ngoại bào ả n Khó tách Dễ tách g Phải phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào : Thường lẫn chung với chất khác Không lẫn chung với thành phần tế bào sau bị phá vỡ (acid nội bào, có vài nucleic, chất nguyên sinh, lipid….) enzyme ngoại bào khác Chỉ bền vững môi trường nội Bền vững bào Phương pháp tinh khó thực Phương pháp tinh dễ rẻ hiện, quy trình cơng nghệ phức tạp, giá thành đắt So sánh enzyme nội bào enzyme ngoại bào 1.3.2 Thu nhận enzyme pectinase Hiện người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV Có phương pháp sản xuất pectinase : + Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt + Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu 1.3.2.1 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường cám gạo hay cám mì, bã củ cải hay thóc mầm Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường amonium, photphoric Độ ẩm môi trường phải nằm khoảng 60% Nấm mốc A.awamori thường nuôi cấy 300C thời gian 40giờ, sau giảm xuống 240C ni cấy thời gian 48-52 Sản phẩm lên men sấy khô thành chế phẩm enzyme thô đem tinh chế Để thu chế phẩm pectinase tinh khiết chế phẩm enzyme thơ phải trích ly phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu hay muối amoni sunfat Dung môi hữu dùng để kết tủa enzyme pectinase rượu etanol ( 72.5-75% ) isopropanol ( 55-57%) Muối amonium sunfat sử dụng có độ bão hòa 0.79 Khi kết tủa rượu ethanol chế phẩm enzyme thu có độ tinh khiết 90%, cịn muối có độ tinh khiết 75% Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu 2-50C, thời gian tiếp xúc với rượu ngắn tốt Sau ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa nghiền nhỏ đem bảo quản 1.3.2.2 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu - Phương pháp hiếu khí : Sự tích tụ enzyme môi trường bắt đầu phát triển VSV gần đạt đến pha ổn định, mơi trường bị axit hóa mạnh lượng phốt vơ sử dụng hồn tồn pH mơi trường ni cấy thường đạt từ 6-7.2 thích hợp Đối với nấm mốc pH kiềm kìm hãm tổng hợp sinh khối tích lũy enzyme pectinase pH =4 ức chế hồn tồn tích lũy enzyme pectinase Khi pH dịch phía axit, pH nằm khoảng 4.5-5.0, tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm Tuy nhiên pH mơi trường ni cấy A.niger A.awamori 16 dịch 3.5-3.8 2.9-3.2 theo thứ tự Vật liệu gieo cấy sợi nấm 24, 32, 48 tuổi với hàm lượng từ 210% Đối với A.niger A.awamori, vật liệu gieo sợi nấm ủ sơ môi trường dinh dưỡng bắt đầu sinh bào tử Thời gian ủ sơ thường 3842 Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường 2% Trong q trình ni cấy, hàm lượng chất hịa tan mơi trường thường giảm từ 6% xuống cịn 1.5-1.8% Để thu chế phẩm khơ, cần tách sợi nấm khỏi canh trưịng lỏng Cơ đặc chân không canh trường lỏng đến hàm lượng chất khô đạt từ 5-8% sấy khô thiết bị sấy phun , điều kiện sấy phun nhiệt độ chất tải nhiệt vào phải đạt từ 165-1800C đạt 60-700C Thời gian lưu chế phẩm enzyme thiết bị sấy phun không giây nhiệt độ chế phẩm sau sấy không 400C Chế phẩm thu cần phải đóng gói kín để tránh hút ẩm Có thể thu chế phẩm enzyme pectinase tinh khiết cách kết tủa enzyme dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với axeton theo tỉ lệ 2:1, với isopropan theo tỉ lệ 1.3:1, với muối amoni sunfat ( 50-80% ) muối kết Nếu kết tủa ethanol, hoạt độ pectin kết tủa vào khoảng 88-90% so với hoạt độ dịch canh trường ban đầu Nếu kết tủa muối amoni sunfat Cần tách muối khỏi enzyme phương pháp thẩm tích (với nước dung dịch đệm ), sau sấy khơ Khi độ bão hịa (NH4)2SO4=0.5 kết tủa đoạn có hoạt độ pectinase thấp( đoạn chiếm 0.25% trọng lượng khơ ) Nhưng kết tủa (NH4)2SO4 có độ bão hịa 1.0 kết tủa đoạn chiếm 0.11% lại có hoạt độ pectinase cao - Phương pháp yếm khí Mơi trường : + Bã củ cải 2% + (NH4)2HPO4 0.75% + KH2PO4 0.1% + CaCO3 0.3% + Nước chiết ngô 0.5% Clostridium pectinopermentants 15 có khả tổng hợp pectinnase cách mạnh mẽ pha tăng trưởng trình sinh trưởng tăng đồng thời với tích lũy enzyme tối đa tương ứng với pha ổn định sinh trưởng qua 55-60 pH ban đầu môi trường dung dịch 6.5-7.0 Vật liệu gieo cấy ban đầu chuẩn bị dạng canh trường chứa bào tử cấy với lượng 4% theo thể tích Quá trình ni cấy tiến hành nhiệt độ 350C Cl Felsineum ni cấy yếm khí để thu pectinase Thành phần mơi trường gồm có : (NH4)2HPO4 0.4% , KH2PO4 0.3%, K2HPO4 0.7% , NaCl 0.1% , MgSO4 0.025% , FeSO4 dạng vết, CaCO3 0.5%, dịch nấm men tự phân 0.05%, ascorbic axit 0.5% Có thể tiến hành thu phế phẩm từ dịch lọc canh trường cách kết tủa enzyme với dung môi hữu với muối amoni sunfat Nếu kết tủa dung môi hữu cơ, pH dung dịch xử lý 6.5-6.8 Nếu kết tủa 2-2.5 thể tích axeton hoạt độ enzyme kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban ban đầu Khi kết tủa amoni sunfat có độ bão hịa 0.2 thu chế phẩm chứa pectinesterase pectintranseliminase exopolygalacturonase Phương pháp đại chuẩn bị chế phẩm enzyme pectinase thường theo bước sau : Khử muối phương pháp lọc gel ( Biogel P100) Tách protein phương pháp trao đổi ion ( DEAE Biogel A ) hay trao đổi cation ( CM Biogel A) Tách enzyme pectinase alginate liên kết ngang ... chế phẩm enzyme: + Chế phẩm thô - Chế phẩm thô từ canh trường lỏng - Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt + Chế phẩm kỹ thuật Là chế phẩm tinh chế sơ bộ, số protein enzyme tạp tách Trong chế phẩm. .. phế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme thô đem sử dụng Chế phẩm enzyme thơ đem tinh chế Nghiền mịn Trích ly Lọc Bã Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Sấy kết tủa Tinh chế kết tủa Thu nhận chế phẩm enzyme... phẩm kỹ thuật thường chứa vài enzyme chủ yếu + Chế phẩm tinh khiết Là chế phẩm chứa loại enzyme định với hàm lượng cao Thường tinh enzyme từ chế phẩm enzyme thô Chế phẩm thô thường chứa thành phần