ĐỊNH TÍNH ALKALOID TRONG DƯỢC LIỆU

Khoa DượcBÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆU 2Bài 2KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID2.1. Kiểm nghiệm dược liệu Mã tiền2.1.1 Bột dược liệu 2.2 Định tínhGiải thích sơ đồ:Alkaloid tồn tại trong tế bào thực vật dạng muối tan trong nước, khi thêm dung dịch cồn acid acetic 5% các alkaloid có trong dược liệu sẽ được hòa tan và chiết ra. Vì dung dịch cồn acid là dung môi vạn năng hòa tan được nhiều chất nên dịch chiết có thêm một số tạp chất như carbohydrat, acid amin …Lọc nóng qua gòn để loại tạp không tan trong cồn acid.Sau khi bay hơi một phần cồn acetic, dịch còn lại sẽ chứa alkaloid dạng muối và tan trong nước nóng, lọc để loại tạp ta được dịch chiết acid chứa alkaloid dạng muối.Kiềm hóa bằng dung dịch NH3 đậm đặc sẽ đưa alkaloid dạng muối sang alkaloid dạng base (tan trong dung môi hữu cơ và không tan trong nước).Vì alkaloid đang ở dạng base nên dùng chloroform để chiết alkaloid. Chiết 2 lần để tăng hiệu suất chiết. Quá trình chiết lỏng – lỏng có sự phân tách lớp: alkaloid dạng base tan trong ccloroform nên lấy lớp dưới vì chloroform nặng hơn nước.Sau khi chiết được dịch chloroform, chia làm 2 phần:•Phần 1 để định tính alkaloid bằng thuốc thử chung:Chuyển alkaloid base thành alkaloid dạng muối nên lắc phân bố với 10ml H2SO4 2%, alkaloid dạng muối tan được trong acid nên lấy lớp trên vì nước acid nhẹ hơn chloroform.Chuyển về alkaloid dạng muối để định tính thuốc thử chung mà không dùng alkaloid base vì các thuốc thử alkaloid kém bền trong môi trường kiềm và alkaloid tạo tủa không tan với các thuốc thử trong môi trường trung tính hoặc acid yếu.•Phần 2: Định tính bằng các phản ứng đặc hiệuCho Na2SO4 khan vào để hút nước vì, natri slulfat khan được sử dụng như một chất làm khô trơ, loại bỏ dấu vết của nước ra khỏi các chất lỏng hữu cơ, làm dịch chiết trong hơn. Phản ứng định tính có dùng acid sulfuric đậm đặc có tính háo nước nên cần loại nước trước khi tiến hành định tính.Định tính bằng thuốc thử chung: Cho 2ml dịch chiết acid vào lần lượt 4 ống nghiệm Cho riêng rẽ lần lượt 3 giọt thuốc thử:•TT Bouchardat•TT Dragendorff•TT Valse – Mayer•TT Bertrand1Chú thích•Ống nghiệm 1: Thuốc thử Bouchardat•Ống nghiệm 2: Thuốc thử Dragendorff•Ống nghiệm 3: Thuốc thử ValseMayer•Ống nghiệm 4: Thuốc thử Bertranda)Thuốc thử Bouchardat (Ống nghiệm 1)Hiện tượng: tủa nâu dưới đáy ống nghiệmKết luận: Dương tínhThuốc thử Bouchardat (I2Iodine, KI, H2O).Cơ chế: I2 sẽ tạo phức periodur alkaloid không tan với alkaloid khi có mặt của KI. Phức không tan có màu nâu.b)Thuốc thử Dragendorff (Ống nghiệm 2)Hiện tượng: tủa vàng cam, tủa vô định hìnhKết luận: Dương tínhThuốc thử Dragendorff (Bismuth nitrate, KI, H2O) là dung dịch muối của kim loại nặng Bismuth: KBiI4 – Kalitetraiodobismutat III. Dùng để định tính amine bậc 3 và một vài amine bậc 2.Cơ chế: Phản ứng xảy ra giữa nguyên tử kim loại nặng (Bi) trong thuốc thử với nguyên tử nitrogen trong alkaloid tạo muối (double salt) không tan có màu vàng cam > đỏ. Thuốc thử phát hiện alkaloid rất nhanh.•BiI3+KI↔KBiI4 – SPU•BiI4 + HNR3+ > HNR3+n.BiI4n c)Thuốc thử ValseMayer (Ống nghiệm 3)Hiện tượng: tủa trắng vô định hìnhKết luận: Dương tínhThuốc thử: Dung dịch muối của kim loại nặng Hg (Dipotassium tetraiodomercurate K2HgI4).Cơ chế: Phản ứng xảy ra giữa nguyên tử kim loại nặng (Hg) trong thuốc thử với nguyên tử nitrogen trong alkaloid tạo muối không tan có màu trắng hoặc vàng nhạt.•HgCl2 + 2KI > HgI2 + 2KCl•HgI2 + + 2KI > K2HgI4•HgI42 + HNR3+> HNR3+2.HgI42 d)Thuốc thử Bertrand (Ống nghiệm 4)Hiện tượng: tủa trắng Kết luận: Dương tínhThuốc thử Bertrand là Silicotungstic acid (SiO2 • 12WоO3 • 4Н2O) Cơ chế: Phản ứng xảy ra giữa nguyên tử kim loại nặng (Wo) trong thuốc thử với nguyên tử nitrogen trong alkaloid tạo muối không tan có màu vàng trắng.Định tính bằng các phản ứng đặc hiệu:Định tính strychnin:Hiện tượng: sau khi cho acid sulfuric đậm đặc và kali cromate thì có vệt màu tím rồi chuyển sang hồng vàng và biến thành nâu đen.Kết luận: Dương tínhGiải thích:Vì strychnin là alkaloid nhân indol, ở vị trí N số 9 có khả năng tạo muối với H2SO4 và cho phản ứng oxi hóa với kalidicromateBrucin không cho phản ứng này vì có nhóm OCH3 khóa phản ứng Định tính brucin: Hiện tượng: sau khi nhỏ acid nitric đậm đặc vào cắn thấy có màu đỏ cam.Kết luận: dương tínhGiải thích: Vì bruxin có 2 nhóm methoxy ở vòng thơm của nhân indol, acid HNO3 đậm đặc sẽ demethyl hóa –OCH3 > OH. Nhóm –OH bị oxy hóa tạo cetone cho ra vòng quinone có màu đỏ cam.Là phản ứng đặc hiệu để nhận biết strychnin với brucin. 2.2. Kiểm nghiệm dược liệu Chè (Folium Camelliae)2.2.1 Bột dược liệu 2.2.2. Định tínhChiết xuất Giải thích sơ đồ chiết alkaloid của lá Chè bằng nước nóng.Vì alkaloid trong lá Chè (caffeine) có tính kiềm rất yếu nên không thể chiết được bằng các phương pháp chiết alkaloid thông thường. Caffeine tan tốt trong nước nóng, rất ít tan trong nước lạnh > dùng nước sôi để chiết alkaloid từ Chè.Phải lọc nóng qua gòn vì nếu để nguội alkaloid sẽ tủa lại và bị dính lại trên gòn, dịch lọc có ít hoặc không có alkaloid.Ceffeine có tính kiềm rất yếu, tồn tại ở dạng tự do trong dịch chiết. Khi để nguội Caffein kém tan trong nước nên khi lắc phân bố với chloroform, alkaloid sẽ chuyển từ dịch chiết nước sang lớp chloroform. Lấy lớp dưới vì CHCl3 có tỉ trọng nặng hơn nước. Chia dịch chiết thành 2 phần:•Phần 1: Dùng để định tính Alkaloid bằng thuốc thử chung. Lấy dịch chloroform để lắc phân bố với H2SO4 2% để chuyển từ dạng base sang dạng muối tan trong nước. Lấy lớp trên vì tỉ trọng của nước acid nhẹ hơn chloroform. Để định tính Alkaloid bằng thuốc thử chung thì Alkaloid phải ở dạng muối tan trong nước, vì:Các thuốc thử alkaloid kém bền trong môi trường kiềm và alkaloid tạo tủa không tan với các thuốc thử trong môi trường trung tính hoặc acid yếu.Alkaloid ở dạng muối trong nước acid thì lượng tạp chất lẫn vào ít, đảm bảo cho việc định tính.•Phần 2: Dùng để định tính Alkaloid bằng phản ứng Murexid.Làm khan dịch chiết CHCl3 bằng Na2SO4 để loại bỏ nước trong dịch chiết chloroform.Cho Na2SO4 khan vào để hút nước vì, natri slulfat khan được sử dụng như một chất làm khô trơ, loại bỏ dấu vết của nước ra khỏi các chất lỏng hữu cơ, làm dịch chiết trong hơn.Định tính bằng thuốc thử chung Quy trình: Cho vào 4 ống nghiệm 1 ml dịch acid > cho riêng rẽ vào ống nghiệm 4 giọt thuốc thử lần lượt là•Ống nghiệm 1: Thuốc thử Bouchardat•Ống nghiệm 2: Thuốc thử Dragendorff•Ống nghiệm 3: Thuốc thử ValseMayer•Ống nghiệm 4: Thuốc thử BertrandHiện tượng•Ống nghiệm 1: Không có tủa nâu đỏ•Ống nghiệm 2: Không có tủa vàng cam > đỏ•Ống nghiệm 3: Không có tủa trắng hay vàng nhạt•Ống nghiệm 4: Không có tủa vàng trắngKết luận: cả 4 ống nghiệm đều âm tínhGiải thích: Mặc dù trong Chè có chứa alkaloid (caffeine) nhưng alkaloid của Chè có tính kiềm rất yếu nên không cho phản ứng với các thuốc thử chung alkaloid.Định tính bằng phản ứng đặc hiệu (phản ứng Murexide)Phản ứng Murixide dùng để định tính nhân purine của Caffein. Hiện tượng: xuất hiện màu đỏ tím sau khi nhỏ vài giọt NH4OH đậm đặc vào cắn.Kết luận: dương tính.Giải thích:•Do caffeine có tính kiềm rất yếu nên phản ứng cần thực hiện trong môi trường khan > dùng Na2SO4 để loại bỏ nước trong dịch chloroform, để khi đun nóng bốc hơi chloroform sẽ nhanh hơn do tsôi CHCl3=61,2oC < tsôi H2O=100oC.•H2O2 đđHClđđ là tác nhân oxy hóa mạnh, sẽ oxy hóa caffeine thành purpuric acid.•Sau khi cô cắn để loại bỏ H2O2 đđHClđđ, cho cắn tác dụng với NH4OH sẽ cho màu đỏ tím do tạo thành muối murexide (muối ammonium purpurate). 2.3 Kiểm nghiệm dược liệu Cà độc dược (Folium Daturae)2.3.1. Bột dược liệu2.3.1 Bột dược liệu2.3.2 Định tínhChiết xuất 2.3.2 Định tínhGiải thích quy trình chiết xuất alkaloid từ Cà độc dượcAlkaloid có tính kiềm. Làm ẩm dược liệu bằng NH4OH đậm đặc để chuyển alkaloid ở dạng muối trong tế bào thực vật thành dạng base tự do. Ngoài ra, làm ẩm giúp dược liệu trương nở, giúp dung môi dễ thấm vào tế bào và chiết được nhiều hoạt chất hơn.Alkaloid dạng base tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực > dùng dung dịch chloroform để chiết alkaloid dạng base từ Cà độc dược.Khi lắc phân bố dịch chloroform với sulfuric acid 2%, alkaloid dạng base sẽ chuyển sạng dạng muối tan trong nước (Base + Acid > Muối) > loại bỏ lớp chloroform, lấy dịch acid (lớp acid ở trên do tỉ trọng của nước acid nhẹ hơn chloroform). Lắc phân bố 2 lần sẽ chiết được nhiều alkaloid hơn. Chia dịch chiết thành 2 phần:•Phần 1: Dùng để định tính alkaloid bằng thuốc thử chung. Để định tính alkaloid bằng thuốc thử chung thì alkaloid phải ở dạng muối tan trong nước, vì:Các thuốc thử alkaloid kém bền trong môi trường kiềm và alkaloid tạo tủa không tan với các thuốc thử trong môi trường trung tính hoặc acid yếu.Alkaloid ở dạng muối trong nước acid thì lượng tạp chất lẫn vào ít, đảm bảo cho việc định tính.•Phần 2: Dùng để định tính Alkaloid bằng phản ứng đặc hiệu Vitali – Mori.Kiềm hóa dịch acid bằng NH4OH đậm đặc đến pH=10 để chuyển từ alkaloid dạng muối tan trong nước sang dạng base tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực.Lắc phân bố với 10ml CHCl3 chiết được alkaloid dạng base từ nước acid.Làm khan bằng Na2SO4 để loại bỏ nước có lẫn trọng dịch chloroform. Cho Na2SO4 khan vào để hút nước vì, natri slulfat khan được sử dụng như một chất làm khô trơ, loại bỏ dấu vết của nước ra khỏi các chất lỏng hữu cơ, làm dịch chiết trong hơn.Định tính bằng thuốc thử chungQuy trình: Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch nước acid > cho riêng rẽ vào mỗi ống nghiệm 3 giọt thuốc thử lần lượt là•Ống nghiệm 1: Thuốc thử Bouchardat•Ống nghiệm 2: Thuốc thử Dragendorff•Ống nghiệm 3: Thuốc thử ValseMayer•Ống nghiệm 4: Thuốc thử Bertrand Hiện tượng:•Ống nghiệm 1: có tủa nâu đỏ.•Ống nghiệm 2: có tủa vàng cam.•Ống nghiệm 3: có tủa trắng. •Ống nghiệm 4: có tủa trắng.Kết luận: cả 4 ống nghiệm đều cho kết quả dương tính.Giải thích:•Thuốc thử Bouchardat (I2Iodine, KI, H2O).Cơ chế: I2 sẽ tạo phức không tan với alkaloid khi có mặt của KI. Phức không tan có màu nâu.•Thuốc thử Dragendorff dung dịch muối của kim loại nặng Bismuth (KBiI4 – Kalitetraiodobismutat III).Cơ chế: Phản ứng xảy ra giữa nguyên tử kim loại nặng (Bi) trong thuốc thử với nguyên tử nitrogen trong alkaloid tạo muối (double salt) không tan có màu vàng cam > đỏ. Thuốc thử phát hiện alkaloid rất nhanh.BiI3+KI↔KBiI4 – SPUBiI4 + HNR3+ > HNR3+n.BiI4n •Thuốc thử ValseMayer (Dipotassium tetraiodomercurate K2HgI4).Cơ chế: Phản ứng xảy ra giữa nguyên tử kim loại nặng (Hg) trong thuốc thử với nguyên tử nitrogen trong alkaloid tạo muối không tan có màu trắng hoặc vàng nhạt.HgCl2 + 2KI > HgI2 + 2KClHgI2 + + 2KI > K2HgI4HgI42 + HNR3+> HNR3+2.HgI42 •Thuốc thử Bertrand (SiO2 • 12WоO3 • 4Н2O)Cơ chế: Phản ứng xảy ra giữa nguyên tử kim loại nặng (Wo) trong thuốc thử với nguyên tử nitrogen trong alkaloid tạo muối không tan có màu vàng trắng.Định tính bằng phản ứng Vitali MorinSơ đồ thí nghiệmHiện tượng: xuất hiện màu tím.Kết luận: dương tínhGiải thích:•Alkaloid của Cà độc dược (chủ yếu là Atropin và Scopolamin) thuộc nhóm Tropane alkaloid. Tropane alkaloid tồn tại trong Cà độc dược dạng ester. •Khi cho vào cắn 5 giọt HNO3 đậm đặc, acid sẽ cắt đứt liên kết ester trong phân tử alkaloid tạo tropic acid, và tropine base. •Tropic acid khi tác dụng với acid HNO¬3 đậm đặc thì vòng thơm của tropic acid được gắn một nhóm NO2 vào vị trí para (chất I). Ngoài ra, nhóm NO2 cũng gắn vào vòng thơm trên phân tử alkaloid sinh ra 4nitroatropin (II). Các hợp chất nitro này có màu vàng.•Hòa tan cắn của các hợp chất nitro với acetone sau đó tác dụng với KOH 5%CH3OH. Cả 2 hợp chất nitro nay đều cho màu tím đặc trưng khi tác dụng với kiềm mạnh, do tạo ra những anion mesomeri bền vững (III). Định tính bằng sắc kí lớp mỏngTiến hànhBản mỏng: Silica gel GDung môi khai triển: Ethyl acetat methanol – amoniac đậm đặc (17:2:1)Dung dịch chuẩn: Hòa tan atropin sulfat chuẩn và scopolamin hydrobromid chuẩn trong methanol để được dung dịch có chửa mồi chất 4 mgml.Dung môi khai triển: Ethyl acetat methanol – amoniac đậm đặc (17:2:1)Triển khai sắc ký: Phát hiện bằng UV 254 và 365 nm; ngâm thuốc thử Bouchardat.Kết quảChú thích: C: dung dịch chuẩn atropin T: dung dịch thửKhi soi dưới UV bước sóng 365 nm•Mẫu thử gồm nhiều vết chỉ thị có màu: màu hồng, xanh dương,… •Mẫu chuẩn gồm 2 vết có màu xanh dương.Khi phát hiện bằng thuốc thử Bouchardat: •Mẫu chuẩn gồm 2 vết chỉ thị alkaloid rõ có màu nâu đỏ. •Mẫu thử có 1 vết có màu nâu đỏ tương ứng với mẫu chuẩn. Trong Cà đôc dược có khả năng có chứa alkaloid tương tự alkaloid chứa trong mẫu (atropin):Hệ số di chuyển Rf của vết 1 ở mẫu chuẩn RfC1=1,8 : 5 = 0,36Hệ số di chuyển Rf của vết 2 mẫu chuẩn : RfC2= 2,5:5= 0,5Hệ số di chuyển Rf của vết mẫu thử: RfT= 2,5 : 5 = 0,5Kết luận: Trong dược liệu hoa cà độc dược có chứa alkaloid, atropin 2.4. Kiểm nghiệm dược liệu Hoàng đằng 2.4.1. Bột dược liệu2.4.2 Định tính Giải thích sơ đồAlkaloid trong tự nhiên tồn tại ở dạng muối, nước acid sẽ hòa tan alkaloid, giúp kéo triệt để hoạt chất trong Hoàng đằng ra dịch chiết.Lọc qua giấy lọc để loại tạp không tan trong acid, giữ alkaloid dạng muối để định tính với các thuốc thử.Định tính với thuốc thử chungKết quả: cả 4 ống nghiệm đều không tạo tủa có màu với thuốc thử chung Kết luận: cả 4 ống nghiệm đều âm tính.Giải thích: vì berberin, palmatin trong Hoàng đằng có pKa thấp, tính base yếu nên không cho rõ phản ứng thuốc thử chung alkaloid. Ngoài ra dùng phương pháp chiết bằng acid mà không dùng chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm vì berberin và palmatin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi là berberinal, palmatinal.Định tính với thuốc thử đặc hiệuKết quả: Dùng nước Javel cho màu đỏ cam và cho dư thì mất màuKết luận: phản ứng dương tínhGiải thích: thành phần chính của Hoàng đằng là palmatin và có một ít berberin, cả 2 đều cho phản ứng đặc hiệu với nước Javel vì nước Javel có tính oxy hóa mạnh nên oxy hóa berberin thành oxyberberin là chất làm dịch có màu đỏ máu và bị mất màu nếu cho dư nước Javel vì nước Javel có tính tẩy rất mạnh nên có thể tẩy màu của dịch. OCl2 + 2NaOH > NaCl + NaClO + H2O