Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang tiêu bản mô da người trên cơ sở kỹ thuật số phân tích ảnh chụp tiêu bản.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRÊN TIÊU BẢN MÔ HỌC Tưởng Phi Vương* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang tiêu mô da người sở kỹ thuật số phân tích ảnh chụp tiêu Phương pháp: tính tỷ lệ diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang tính cường độ sáng ảnh thu phần mềm ImageJ Sử dụng test Spearson để tính tỷ số tương quan r cặp số liệu Kết quả: hai phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang thể tính xác, đơn giản, dễ áp dụng, dễ phổ biến thống cao, sử dụng cơng cụ phần mềm hồn tồn miễn phí, cho phép xử lý số liệu nghiên cứu thuật tốn thống kê * Từ khóa: Mơ da; Miễn dịch huỳnh quang; Desmoglein-1 Quantitative-Analyzing Results of Immunofluoresence Stain on Histological Slide Summary Objectives: To create and estimate effectiveness of quantitative methods for estimating immunofluorescence reactions based on digital analysis of skin tissue slide photo from confocal laser scanning microscopy Methods: Immunofluorescence reactions on cryostat sectioned and paraffin-slide of human skin were carried out with anti- desmoglein-1 antibody The total of all immunofluorescence positive areas and mean of grey level in the digital photo were calculated automatically by using ImageJ PC software Spearson test was used to analyze the correlation of this result Results: Both quantitative methods in evaluation of immunofluorescence results are simple and easy to use with high level of validation and free image processing software Beside, the immunofluorescence evaluation method based on photo grey level could help investigators more choices when statistically analyzing results of immunofluorescence reactions * Keywords: Immunofluorescence quantitative methods; Skin tissue; Desmoglein-1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với thành tựu khoa học kỹ thuật lĩnh vực y tế, đời kính hiển vi đồng tiêu quét laser nhận quan tâm nhà nghiên cứu, công cụ hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu mô bệnh học phương pháp miễn dịch huỳnh quang Kết phản ứng miễn dịch huỳnh quang biểu ảnh chụp tiêu kính hiển vi đồng tiêu quét laser với độ nhạy độ đặc hiệu cao * Viện 69, Bộ Tư Lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh Người phản hồi (Corresponding): Tưởng Phi Vương (tphivuong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 26/08/2017 Ngày báo đăng: 30/08/2017 80 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Tuy nhiên, việc đánh giá mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang ảnh mang tính định tính (có - khơng, yếu - mạnh) chưa thực khách quan Điều cho thấy cần phải xây dựng phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang để làm tăng tính xác khách quan, tin cậy kết nghiên cứu Phần mềm phân tích ảnh kỹ thuật số miễn phí chuyên dụng cho nghiên cứu y sinh ImageJ Viện Y học Quốc gia Mỹ cho phép thực ý tưởng nghiên cứu ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu mơ da người bình thường kích thước x cm, cố định dung dịch formaldehyd 4% 24 nhiệt độ phòng Phƣơng pháp nghiên cứu * Chuẩn bị mẫu mô da: - Pha mẫu mô da thành hai phần, phần để cắt lạnh phần lại đúc paraphin - Tiến hành cắt tiêu (cắt lạnh cắt từ block paraphin) dày µm (12 tiêu loại), gắn lên lam kính dung dịch dán albumin pha glycerin - Tiêu cắt từ block paraphin tẩy paraphin, sau bộc lộ kháng nguyên lò vi sóng (trong đệm citrate 10 mM, pH = 6, điện áp lò vi sóng 600 W, thời gian 30 phút) * Nhuộm miễn dịch huỳnh quang hai loại tiêu theo quy trình sau: - Rửa tiêu nhanh đệm PBS - Khử huỳnh quang không đặc hiệu NaBH 0,01% đệm PBS, lần, phút/lần - Rửa tiêu đệm PBS, lần, phút/lần - Bão hòa với huyết dê 10% PBS (30 phút, nhiệt độ phòng) - Ủ với kháng thể trực tiếp (kháng Desmoglein) đ pha lo ng 50 lần (60 phút, nhiệt độ phòng) - Rửa nhanh BSA/PBS 0,1%, lần, phút/lần - Ủ với kháng thể gián tiếp gắn huỳnh quang (AF488) nồng độ 1:200 hộp kín, đậy giấy bạc (60 phút, nhiệt độ phòng) - Rửa nhanh BSA/PBS 0,1%, lần, phút/lần - Rửa nhanh PBS, lần, phút/lần - Gắn glyxerol (glycerin: PBS = 9:1 theo tỷ lệ thể tích) - Để khơ 10 phút nhiệt độ phòng hộp kín tránh ánh - Soi tiêu nhuộm miễn dịch huỳnh quang kính LSM 700 (Carl Zeiss, Đức) với nguồn lade Ex.488 nm, cường độ 5%, master gain 600, độ phóng đại 630 lần, pihole 56 µm Chụp ảnh chế độ: ảnh bít, độ phân giải 512 x 512 pixels vị trí vi trường có phản ứng miễn dịch huỳnh quang rộng Lưu ảnh thu dạng *jpg 81 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Đánh giá kết phản ứng miễn dịch huỳnh quang phần mềm ImageJ dựa tính tốn diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang (hình 1): Hình 2: Tính cường độ sáng trung bình ảnh tiêu phần mềm ImageJ Bước 1: Nhấn open để mở ảnh Hình 1: Tính diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang phần mềm ImageJ Bước 1: Nhấn open để mở ảnh Bước 2: Nhấn image: chọn type, chọn RGB stack, ảnh mở chọn ảnh green Bước 3: Nhấn image: chọn adjust, chọn brightness/contrast, lọc bỏ grey level < 40, xong nhấn apply Bước 4: Nhấn image: chọn adjust, chọn threshold, chọn dark background, red nhấn set: chọn lower threshold level: 40 Bước 5: Nhấn analyze: chọn set measurements, chọn area, chọn area fraction, chọn limit to threshold Bước 6: Nhấn analyze: chọn measure Trên hình hiển thị bảng kết * Đánh giá kết phản ứng miễn dịch huỳnh quang phần mềm ImageJ dựa tính tốn cường độ sáng ảnh tiêu (hình 2): 82 Bước 2: Nhấn image: chọn type, chọn RGB stack, ảnh mở chọn ảnh green Bước 3: Nhấn image: chọn adjust, chọn brightness/contrast, lọc bỏ grey level < 40, xong nhấn apply Bước 4: Nhấn analyze: chọn histogram, hình đồ thị histogram với thơng số mean phía Sau thu kết tính diện tích cường độ sáng trung bình ảnh, tiến hành lập bảng x cho nhóm (nhóm tiêu cắt lạnh nhóm tiêu paraphin) sau: Mẫu Tỷ lệ diện tích Cƣờng độ sáng ảnh … * Xử lý thống kê: Sử dụng test Spearson để tính tỷ số tương quan r kết tính diện tích tính cường độ sáng ảnh TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU b c d Hình 3: Kết bộc lộ kháng nguyên desmoglein tiêu cắt lạnh (a, c) tiêu paraphin (b, d) Nhuộm miễn dịch huỳnh quang gian tiếp với kháng thể gắn huỳnh quang AF488 (Hình a, b: x100; Hình c, d: x630) Dấu ấn kháng nguyên desmoglein liên kết desmosom tiêu cắt lạnh tiêu paraphin cho kết dương tính Hình ảnh dấu ấn kháng nguyên phát thấy ranh giới tế bào (vùng liên kết hai tế bào cạnh liên kết desmosome) Tập hợp dấu ấn kháng nguyên tạo thành dạng mạng lưới đặc trưng Dấu ấn kháng nguyên bộc lộ tất lớp thượng bì với cường độ mạnh vị trí tế bào lớp gai Trên màng đáy không thấy xuất dấu ấn kháng nguyên desmoglein-1 Trong vảy sừng xuất dấu ấn kháng nguyên 83 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Sử dụng phần mềm ImageJ để tính tỷ lệ diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang cường độ sáng ảnh chụp nhóm tiêu cắt lạnh nhóm tiêu paraphin lập đồ thị tương quan kết sau: Có mối tương quan tuyến tính (r ≈ 1) kết tính tỷ lệ diện tích huỳnh quang cường độ sáng tương ứng ảnh tiêu cắt lạnh tiêu đúc paraphin với độ tin cậy cao (p < 0,00001) Nói cách khác, kết thu từ hai phương pháp đánh giá mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang tương đồng BÀN LUẬN Đồ thị 1: Mối tương quan kết tính tỷ lệ diện tích huỳnh quang cường độ sáng ảnh tiêu cắt lạnh 3.5 y = 1.0527x - 0.34 Tỉ lệ diện tích R2 = 0.9909 2.5 1.5 0.5 0 Cường độ sáng trung bình Đồ thị 2: Mối tương quan kết tính tỷ lệ diện tích huỳnh quang cường độ sáng trung bình ảnh tiêu đúc paraphin 84 Phương pháp đánh giá phản ứng miễn dịch huỳnh quang tiêu mơ dựa tính tốn diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang phần mềm ImageJ đ nhiều nghiên cứu sử dụng như: đánh giá diện tích vùng tim bị tổn thương bệnh nhân nhồi máu tim [3] hay nghiên cứu đánh giá mức độ xơ hóa gan cách tính diện tích vùng xơ sau sử dụng thuốc nhuộm collagen [1] Cũng sở nguyên tắc tính diện tích nghiên cứu này, chúng tơi vận dụng để tính diện tích vùng nhuộm miễn dịch huỳnh quang tiêu mơ, từ gián tiếp đánh giá mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang Phương pháp chọn để đối chứng cho đánh giá phản ứng miễn dịch huỳnh quang mà nghiên cứu xây dựng Phương pháp đánh giá phản ứng miễn dịch huỳnh quang thông qua số cường độ sáng ảnh, chưa thấy nghiên cứu sử dụng Ý tưởng sử dụng cường độ sáng ảnh kỹ thuật số xuất phát từ đặc điểm ảnh tiêu nhuộm huỳnh quang hiển thị vùng tín hiệu huỳnh quang tối tiêu Do đó, cường độ sáng ảnh thu phản ánh trực tiếp cường độ huỳnh quang TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 vùng vi trường tiêu Giá trị trung bình cường độ sáng ảnh khác (số lượng ảnh cần phải tính tốn nghiên cứu cụ thể để có tính đại diện cao) tiêu “đại diện” cho cường độ huỳnh quang tiêu Như vậy, phương pháp cho phép định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang tiêu mơ học Từ tạo thuận lợi để xử lý thống kê kết thu thuật toán thống kê với biến liên tục cho nhiều thông tin phương pháp thống kê với biến không liên tục (biến thứ hạng, danh mục) Bên cạnh đó, vấn đề đặt nghiên cứu mơ học nói chung có số lượng mẫu hạn chế Do vậy, sử dụng phương pháp thống kê cho biến thứ hạng (test U Mann - Whitney) biến danh mục (test Fisher) Trong trường hợp này, kết định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang hoàn toàn chuyển đổi thành bán định lượng (thứ hạng) định tính (danh mục) dựa đặc điểm ảnh kỹ thuật số Chuyển đổi thành kết bán định lượng dễ dàng thực áp dụng test U Mann - Whitney Dưới miêu tả cách thức chuyển đổi kết nhuộm miễn dịch huỳnh quang từ định lượng cường độ sáng ảnh sang định tính cường độ sáng ảnh Do ảnh thu dạng bit nên cường độ sáng trung bình dao động khoảng (đen) đến 255 đơn vị (trắng) histogram ảnh Mặt khác, mắt người có khả cảm nhận 24 khác biệt (tương đương 255/24 ≈ 10 đơn vị cường độ sáng) histogram ảnh (hình 4) Hình 4: 24 mức độ sáng mà mắt người cảm nhận khác Trên sở suy luận logic này, quy ước định tính mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang Bảng 1: Quy ước định tính mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang sở cường độ sáng ảnh chụp tiêu nhuộm miễn dịch huỳnh quang Cƣờng độ sáng ảnh tiêu nhuộm miễn dịch huỳnh quang Định tính mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang Từ - < 10 đơn vị cường độ sáng Âm tính Từ 10 - < 20 đơn vị cường độ sáng Yếu Từ 20 - < 30 đơn vị cường độ sáng Trung bình Từ 30 - < 40 đơn vị cường độ sáng Mạnh ≥ 40 Rất mạnh 85 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hoặc lập bảng x định tính phản ứng miễn dịch huỳnh quang Bảng 2: Quy ước xác định dương-âm tính phản ứng miễn dịch huỳnh quang sở cường độ sáng ảnh chụp tiêu nhuộm miễn dịch huỳnh quang Số mẫu dƣơng tính (> 10 đơn vị cƣờng độ sáng) Số mẫu âm tính Tổng (< 10 đơn vị số cƣờng độ sáng) Nhóm Nhóm Tổng số Sau sử dụng test Fisher để kiểm chứng, so sánh khác kết phản ứng miễn dịch huỳnh quang thu hai nhóm nghiên cứu Như vậy, hai phương pháp đánh giá mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang cho kết tương đồng, lựa chọn áp dụng hai phương pháp để đánh giá mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang Ưu điểm chúng mang tính định lượng, đơn giản, dễ áp dụng, phổ biến với tính thống cao, sử dụng cơng cụ phần mềm hồn tồn miễn phí Phương pháp tính cường độ sáng khơng giúp nhà nghiên cứu có thêm lựa chọn thuật tốn thống kê (có thể dùng test với biến liên tục, biến thứ hạng biến danh mục), bảo đảm linh hoạt tính tin cậy xử lý kết nghiên cứu 86 KẾT LUẬN Hai phương pháp đánh giá định lượng phản ứng miễn dịch huỳnh quang sở phân tích kỹ thuật số ảnh tiêu (tính tỷ lệ diện tích vùng xảy phản ứng miễn dịch huỳnh quang tính cường độ sáng ảnh) phần mềm ImageJ chúng tơi nghiên cứu xây dựng thể tính xác, đơn giản, dễ áp dụng, phổ biến với tính thống cao, sử dụng cơng cụ phần mềm hồn tồn miễn phí Bên cạnh đó, giúp nhà nghiên cứu có thêm nhiều lựa chọn thuật tốn thống kê (có thể dùng test với biến liên tục, biến thứ hạng biến danh mục), bảo đảm linh hoạt tin cậy xử lý kết nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Amin Ali H, Mohamed A.El-Missiry, Fatna M Elhusseini, Thuraya M.Mutawi Assessment of hepatic fibrosis by image analysis software in relation to physiological markers International Journal of Advanced Reseach 2016, (4), pp.1676-1688 Carey J Light and Photography: Exposure and Tonal Range Considerations, http://photo.tutsplus.com/articles/theory/lightphotogra-phy-exposure-and-tonal-range-considerations/2011 Olivera L.F.L, Mejia J, Carvalho E.E.V et al Myocardial infarction area quantification using high-resolution SPECT images in rats Arq Bras Cardiol 2013, 101 (1), pp.59-67 ... mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang sở cường độ sáng ảnh chụp tiêu nhuộm miễn dịch huỳnh quang Cƣờng độ sáng ảnh tiêu nhuộm miễn dịch huỳnh quang Định tính mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang. .. THÁI HỌC-2017 Hoặc lập bảng x định tính phản ứng miễn dịch huỳnh quang Bảng 2: Quy ước xác định dương-âm tính phản ứng miễn dịch huỳnh quang sở cường độ sáng ảnh chụp tiêu nhuộm miễn dịch huỳnh quang. .. dịch huỳnh quang tiêu mơ, từ gián tiếp đánh giá mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang Phương pháp chọn để đối chứng cho đánh giá phản ứng miễn dịch huỳnh quang mà nghiên cứu xây dựng Phương pháp