Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết Phát hiện corticoid pha trộn trong các chế phẩm đông dược bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng dùng phương pháp phân tích phát hiện dexamethason, betamethason prednison, prednisolon và hydrocortison trong các chế phẩm đông dược đơn giản bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN CORTICOID PHA TRỘN TRONG CÁC CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỚP MỎNG Lê Đào Khánh Long*, Vũ Văn Hiếu*, Trương Ngọc Huyền*, Trần Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp phân tích phát dexamethason, betamethason prednison, prednisolon hydrocortison chế phẩm Đông Dược đơn giản phương pháp sắc ký lớp mỏng Đối tượng: dexamethason, betamethason prednison, prednisolon hydrocortison công thức giả lập chế phẩm Đông dược lưu hành thị trường Phương pháp: Khảo sát công thức y học cổ truyền chế phẩm sử dụng thị trường để xây dựng công thức giả lập cho việc khảo sát việc chiết xuất, tinh chế phân tích corticoid chế phẩm Phương pháp chiết, dung môi chiết corticoid khỏi chế phẩm điều kiện loại tạp khảo sát Các điều kiện sắc ký lớp mỏng xác định cho việc định tính corticoid ứng dụng chúng chế phẩm thu thập thị trường Kết quả: xây dựng công thức giả lập gồm dược liệu thường dùng công thức y học cổ truyền chế phẩm thường gặp thị trường để khảo sát điều kiện chiết xuất sắc ký corticoid Phương pháp chiết xuất siêu âm kết hợp với chiết phân bố lỏng-lỏng chọn phương pháp chiết corticoid khỏi chế phẩm Các hệ dung môi để tách corticoid khỏi hỗn hợp xác định Để phát corticoid lớp mỏng, thuốc thử xanh tetrazolium cho kết nhanh, nhiên, thuốc thử H2SO4/cồn có formaldehyd lại có giới hạn phát thấp Giới hạn phát corticoid hỗn hợp mẫu thay đổi từ 0,3 μg đến 0,08 μg, tuỳ thuộc vào chất thuốc thử sử dụng Trong 26 mẫu đông dược lấy từ thị trường, mẫu (22%) cho thấy có dexamethason betamethason Chưa phát có prednison, prednisolon hay hydrocortison Kết luận: Phương pháp sắc ký lớp mỏng phương pháp đơn giản, dễ thực thực nhiều phòng thí nghiệm Tuy giới hạn phát cao, phương pháp phát nhiều trường hợp pha trộn corticoid trái phép chế phẩm ABSTRACT DETERMINATION OF CORTICOID ADULTERANTS IN HERBAL MEDICINES BY THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY Le Dao Khanh Long, Vu Van Hieu, Truong Ngoc Huyen, Tran Hung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 617 - 621 Objective: the aims of this research were to find out conditions for extraction and analysis procedures to detect common corticoid adulterants in herbal medicines by using TLC Subjects: Authentic standards of dexamethasone, betamethasone, prednisone, prednisolone, hydrocortisone acetate, dexamethasone acetate and oriental medicines obtained from market Method: Establishing a simulation formula consisting of herbs that are frequently used in traditional formulas and medicines in order to investigate the extraction-purification procedure of corticoids Finding TLC conditions for analysis of these corticoids and applying this procedure to analyze herbal preparations *Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại Học Y Dược TpHCM Tác giả liên hệ: PGS TS Trần Hùng ĐT: 0918057096 Email: tranhung@uphcm.edu.com Chuyên Đề Dược Khoa 617 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Results: A simulation formula consisting of herbs that are frequently used in traditional formulas and medicines were established for investigation of extraction-purification and analysis procedure of corticoids Ultrasonic solvent extraction, liquid-liquid distribution was proved a suitable sample extract and clean-up; TLC conditions for analysis of these corticoids were studied and applied to analyze herbal preparations Blue tetrazolium was a fast develop and good reagent for visualization However, sulfuric acid-formalin solution in ethanol had a lowest detection limit Detection limits of corticoid in simulation formulas ranged from 0.3 μg to 0.08 μg per spot depending on individual corticoids Of the 27 oriental medicines from the market, cortisone and betamethasone were detected in samples (22%) Prednisone, prednisolone and hydrocortisone were found in none of them Conclusion: Procedures of TLC analyses of corticoids adulterant in herbal preparations by TLC were established Although the LODs were not as high as other methods, it is a simple, easy to use and reliability enough for quality control of herbal medicines in common cases Key words: corticoids, herbal medicines, TLC, dexamethasone, betamethasone, prednisone, prednisolone, hydrocortisone acetate chế phẩm, phương pháp định tính phát ĐẶT VẤN ĐỀ corticoid pha trộn chế phẩm Đông Ngày nay, bên cạnh phương pháp trị liệu dược sắc ký lớp mỏng nghiên cứu y học đại, phương pháp chữa bệnh theo nhằm xây dựng số phương pháp chiết xuất y học cổ truyền thuốc có nguồn gốc tự sắc ký lớp mỏng phát dexamethason, nhiên ngày người dân quan tâm sử betamethason prednison, prednisolon dụng xu hướng quay với thiên nhiên hydrocortison chế phẩm đơng dược người sử dụng mức độ an tồn dùng lâu ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP dài thuốc Tuy vậy, nhiều sở sản xuất NGHIÊN CỨU thuốc thuốc có nguồn gốc tự nhiên pha trộn trái phép chất tổng hợp nhằm đánh lừa Đối tượng nghiên cứu người sử dụng hiệu nhanh chúng Các dược liệu sử dụng cho thuốc giả lập Hậu việc dùng thuốc gồm Cam thảo, Độc hoạt, Đỗ trọng, Đương quy, trầm trọng khó lường trước Ngưu tất, Phòng phong Thổ phục linh Corticoid hoá chất thường Các chất chuẩn corticoid bao gồm: pha trộn nhằm gia tăng tác dụng kháng dexamethason (DXM), dexamethason acetat viêm, giảm đau, chống dị ứng chế phẩm (DA), betamethason (BTM), prednison (P), Sử dụng corticoid thời gian dài gây prednisolon (PL), hydrocortison acetat (HA) hội chứng cushing, loét dày tá tràng, tình mua Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ trạng loãng xương, suy giảm chức tuyến Chí Minh thượng thận… Việc phát diện Các sản phẩm đông dược mua từ corticoid chế phẩm đông dược gặp nhà thuốc, chủ yếu khu vực Tp HCM nhiều khó khăn hàm lượng thấp chất cần phát hiện, phức tạp mẫu thử Hầu hết Phương pháp nghiên cứu việc định tính định lượng corticoid Khảo sát tần suất sử dụng dược liệu chế phẩm đông dược thực phẩm chức thường dùng chế phẩm trị phong thấp, dựa hệ thống phân tích đại kiện tỳ thị trường để xây dựng công LC-UV, LC-MS, GC-MS mà thức thuốc giả lập để khảo sát việc phát phòng thí nghiệm có Để tìm corticoid Các dược liệu xác định chất lượng phương pháp đơn giản mà phát trước sử dụng theo dược điển Việt nam corticoid pha trộn trái phép 618 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Xây dựng quy trình chiết – loại tạp cho Nghiên cứu Y học điều kiện sắc ký khả phát corticoid công thức giả lập dựa kết corticoid chế phẩm đông dược khảo sát phương pháp dung môi chiết, KẾT QUẢ loại tạp Công thức giả lập Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng bao gồm hệ dung môi, thuốc thử (TT) phát hiện, giới hạn phát corticoid riêng lẻ hay hỗn hợp mẫu giả lập Áp dụng điều kiện phân tích vào sản phẩm thu nhập từ thị trường có tác dụng trị phong thấp, kiện tỳ bao gồm dạng thuốc hoàn, viên nang, viên nén, dung dịch thuốc nước Đánh giá quy trình chiết xuất loại tạp Từ tài liệu thuốc YHCT, thuốc dân gian sản phẩm có thị trường dùng làm thuốc bổ tỳ vị, trừ phong thấp, tiến hành thực khảo sát tần suất xuất vị thuốc để lựa chọn vị thuốc có tần suất sử dụng cao Kết vị thuốc có tần suất sử dụng cao sử dụng thuốc giả lập (Bảng 1) Các dược liệu sử dụng phải đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt nam III trước sử dụng Bảng Bài thuốc giả lập Dược liệu Cam thảo Độc hoạt Đỗ trọng Đương quy Ngưu tất Phòng phong Thổ phục linh Tên khoa học Glycyrrhiza uralensis Fisch., G inflata Bat G glabra L Angelica pubescens Maxim Eucommia ulmoides Oliv Angelica sinensis (Oliv.) Diels Achyranthes bidentata Blume Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk Smilax glabra Roxb Khảo sát quy trình chiết xuất – loại tạp Qua khảo sát, đánh giá dung môi chiết, khả loại tạp, khả hoà tan chất cần chiết, mức độ hao hụt chất cần chiết yếu tố ảnh hưởng… quy trình chiết xuất chọn sau: dược liệu chiết loại tạp nhexan (chiết bể siêu âm lần, tỉ lệ mẫu:dung môi = 1/20; 1/20 1/10) sau MeOH-H2O (3:7) pH với số lần lượng dung môi tương tự để chiết corticoid Dịch methanol-nước loại tạp cách phân bố với ether dầu dùng ethyl acetat để chiết lấy corticoid Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng Khảo sát hệ dung môi tách corticoid sắc ký lớp mỏng Kết khảo sát khả tách corticoid sắc ký lớp mỏng (SKLM) thu số dung môi tách tốt sau: Chuyên Đề Dược Khoa Hoạt chất Liều lượng Flavonoid, saponin 1g Acid béo, sterol, angelicol 2g Alkaloid, glycosid, chất nhựa 3g Tinh dầu 3g Saponin, sterol 3g Glycosid đắng, tinh dầu 2g Saponin, chất nhựa, tanin 3g Hệ 1: Benzen (120:60:18:1) - Et2O-acid acetic-H2O Hệ 2: Toluen - EtOAc-H2O (7:3:5) Hệ 3: CHCl3 - EtOAc (9:1) Hệ 4: CHCl3 – Aceton - H2O (8:2:5) Hệ 5: CHCl3 - MeOH (9:1) Các hệ dung môi tách tốt corticoid khỏi khỏi thành phần chế phẩm giả lập Tuy nhiên, với hai đồng phân lập thể DXM BTM chưa tốt hai vết chồng lên sắc đồ Kết khảo sát hệ dung môi nhằm tách hai corticoid thu hệ dung môi: Toluen - EtOAc - H2O (7:3:5) CHCl3 - EtOH (9:1) Et2O - EtOAc (1:4) Et2O - EtOAc - H2O (2:8:5) BuOAc - EtOAc (8:2) 619 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Khảo điều kiện phát corticoid SKLM Từ kết khảo sát 30 phương pháp phát corticoid SKLM, chọn điều kiện phát là: soi đèn UV 254 nm, thuốc thử xanh tetrazolium, dung dịch H2SO4/cồn có formaldehyd Phương pháp phát thuốc thử đơn giản, dễ sử dụng dễ phát corticoid Trên sắc đồ sắc ký lớp mỏng, thuốc thử xanh tetrazolium cho màu tím với corticoid cho màu tím với vài chất khác dịch chiết; màu tím corticoid xuất sau phun thuốc thử, vết dịch chiết có màu để lâu sau xuất Dung dịch H2SO4 có formaldehyd sau sấy quan sát UV 365 nm cho màu cam với corticoid phân biệt với chất khác dịch chiết Tuy nhiên, vết cần tách riêng Một số thuốc thử acid phosphomolybdic cho màu xanh dương tất chất kể chất có dịch chiết, khơng phân biệt với corticoid Một số thuốc thử anisaldehyd - sulfuric, vanillin - sulfuric cho vết màu khác biệt khó phân biệt Thuốc thử vanillin sulfuric cho màu chàm với BTM, xám đậm với DA DXM xanh dương với prednison prednisolon Thuốc thử anisaldehyd - sulfuric cho màu vàng chanh với DA, DXM, prednison, prednisolon; cho màu cam nhạt với BTM HA Lượng thuốc thử, nhiệt độ sấy, thời gian sấy ảnh hưởng đến việc lên màu thuốc thử Qua kết thử nghiệm, tetrazolium chọn thuốc thử đặc hiệu với corticoid Giới hạn phát corticoid SKLM Kết xác định giới hạn phát corticoid vết sắc ký đồ mẫu chuẩn pha dung môi mẫu chuẩn chế phẩm giả lập trình bày Bảng Bảng Giới hạn phát chất chuẩn Lượng chất chuẩn phát UV 254 nm TT Xanh tetrazolium TT H2SO4/cồn có formaldehyd DXM 0,07 µg 0,3 µg 0,03 µg DA 0,08 µg 0,3 µg 0,03 µg BTM 0,04 µg 0,08 µg 0,02 µg HA Prednison Prednisolon 0,04 µg 0,04 µg 0,04 µg 0,2 µg 0,1 µg 0,1 µg 0,016 µg 0,02 µg 0,02 µg Bảng Giới hạn phát chất chuẩn dịch chiết chế phẩm giả lập Lượng chất chuẩn phát UV 254 nm TT Xanh tetrazolium TT H2SO4/cồn có formaldehyd DXM 0,1 µg 0,3 µg 0,08 µg Kết khảo sát giới hạn phát corticoid sắc ký lớp mỏng cho thấy BTM phát lượng thấp so với DXM DA chất chuẩn chế phẩm giả lập với tất phương pháp phát Giới hạn phát prednison prenisolon gần Nhìn chung, corticoid có giới hạn phát coi tương đương Tuy nhiên, việc giới hạn phát corticoid phụ thuộc vào cảm quan nên mức độ xác gần giới hạn thấp 620 DA 0,1 µg 0,3 µg 0,1 µg BTM 0,1 µg 0,1 µg 0,05 µg HA Prednison Prednisolon 0,04 µg 0,2 µg 0,2 µg 0,2 µg 0,3 µg 0,3 µg 0,016 µg 0,1 µg 0,2 µg Ứng dụng phương pháp phát corticoid sản phẩm thị trường Áp dụng kết khảo sát với 26 mẫu chế phẩm đông dược thu mua thị trường, phát mẫu có pha trộn cortioid (Bảng 4) Việc xác định sơ hàm lượng chất chế phẩm dựa so sánh diện tích cường độ vết sắc dồ so với giai mẫu chất chuẩn Bảng Kết phân tích khối phổ số sản phẩm Mã số sản phẩm Corticoid phát H2L03HC BTM (0,010% đến 0,030%) H2L05NA BTM (0,010% đến 0,030%) Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Mã số sản phẩm Corticoid phát H2L06TN BTM (0,010% đến 0,030%) H2L22NA DXM (0,03% đến 0,05%) H2L23NA DXM (0,03% đến 0,05%) H2L16NA DXM (> 0,050%) H2L17NA DXM (> 0,050%) KẾT LUẬN Để phát corticoid pha trộn trái phép chế phẩm đông dược, đề tài xây dựng công thức giả lập gồm dược liệu có tần suất xuất cao chế phẩm thị trường phương thuốc y học cổ truyền Công thức giả lập sử dụng nghiên cứu việc phát chất sắc ký lớp mỏng sử dụng cho nghiên cứu Từ xây dựng quy trình chiết xuất – loai tạp tối ưu cho việc phát corticoid sắc ký lớp mỏng Các điều kiện phân tích sắc ký hệ dung môi, thuốc thử phát giới hạn phát chất xác định Kiểm tra phương pháp thử phân tích chế phẩm có thị Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học trường phát gần 1/3 26 sản phẩm có pha trộn corticoid dexamathason, betamethason, dexamethason dạng acetat Phương pháp dể dàng áp dụng sở phân tích địa phương chưa có điều kiện có thiết bị phân tích đại Các kết cho thấy, dù phương pháp đơn giản, độ nhạy thấp đủ để phát mẫu có corticoid nhiều trường hợp Các nghiên cứu phát corticoid phương tiện đại HPLC-UV, HPLC-MS, HPLC-MS/MS thực báo cáo báo TÀI LIỆU THAM KHẢO Huetos Olga (1999),“Determination of Dexamethason in feed by TLC and HPLC”, Analyst, 124, 1583-1587 Nguyễn Văn Thị, Nguyễn Thị Kim Danh (2002) Xây dựng quy trình chiết xuất Dexamethason acetat cyproheptadin hydroclorid trộn trái phép chế phẩm Đơng dược, Y học TP Hồ Chí Minh Vũ Thị Mỹ Hương (2008) Phát corticoid pha trộn chế phẩm Đơng dược, Khóa luận dược sĩ Đại học, Khoa dược, ĐHYD TpHCM 621 ... cyproheptadin hydroclorid trộn trái phép chế phẩm Đông dược, Y học TP Hồ Chí Minh Vũ Thị Mỹ Hương (2008) Phát corticoid pha trộn chế phẩm Đông dược, Khóa luận dược sĩ Đại học, Khoa dược, ĐHYD TpHCM 621... tạp cách phân bố với ether dầu dùng ethyl acetat để chiết lấy corticoid Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng Khảo sát hệ dung môi tách corticoid sắc ký lớp mỏng Kết khảo sát khả tách corticoid sắc. .. chất sắc ký lớp mỏng sử dụng cho nghiên cứu Từ xây dựng quy trình chiết xuất – loai tạp tối ưu cho việc phát corticoid sắc ký lớp mỏng Các điều kiện phân tích sắc ký hệ dung môi, thuốc thử phát giới