Đang tải... (xem toàn văn)
Tiếp nối phần 1, phần 2 của giáo trình Sản xuất protein trong Y học trình bày về vectors; tạo dòng gen; xác định gen; tạo đột biến; sản xuất và tinh sạch protein; phân tích hậu genome. Giáo trình phục vụ cho các bạn chuyên ngành Y học và những bạn quan tâm tới lĩnh vực này.
Sản xuất protein y học CHƯƠNG VECTORS Vectơ phân tử DNA tái tổ hợp mà sử dụng để mang đoạn DNA ngoại lai Các đoạn DNA tạo dòng vectơ đạt với số lượng đủ lớn cho thao tác phòng thí nghiệm Các vecto dựa vào trình tự DNA sửa đổi kết hợp để thực chức khác Việc lựa chọn vecto dựa vào kích thước phân tử DNA chèn vào Các Vecto khai thác cho nhiều mục đích khác nhau: sản xuất sợi đơn DNA, biểu cấp độ cao gen mã hóa protein, việc sản xuất RNA Phần lớn thí nghiệm nhân dòng vơ tính phân tử sử dụng vi khuẩn E coli cho nhân dòng DNA vơ tính Thậm chí nơi đưa đoạn DNA vơ tính vào tế bào eukaryote Các cấu trúc DNA luôn sản xuất E.coli trước sau đưa vào vật chủ cuối Việc nhân dòng vơ tính khả thi với ưu điểm E.coli nên sử dụng rộng rãi kĩ thuật di truyền E.coli, đặt tên từ nhà vật lý học người Đức Theodor Escherich (1857–1911) vi khuẩn gram âm, hình que di chuyển cách quay nhanh lơng roi Có nhiều miệng ruột người giúp bảo vệ vùng ruột khỏi vi khuẩn truyền bệnh, giúp tiêu hóa sản xuất lượng nhỏ vitamin B12 K Như sinh vật sử dụng phòng thí nghiệm, E.coli có ưu điểm sau: Dễ dàng tăng trưởng mơi trường đơn giản, tốn Là sinh vật có khả nhân đơi nhanh chóng khoảng 20-30 phút phase log Bộ máy di truyền học hiểu rõ Sử dụng E.coli phòng thí nghiệm thường an tồn ngăn chặn đột biến cho chúng khơng mơi trường phòng thí nghiệm Có gen xắp sếp lập chuỗi 83 Sản xuất protein y học Các nhiễm sắc thể phụ DNA (các Plasmid thể thực khuẩn DNA) lợi dụng để mang DNA ngoại lai Các tế bào E.coli hầu hết sinh sản vô tính để tăng tính đa dạng tăng tính truyền đạt thơng tin gen, chúng có cấu để chuyển vật chất di truyền từ vi khuẩn đến loài khác Trở lại thập niên 1940 tế bào vi khuẩn cho có khả trao đổi vật chất di truyền với loài bán giới tính Thí nghiệm Lederberg and Tatum mơ tả rõ ràng vận chuyển thông tin di truyền thông qua tiếp hợp vi khuẩn Khả để thực vận chuyển từ gen gọi F Những gen tồn mảnh vòng DNA mà chép lại cách độc lập từ nhiễm sắc thể vi khuẩn, chúng hợp vào nhiễm sắc thể Vi khuẩn mang gen ( thường vi khuẩn đực) dùng tua để bám vào vi khuẩn gần nó, tế bào kéo lại gần nhau, DNA chuyển từ vi khuẩn đến vi khuẩn Có biểu hiển nhân tố di truyền: .F hay Fepisome phân tử sợi đơi DNA tròn, lớn mà mang gen di truyền, giữ vi khuẩn sợi nhiễm sắc thể phụ plasmid .Hfr: thành tố F hợp vào gen E.coli Khi tiếp hợp xảy ra, gen F di chuyển qua tua kéo theo phần lại gen sau chúng Cuối tua bị đứt, gen khơng chuyển hồn tồn Bộ gen vi khuẩn đo nhiều phút từ bắt đầu chuyển với lược thời gian cần cho gen riêng biệt để chuyển từ vi khuẩn đến vi khuẩn cho biết kể từ bắt đầu chép .F’ : phân tử sợi đôi DNA mang gen di truyền số loại gen khác Những gen vận chuyển với hiệu suất cao độ dài sợi DNA chuyển ngắn đủ để di chuyển dọc theo khúc nối tế bào vi khuẩn trước tua bị đứt Khả F’ episome để tái tổ hợp giữ thực thể tách biệt với nhiễm sắc thể vi khuẩn làm lý tưởng để mang trình tự DNA ngoại lai Tuy nhiên kích thước F’ episome ngăn cản phân tích thao tác thuộc tính gen chuyển làm cho khơng ổn định Về tổng quan DNA ngoại lai cần mang vecto để bảo đảm truyền tái tổ hợp tế bào vật chủ Vecto mô tả tốt trình tự DNA tự tái tổ hợp mà dùng để mang DNA ngoại lai Các vecto có tảng dựa chuỗi DNA tìm thấy tái tổ hợp hình thức khác Hầu hết vecto sử dụng dựa vào plasmid thực khuẩn λ Tổng quan, vecto xem môdun riêng biệt mà cung cấp điều kiện thiết yếu cho việc nhân dòng vơ tính phân tử hiệu suất cao Các vecto sử dụng tái tổ hợp DNA thường quy cho vecto dòng vơ tính, sử dụng cho biểu gen mang DNA dòng vơ tính, gọi vecto biểu Các vecto phải mang đặc điểm sau để làm cho trở nên hữu dụng nhân dòng vơ tính phân tử: 84 Sản xuất protein y học Có khả tự chép Có tính chọn lọc để nhận diện tế bào biến đổi với tế bào chưa biến đổi Thêm vào hầu hết vecto chứa vùng enzyme nhận diện giới hạn đoạn DNA nhân dòng vơ tính vào vecto cách dễ dàng Một mạng lưới lớn loại vecto sử dụng ngày nay, với tính chất chuyên biệt cao thiết kế để thực chức đặc trưng Trong chương bàn vài điểm tổng quan việc thiết kế vecto, tập trung vào vecto dùng thí nghiệm dòng vơ tính 3.1 PLASMID Plasmid thường tìm thấy đoạn DNA thuộc nhiễm sắc thể phụ mà hệ fromone thừa hưởng ổn định từ vùng nhiễm sắc thể phụ khác Plasmid phân tán rộng rãi prokaryote khoảng 1500bp đến 300kbp Hầu hết plasmid diện phân tử sợi đôi DNA vòng kín thường có kiểu hình riêng biệt tế bào vi khuẩn, nơi mà chúng chép lại Đó plasmid thường mang gen mã hóa để chống lại tác nhân kháng sinh kim loại nặng, để sản xuất nguồn DNA hạn chế enzyme sửa chữa, thứ mà vi khuẩn bình thường khơng có Sự chép plasmid thường ghép đôi với tế bào chủ nơi mà chúng giữ lại, với chép plasmid chép lại gen tế bào vật chủ Plasmid thường mô tả dư dả (relaxed) khan (stringent) dựa vào lượng plasmid giữ tế bào, plasmid dư tức nhiều giữ lại tế bào(10-200), plasmid khan diện tế bào.Nền tảng khác cấu khác thực plasmid để tự nhân đơi Nói chung,plasmid dư thừa sử dụng vật chủ có nguồn gốc từ protein, plasmid khan mã hóa nhân tố protein cần thiết cho nhân đôi chúng Hầu hết plasmid sử dụng ngày dựa nguồn gốc tự nhân đơi tìm thấy plasmid E.coli ColE1 họ hàng gần pMB1 ColE1 phân tử DNA vòng đóng dài 6646bp mã hóa cho tác nhân kháng sinh vi khuẩn, 85 Sản xuất protein y học colicin E1 gen đề kháng mà giúp vi khuẩn vật chủ thoát khỏi ảnh hưởng tác nhân kháng sinh Colicin E1 protein vận chuyển màng gây nên khử cực gây chết màng vi khuẩn (Konisky Tokuda, 1979) Gen kháng thuốc mã hóa cho protein ngăn cản hoạt động Colicin cách kiềm chế khả hình thành kênh xuyên màng vi khuẩn (Zhang Cramer, 1993) Vi khuẩn có chứa pladmid ColE1 khác biệt so với vi khuẩn khơng chứa plasmid chúng có khả phát triển dĩa có chứa colicin E1 Tuy nhiên việc bảo vệ cho trình phát triển khó khăn lâu kể từ kĩ thuật bảo vệ thuốc kháng sinh khơng sử dụng Plasmid ColE1 chép theo kiểu độc lập sử dụng DNA polymerase cung cấp từ tế bào vật chủ Không giống nguồn gốc chép thuộc vi khuẩn, sao chép ColE1 diễn theo chiều Plasmid khơng mã hóa cho protein khởi sướng q trình chép lại mã hóa cho phân tử RNA khơng dịch mã, RNA có liên quan đến khởi sướng trình chép protein đóng vai trò điều hòa phân tử RNA Nguồn nhân đôi DNA ColE1 vùng DNA mà phân tử RNA (RNAI RNA II) phiên mã từ nguồn khởi xướng chúng (hình 3.2) RNA II bổ sung vào gốc chép ColE1 gắn vào hình thành nên dạng lai DNA-RNA (Cesarenivà cộng sự, 1991) Phân tử gắn RNA II tách từ gốc, enzyme mã hóa vật chủ RNase H đáp ứng đoạn mồi nơi mà chép DNA xảy Trong trình bắt cặp base, RNAII gắn lên sợi DNA, kể từ chép DNA đơn hướng Hình 3.2: Plasmid ColE1 gốc chép Plasmid ColE1 sợi đơi DNA vòng kín, dài 6646bp Nó mã hóa cho tác nhân kháng sinh vi khuẩn colicin E1 protein miễn dịch giúp ngăn ảnh hưởng từ chất độc tác nhân kháng khuẩn có plasmid Sự chép DNA xảy theo hướng từ mũi tên ori Hai phân tử RNA chưa phiên mã, gọi RNAI RNAII, sản phẩm protein gen rop điều khiển trình chép Mũi tên gen cho thấy chiều hướng phiên mã 86 Sản xuất protein y học Điều khiển trình chép thực phân tử RNA chưa phiên mã khác RNAI bổ xung vào gốc 5’ RNAII dạng RNA kép RNAI RNAII thực đoạn mồi cho chép RNAI có tồn tương đối ngắn, plasmid ColE1 giữ mức 15-20 tế bào Sự tương tác RNAI RNAII giữ ổn định protein ROP(Helmer-Citterichvà cộng sự, 1988) Cơ cấu chép DNA thực ColE1 có số vai trò quan trọng, plasmid với gốc chép tồn tế bào RNAI gốc plasmid ngăn cản RNAII plasmid vào để khỏi hình thành đoạn mồi, khơng gọi chép Điều quan trọng thí nghiệm nhân dòng vơ tính mà tập hợp plasmid hòa trộn, điều mà tạo phản ứng thắt nút, chuyển vào vi khuẩn Các cá thể chuyển theo phương pháp mang plasmid đơn mà tập hợp Các Plasmid với gốc chép khác tồn tế bào MỘt hệ cấu chép ColE1 tổng hợp DNA không cần khởi sướng chép DNA Sự diện yếu tố kháng sinh mà ngăn cản tổng hợp protein, chép DNA nhiễm sắc thể bị ngừng lại với plasmid tảng ColE1 tiếp tục chép tích lũy với nồng độ cao (1000–2000 tế bào) (Clewell, 1972) 3.1.1 pBR322 ColE1 tương ứng với pMB1, hữu dụng nhân dòng vơ tính vecto chúng lại có số bất lợi Đầu tiên, khó khăn việc nhận diện plasmid tái tổ hợp làm chúng không sử rộng rãi Cần plasmid chép giống với cách ColE1, phải plasmid dễ nhận diện Plasmid pBR322 lần sử dụng vecto plasmid, plasmid nhỏ (4363bp) cấu thành từ plasmid tự nhiên đoạn DNA khác (Bolivar cộng sự, 1977) pBR322 mang thành phần sau Gốc chép : pBR322 mang gốc chép ColE1 gen rop để bảo đảm lượng plasmid hợp lý ( 15-20 tế bào) tăng lên 200 vòng nhờ khuyếch đại chloramphenicol Gen kháng kháng sinh: pBR322 mang gen mà sử dụng tín hiệu chọn lọc Gen kháng ampicilin nhân dòng vơ tính vào plasmid nhờ 87 Sản xuất protein y học gen nhảy Tn3 Gen kháng tetracyline nhân dòng vơ tính từ plasmid pSC101 (Bernardi Bernardi, 1984) Vùng nhân dòng vơ tính: plasmid mang vùng nhận diện enzyme giới hạn.một vài số có cac gen kháng kháng sinh Ví dụ vùng cho PstI, PvuI SacI tìm thấy gen kháng ampicilin vùng cho amHI HindIII gen kháng tetracylin Các gen kháng kháng sinh pBR322 cho phép chọn lọc trực tiếp chất tái tổ hợp chu trình gọi bất hoạt vùng gắn (insertional inactivation) Ví dụ, muốn nhân dòng vơ tính đoạn DNA vào vùng BamHI pBR322, sau DNA gắn làm ngắt quãng vai trò gen KHÁNG chống tetracilin, vai trò gen chống ampicilin không bị thay đổi Các tế bào biến đổi ni đĩa thí nghiệm mang ampicilin để diệt hết tất tế không mang plasmid Sau cho phát triển tiếp mội trường có ampicilin tetracilin Những tế bào phát triển có ampicilin lại chết chọn lọc tetracilin mang plasmid có DNA gắn vào Nói cách khác, thêm vào đoạn DNA ngoại lai vào gen kháng kháng sinh làm bất hoạt gen dẫn tới tính nhạy cảm với yếu tố kháng sinh Hình 3.4 Sự lồng vào yếu tố gây bất hoạt gen kháng kháng sinh pBR322 Nếu đoạn DNA lồng vào vùng nhận diện enzyme giới hạn BamHI bên gen tetracyline, gây plasmid tái tổ hợp chuyển vào vi khuẩn 88 Sản xuất protein y học đem lại sống môi trường chứa ampiciline xúc tiến phát triển môi trường chứa tetracilin Gen kháng Tetracilin bất hoạt mặt chức có mặt DNA gắn 3.1.2 pUC plasmid PBR322 đột phá lĩnh vực sinh học phân tử plasmid lần sử dụng nhân dòng vơ tính phân tử tiêu tốn thời gian dể gặp lỗi Vào 1982 chuỗi plasmid phát triển cho phép nhận diện tế bào mang DNA ngoại lai bước sàng lọc đơn plasmid pUC (Vieira Messing, 1982) Nó có đặc tính quan so với pBR322 Lượng lớn – đột biến gốc chép sản xuất 500-600 plasmid tế bào mà không cần dùng tác nhân khuyếch đại chloroamphenicol Sàng lọc xanh- trắng – Sàng lọc theo kiểu dạng đặc biệt hoạt hóa vùng gắn Nhiều vùng nhân dòng vơ tính Đây loại DNA nhân tạo mà chứa trình tự nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn Nó gắn vào phần vecto mã hóa β-galactosidase α-peptide theo chiều hướng để khơng ảnh hưởng đến chức biểu Tuy nhiên việc gắn DNA ngoại lai vào luôn làm phá vỡ hoạt động α-peptide Do cụm tái tổ hợp màu trắng cụm khơng tái tổ hợp lại chuyển xanh Hình 3.5- pUC plasmid Ưu điểm pUC plasmid so với pBR322 đoạn DNA ngoại lai nhân dòng vào nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn khác chất tái tổ hợp nhanh chóng sàng lọc Thêm vào gốc α-bổ trợ cần gen nhỏ để mang plasmid DNA mã hóa α-peptide chuỗi pUC vecto nhỏ 400bp Nếu toàn khung đọc mở LacZ cần đến, 3500bp giữ lại vecto Nói chung, ổn định nhiều vecto plasmid giảm 89 Sản xuất protein y học chiều dài chúng tăng Kết giới hạn chiều dài DNA nhân dòng vơ tính vào plasmid riêng biệt Ví dụ, khả tế bào vi khuẩn plasmid pUC tái tổ hợp giảm mạnh kích thước chúng đạt đến 15kbp 3.2 Lựa chọn thị (Dấu chuẩn chọn lọc) Một đặc điểm plasmid chúng tạo điều kiện cho vector dễ dàng phát Các plasmid sử dụng thường xuyên vector thí nghiệm tạo dòng Nhiều loại plasmid tìm thấy tự nhiên vi khuẩn số nấm men Việc lựa chọn đánh dấu thường phụ thuộc vào tế bào vật chủ chuyển Một số dấu hiệu có chức với sinh vật nhân sơ, số khác có tác động rộng Một số dấu hiệu thường sử dụng lựa chọn liệt kê đây, với chế hoạt động chúng Ampicillin – gắn vào ức chế số enzym màng tế bào vi khuẩn có liên quan đến tổng hợp thành tế bào Gram âm Do đó, tế bào khơng nhân trường hợp có diện ampicillin Các gene kháng ampicillin (AMPR bla) mã hóa cho enzyme β-lactamase tổng vào khe quanh tế bào chất vi khuẩn, nơi mà xúc tác thủy phân vòng β-lactam ampicillin Do đó, sản phẩm gen AMPR làm hiệu lực chất kháng sinh Theo thời gian ampicillin môi trường nuôi cấy đĩa petri bị hiệu lực rõ β-lactamase Khi điều xảy ra, sức ép chọn lọc để trì plasmid khơng quần thể tế bào phát sinh mà khơng có plasmid Tetracycline – kết hợp với protein tiểu đơn vị 30S ribosom để ức chế di chuyển ribosome dọc theo mRNA cản trở trình dịch mã tổng hợp protein Các gen kháng tetracycline (TETR) mã hóa 399 amino acid bên màng liên quan đến protein tế bào Gram âm ngăn chặn kháng sinh xâm nhập vào tế bào Như vậy, gene kháng thuốc không làm hiệu lực kháng sinh Sức ép chọn lọc trì suốt trình ni cấy tế bào để giữ cho plasmid có chứa gene kháng thuốc Chloramphenicol – kết hợp với tiểu đơn vị 50S ribosome để ức chế tổng hợp protein Các chloroamphenicol acetyltransferase (CAT) mã hóa gen kháng chloramphenicol (CMR) Các protein CAT bốn (tetrameric) bào thể protein, diện acetyl coenzyme A, xúc tác hình thành chất dẫn xuất hydroxyl acetoxy chloramphenicol khơng thể liên kết với ribosome Như với ampicillin, sản phẩm gen CMR làm hiệu lực chất kháng sinh Kanamycin neomycin – kết hợp với thành phần ribosome hạn chế tổng hợp protein Các protein tổng hợp mã hóa gene KANR tổng hợp khe quanh tế bào chất cản trở việc vận chuyển chất kháng sinh vào tế bào Giống gene kháng tetracycline, gene KANR không làm hiệu lực chất kháng sinh Bleomycin zeocin – kháng sinh glycopeptide liên kết với DNA ức chế DNA tổng hợp RNA Chúng tác động chống lại hầu hết vi khuẩn (bao gồm E Coli), vi sinh vật có nhân điển hình (ví dụ nấm men), tế bào thực vật 90 Sản xuất protein y học tế bào động vật Các gene Sh ble từ vi khuẩn Streptoalloteichus hindustanus mã hóa protein nhỏ có đề kháng zeocin cách gắn vào chất kháng sinh (Gatignol, Durand Tiraby, 1988) Hygromycin B - ức chế cách can thiệp dịch chuyển vị ribosome Kháng sinh tác động chống lại hai sinh vật nhân sơ sinh vật nhân chuẩn Các gen kháng (HYGR, mã hóa hygromycin-B-phosphotransferase) bất hoạt kháng sinh phosphoryl hóa Mặc dù vectơ plasmid sử dụng rộng rãi sử dụng nhiều ứng dụng việc tạo dòng thiết kế với mục đích tạo nhiều chức Những chức số thảo luận chương sau sách này, liệt kê số ví dụ để cung cấp cho người đọc chức đa dạng việc sử dụng plasmid Tách dòng - hầu hết thao tác thực DNA phòng thí nghiệm lựa chọn có mang plasmid Dễ dàng thao tác sử dụng lưu trữ plasmid nên thường sử dụng thí nghiệm DNA tái tổ hợp Vector thoi - plasmid không chứa tồn thơng tin gốc nhân lựa chọn đánh dấu cho E coli, trình tự có chức tương tự để trì truyền lại tế bào vật chủ khác Ví dụ, plasmid cho nhân biểu gen nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa tồn thơng tin nhân đánh dấu lựa chọn cho E coli nấm men Hầu hết các thao tác DNA thực cách sử dụng E coli tế bào chủ trước chuyển thành DNA cuối tạo vào nấm men Tạo RNA - nhiều plasmid thiết kế để nhân đoạn DNA ngoại phiên mã thành RNA Như plasmid bao gồm vùng khởi động (promoter ) cho RNA polymerase, ví dụ: Ở bacteriophages có T3, T7 SP6, Giả sử RNA thực ống nghiệm cách sử dụng RNA polymerase tinh khiết DNA plasmid Các RNA thực phương pháp thường sử dụng thăm dò lai Northern blotting Sản xuất Protein - nhiều plasmid chứa trình tự khởi đầu (promoter) để biểu gen ngoại mà chúng có Biểu thường thực E coli, cách sử dụng đoạn khởi động (promoter) phù hợp, protein biểu định hướng thể Sản xuất protein mức độ cao điều khiển từ promoter mạnh, sản xuất mức thấp từ promoter yếu Mức độ sản xuất protein điều khiển cách thay đổi số lượng plasmid Trong kỹ thuật di truyền, plasmid gặp tự nhiên thường sửa đổi nhiều để tạo vector có đặc điểm mong muốn Ví dụ, bạn nhân vơ tính gen, bạn muốn biểu sản phẩm gene mức cao E coli, thể biểu protein môi trường nuôi cấy tế bào động vật có vú sản xuất protein dựa protein biểu mà kháng thể đơn dòng có sẵn để dùng Các hệ thống nên thiết kể để vận chuyển vào đoạn 91 Sản xuất protein y học ADN vector mà không cần phải sử dụng enzyme giới hạn Một hệ thống phác thảo (hình 3.7) Hình 3.7 Gene xáo trộn plasmid cách tái tổ hợp Các gen chuyển giao từ plasmid plasmid nhận địa điểm LoxP sử dụng enzyme Cre recombinase Ở đây, đoạn DNA mã hóa gene mục tiêu chuyển từ plasmid khác tác động enzyme Cre recombinase Cre nặng 38 kDa protein recombinase từ vi khuẩn P1 (Sternberg cộng sự, 1981) Nó làm trung gian để điều chỉnh tái tổ hợp trình tự DNA điểm cụ thể gọi điểm loxP ( Abremski Hoess, 1984 ) Các điểm bao gồm cặp 13 bp ngược lặp lặp lại cách vùng đệm bp Vùng đệm bp điểm loxP định hướng tái tổ hợp xảy theo chiều hướng xác định hướng trước Plasmid cho chứa hai điểm loxP hai điểm kẹp hai đầu gene mục tiêu Plasmid nhận chứa điểm loxP yếu tố mà gen mục tiêu trở thành hợp Các gen mục tiêu chuyển liên kết với yếu tố biểu cụ 92 Sản xuất protein y học Chương 10 Kỹ thuật tế bào động vật Những khái niệm Các tế bào nhân chuẩn cao việc ni cấy tương đối khó khăn - hầu hết tế bào chia vài lần trước chết Dòng tế bào sản xuất sau chuyển đổi virus DNA ngoại lai đưa vào (transfected) tế bào ni cấy cách sử dụng nhiều loại hóa chất, phương pháp vật lý virus Không giống tế bào thực vật, hầu hết tế bào động vật hoàn toàn khác biệt xác định qua đường biệt hóa cụ thể Do đó, tế bào động vật mà chuyển vào DNA ngoại lai khơng thể dễ dàng sử dụng để tái tạo toàn động vật Một ngoại lệ rõ ràng cho điều việc tạo động vật nhân từ tế bào trưởng thành cách sử dụng chuyển giao công nghệ hạt nhân Chúng ta thảo luận chuyển giao hạt nhân độ sâu Chương 10, tập trung vào phương pháp để giới thiệu DNA vào tế bào soma đặc biệt vào dòng tế bào động vật ni cấy 10.1 Nuôi cấy tế bào Để thiết lập tế bào động vật nuôi cấy, lượng nhỏ mô (thường mẫu nhỏ khoảng 2mm3) lấy từ quan cụ thể (da, gan, v.v…) đặt đĩa vô trùng Mô điều trị protease để phá vỡ số protein mà giữ tế bào với sau tháo rời để phân tách tế bào riêng lẻ Sau đó, tế bào đặt đĩa có chứa mơi trường ni cấy với huyết phân chia Các tế bào sư cấp sản xuất theo cách không dễ dàng chia bên thể động vật, thường trải qua vài phân đoạn trước trải qua q trình lão hóa Nếu tế bào tạo để tái sản xuất cho vài hệ, dòng tế bào thứ cấp sản xuất Dòng tế bào chứa nhiều tế bào giống Hầu hết dòng tế bào phân chia lượng thời gian tương đối nhỏ (10-20) trước vào lão hóa Bởi tế bào chết, gọi tế bào chết Tuy nhiên số dòng tế bào khơng tiến tới lão hóa mơ tả Những tế bào cho "chuyển đổi" trải qua thay đổi để làm cho ác tính Ví dụ dòng tế bào bao gồm: Các tế bào HeLa (bắt nguồn từ người phụ nữ da đen 31 tuổi tên Henrietta Lacks, người chết ung thư cổ tử cung vào năm 1951) Tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc (CHO) Những thay đổi xảy tế bào làm cho nhiễm virus thay đổi khác tế bào dẫn đến phân chia khơng kiểm sốt tăng trưởng tế bào Ở đây, việc chuyển đổi hạn dùng để trình hấp thu DNA ngọai lai chúng tơi sử dụng trước Ở sinh vật nhân chuẩn cao trình chèn DNA ngoại lai vào tế bào gọi transfection 236 Sản xuất protein y học 10.2 Transfection tế bào động vật Việc chèn DNA ngoại lai vào tế bào động vật trình gồm hai giai đoạn, đó, trước hết DNA đưa vào tế bào (transfection), sau tích hợp vào gen Nó tạo dòng tế bào động vật ổn định Ví dụ, plasmid mang kháng nguyên virus hạt nhân Epstein-Barr (EBNA-1) trì số dòng tế bào động vật linh trưởng chó khơng có dòng tế bào động vật gặm nhấm (Yates cộng sự, 1985.) Tuy nhiên, dòng tế bào ổn định vĩnh viễn Việc transfection tế bào hiệu so với chèn DNA ngoại lai vào gen Do đó, số lượng lớn tế bào transfected với DNA ngoại lai, nơi trì nhân, khơng tích hợp vào hệ gen họ Q trình hấp thu DNA vào tế bào động vật mô tả tạm thời ổn định, phụ thuộc vào thời gian DNA trì bên tế bào • Transient transfection Nếu DNA ngoại lai transfect vào tế bào khơng tích hợp vào gen, tế bào trì thời gian ngắn trước bị suy thối pha lỗng từ tế bào trình phân chia Trong khoảng thời gian mà DNA ngoại lai vào bên tế bào, xử lý trình tự DNA khác - gen chứa bên biểu hiện, miễn chúng kiểm soát promoter thích hợp, thời gian DNA trì bên tế bào, protein mã hóa Transient transfection đại diện cho phân tích gen cách nhanh chóng gen ngoại lai tế bào Nhìn chung, hình thức Transient transfection cần phải tối ưu hóa cho loại tế bào phân tích khác biệt vốn có hiệu việc hấp thu DNA • Ổn định transfection Thay trì ngồi nhiễm sắc thể hạt nhân tế bào chủ, DNA ngoại lai trở nên tích hợp vào vị trí dường ngẫu nhiên gen Sau tích hợp, DNA ngoại lai nhân rộng với nhiễm sắc thể chủ, nơi mà cư trú biểu gen xảy ra, cung cấp cho ghen ngoại lai điều khiển yếu tố kiểm sốt phù hợp cho việc phiên mã Dòng tế bào ổn định cần thiết cho việc sản xuất số lượng lớn protein tái tổ hợp thời gian dài Khó khăn gặp phải kỹ thuật sản xuất dòng tế bào ổn định, phát sinh chủ yếu từ việc hiệu trình chèn, thâm nhập vào tế bào, có nghĩa vài tháng để tạo dòng tế bào vơ tính Các transfection tế bào động vật với gen sinh vật khác có từ 40 năm (Szybalska Szybalski, 1962) Trong thí nghiệm này, hấp thu DNA thường thành tế bào động vật kiện vô Tế bào động vật bao bọc màng đơn, gọi hai màng tế bào màng huyết tương Nó bao gồm lớp kép lipid có chứa nhiều protein màng tương đối không thấm nước và, trường hợp bình thường, cho phép vật liệu định để vượt qua vào khỏi tế bào 237 Sản xuất protein y học Trong mô, tế bào bao quanh ma trận ngoại bào (ECM) - hỗn hợp protein proteoglycans - tham gia vào tế bào tín hiệu tế bào, vết thương, sửa chữa, độ bám dính tế bào chức mô Hầu hết tế bào động vật ni khơng có ECM tương đối dễ dàng chèn vào DNA so với đối tác địa họ Như thấy với hình thức chuyển đổi, hiệu trình tăng lên nhiều phương pháp điều trị khác nhau, thảo luận 10.2.1 Hóa chất Transfection Hiệu DNA Transfection cải thiện đáng kể việc làm kết tủa với có mặt tế bào Điều thực cách đơn giản việc rửa tế bào nuôi cấy đệm phosphat, cho vào DNA, sau cho thêm calci clorua vào hỗn hợp trường hợp người ta cho kết tủa bám vào bề mặt tế bào tế bào sau hấp thụ dần qua endocytosis (orantia chang, 1990) Một vài DNA sẻ phóng thích vào hạt nhân, nơi mà chúng sẻ biểu hiện, biến đổi thành thể thống vào gen Hiệu transfection sử dụng chất calci đánh giá tỷ lệ phần trăm (%) tế bào chứa DNA, tỷ lệ thấp, nằm khoảng 1% - 2% (Graham van der Eb, 1973), cải thiện sủ dụng DNA có độ tinh khiết cao trình kết tủa diển từ từ (Chen Okayama, 1988) 10.2.2 Điện di Chúng tơi thảo luận trước việc thay đổi hiệu điện tế bào vi khuẩn sở điện di Phương pháp kỷ thuật hoạt động tốt tế bào động vật ( Wong Niumann, 1982) Bằng việc thay đổi cường độ điện trường tăng thời gian đặt điện trường tế bào, thực hiên cách đơn giản việc điện di cho tất loại tế bào 238 Sản xuất protein y học 10.2.3 Liposome-mediated Transfection Liposome dạng lipid, có hình cầu, sử dụng để vận chuyển phân tử vào tế bào Classical liposome cấu thành bilayer lipid hình cầu, bao quanh phân tử vận chuyển, chúng vận chuyển vào tế bào sau Classical liposome hòav sử dụng cho việc vận chuyển acid nucleic(do acid nucleic mang điện tích âm) Cationic lipid tự nhiên dẫn đến hình thành túi unilamellar liposome, thay đóng gói DNA liposome, cách để gắn túi lên bề mặt DNA tích điện âm để tạo thành cụm túi tổng hợp (hình 10.2) Hình 10.2 giới thiệu cách DNA vào tế bào cách sử dụng liposome cation (A)cấu trúc hóa học DOTMA (N-[1 - (2,3-dioleyloxy) propyl]-N, N, N-trimethylammonium), cationic lipid cấu trúc nên liposome (B) cấu trúc cationic liposome Thể mang có đầu mang lõi kỵ nước hướng ngồi hình thành lipid ‘tails’, lipid cation sử dụng việc hình thành liposome (Felgner cộng sự, 1987) (C) Xung quanh đoạn DNA liposome cation trước đưa vào tế bào, sau dung hợp với màng tế bào Cationic liposomes cấu thành từ cationic lipids khác nhau, ví dụ DOTAP (N-1(-(2,3-dioleoyloxy) propyl)-N,N,N-trimethylammoniumethyl sulphate) DOTMA (N-(1-(2,3-dioleoyloxy) propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride) 239 Sản xuất protein y học Liposome thường bao gồm chất béo trung tính Dope (dioleoylphosphatidyl ethanolamine) để tạo điều kiện hình thành liposome tính hòa tan màng tế bào Cationic liposome tương tác với màng tế bào tích điện âm dễ dàng so với liposome không mang điện, với hợp cationic liposome bề mặt tế bào dẫn đến việc phân phối DNA xuyên qua màng plasma Ngoài ra, vật liệu đưa vào tế bào xuyên qua liposome cation xuất để giải phóng endosome khơng có rào cản lớn việc vận chuyển nhờ endocytosis Liposome qua bước trung gian kỹ thuật DNA, nhằm khuếch đại lên nhiều lần hiệu Do đó, phương pháp thường lựa chọn cho tế bào DNA transferase 10.2.3 Peptides Một số chuỗi peptide xuất để bám vào, ngưng tụ, DNA làm cho bám vào tế bào chặt chẽ hơn, ví dụ promotor DNA transfection serine tetrapeptide-proline-lysine-lysine.Liên kết phía chuỗi acid amin lysine mang điện tích dương (xem phụ lục A) giúp ngăn ảnh hưởng đến khung phosphate cho phép phân tử DNA để đóng gói chặt chẽ với nhau.Thiết kế hợp lý chuỗi peptide được sử dụng để phát triển liên kết peptide DNA tổng hợp Ví dụ, peptide-sin-lysine-alanine-(lysine) 8-tryptophan lysine-đã chứng minh hiệu chỗ hình thành phức hợp với DNA Liên kết peptide DNA đơi với cấu tử tế bào cụ thể, cách cho phép trung tâm receptor gắn với phức hợp DNA Một cách tiếp cận để tổng hợp nên peptide cation dựa 16 lysine acid chuỗi peptide gồm arginine-glycineaspartic (rgd) Trình tự rgd tạo điều kiện ràng buộc peptide/phức hợp DNA với thụ thể integrin CaCO2 ống nghiệm (Harbottle cộng sự, 1998) Peptide tổng hợp phát triển để tăng cường việc phóng thích peptide/phức hợp DNA từ endosome tiếp sau endocytosis 10.2.4 Chuyển DNA trực tiếp (Direct DNA Transfer) DNA tiêm trực tiếp vào nhân tế bào ni cấy (Capecchi, 1980) Cách tiếp cận khó khăn đòi hỏi lao động kỹ thuật chuyên sâu nhân tế bào phải tiêm với DNA ngoại thể đơn bào, đặc biệt hữu ích cho tế bào lớn Ví dụ, tế bào trứng lồi ếch Xenopus laevis châu Phi, thu hoạch với số lượng lớn từ buồng trứng lồi ếch nữ trưởng thành, có đường kính khoảng mm có hạt nhân tương đối lớn DNA, hay RNA, tiêm vào nhân thường diễn tả mơ hình khảm phát triển ếch (Melton, 1987) Sự hòa nhâp DNA ngoại xảy tần số thấp, biểu gen ngoại Hiệu q trình hòa nhập thay đổi đáng kể sinh vật khác Việc tiêm trực tiếp DNA vào mô động vật định, đặc biệt vào da, cho hiệu cao việc biểu gen chuyển (Wolff cộng sự, 1990) Ví dụ, bệnh nhân bị điều kiện di truyền ichthyosis da phiến mỏng (trong da quy mơ ửng đỏ), gây thiếu hụt transglutaminase (TGase1), cho 240 Sản xuất protein y học thấy số tái tạo da lại sau tiêm DNA plasmid mã hóa gen TGase1 (Choate Khavari, 1997) Sự phục hồi biểu thức TGase1 xảy vị trí xác da Tuy nhiên,q trình phân tích thêm tiết lộ mẫu biểu không đồng không mô chức bất thường tiềm ẩn bệnh Phun trực tiếp DNA áp dụng cho liệu pháp gen (xem bên dưới) bệnh ung thư, nơi mà DNA tiêm trực tiếp vào khối u tiêm vào tế bào để thể kháng nguyên khối u có chức thuốc chủng ngừa ung thư Mặc dù trực tiếp tiêm DNA plasmid hiển thị để dẫn đến biểu gen, mức độ biểu tổng thể nói chung thấp so với thu với liposome Chúng trở lại để tiêm trực tiếp DNA sau nhìn vào việc sản xuất động vật biến đổi gen 10.3 Virus Vectors Việc chuyển DNA ngoại vào tế bào động vật có tương đối thấp, dẫn đến thao tác virus vectơ khả chuyển đổi gien 10.3.1 SV40 Vector virus chuyền vào tế bào động vật phát triển dựa virus khỉ 40 (SV40) (Hamer Leder, 1979) SV40 sợi đôi DNA virus tạo khối u linh trưởng có gen 5243 bp kích thước (Hình 10.3) Hình 10.3 Các gen SV40 SV40 có hai đơn vị phiên mã, mà biểu vùng hoạt động (promoter) Cả hai tạo protein qua nối thay T lớn kháng nguyên t nhỏ cho nhân lên trình nhân lên protein capsid VP mẫu virus Các trình tự intron loại bỏ trình cắt nối thể màu đỏ Gen mã hóa hai sợi gen mà chúng chồng lên Viral nhiễm chủ yếu xảy tế bào thận khỉ, virus có khả lây nhiễm nhiều loại tế bào động vật có vú và, tùy thuộc vào loại tế bào bị nhiễm bệnh SV40 có hai gen biểu 241 Sản xuất protein y học Gen sớm thể sau nhiễm virus yêu cầu cho nhân lên Các gen đầu bao gồm kháng nguyên T lớn nhỏ T kháng nguyên Gen muộn thể thời gian sau chu kỳ nhiễm khuẩn mã hóa protein capsid virus cần thiết cho hình thành virus Những gen kiểm soát promoter SV40 lớn (MLP) Gen ngoại đưa vào hệ gen SV40 để thay cho đầu sớm gen muộn Nếu gen ngoại thay thế, ví dụ, gen muộn, sau virus khơng tái tạo cách nhiên, tiến hành cách sử dụng helper SV40 virus có khiếm khuyết gen sớm để cung cấp 'muộn' chức chuyển hóa.tương tư thực khuẩn (chương 3), SV40 có công suất hạn chế cho việc bổ sung DNA ngoại Ngay với việc thay đổi gen có, kích thước tối đa đoạn DNA giới hạn bp 2300 ~ (Naim Roth, 1994) 10.3.2 Adenoviruses Adenoviruses chịu trách nhiệm cho khoảng 25% gây chứng cảm lạnh thơng thường Có nhiều loại khác gây nhiễm trùng người, tất họ virus khơng có màng bao icosohedral (khoảng 60-90 nm dài) có chứa gen DNA sợi đơi tuyến tính kích thước ~ 36 kbp (Hình 10.4) Hình 10.4 Adenovirus (a) Electron micrograph of a human faecal adenovirus Image courtesy of Tony Oliver (IBMS London Region Virology Discussion Group) (b) The adenoviral genome The approximate location of some of the early (E) and late (L) genes are shown, along with the site of the major late promoter (MLP), and an approximately 300 bp packaging site (), which is essential for the packaging of 242 Sản xuất protein y học viral genome into the assembled capsid Both ends of the genome are composed of 100 bp inverted terminal repeats (ITRs) ITRs serve as origins of DNA replication by priming the replication process and acting as assembly points for the proteins of the replication complex The adenovirus genome also encodes several viral associated RNAs (VA RNAs) that are transcribed constitutively at a high level using RNA polymerase III VA RNAs are ~160 nucleotides in length and have a high GC content and a high degree of secondary structure They may serve to regulate mRNA splicing or to control of the rate of translation of late genes (Mathews, 1995) Các phiên mã gen adenovirus xảy hai giai đoạn - đầu cuối diễn trước sau chép DNA virus, tương ứng Phiên mã kèm với loạt kiện nối phức tạp, với bốn khu vực phiên mã gen (E1-E4, cần thiết để nhân lên virus), MLP sản xuất gen cuối (L1-L5, sản xuất lớp vỏ virus) ( Logan Shenk, 1984) Các virus tái tạo dòng tế bào động vật có vú khác di truyền DNA thường transfected vào chúng Ngoài ra, virus tạo số lượng lớn cháu (lên đến 105 virion tế bào bị nhiễm), có nghĩa hạt siêu vi, tái tổ hợp cách khác, tinh chế với số lượng lớn cách dễ dàng Hầu hết vector có nguồn gốc từ hệ gen chép thiếu adenoviral Họ thiếu E1 gen thiết yếu thường có gen không cần thiết E3 Kể từ chúng chép lỗi, chúng phải tuyên truyền dòng tế bào có transfected với DNA chứa gene E1 - ví dụ: người dòng tế bào thận phơi 293 - E1 cung cấp chức trans (Graham cộng sự, 1977) Đây loại vector có cơng suất tối đa cho DNA ngoại khoảng kbp vectơ khác adenoviral thiếu gen E2 E4 Ngoài E1 E3 để tăng khả mang DNA ngoại, chức lần nữa, cung cấp dòng tế bào (Gorziglia cộng sự, 1996) Adenoviruses mang DNA ngoại sử dụng để sản xuất protein ngoại loại tế bào khác nhau, biểu gen thường thống qua DNA virus khơng tích hợp vào hệ gen vật chủ Việc thiếu tích hợp có thể, nhiên, có lợi vectơ adenoviral sử dụng liệu pháp gen (xem bên dưới) Ngoài ra, mơ biểu gen cụ thể với vectơ adenoviral gene ngoại đặt kiểm soát promoter di động cụ thể yếu tố enhancer, ví dụ: myosin chuỗi ánh sáng 1promoter (Shi, Wang Worton, 1997) promoter mịn tế bào SM22a (Kim cộng sự, 1997), cách phân phối trực tiếp tới khu vực thể (Rome cộng sự, 1994) Adenoviral vector hữu ích đánh giá cao hiệu đưa DNA vào tế bào Họ có khả chứa DNA chèn lên đến kích thước khoảng kbp họ lây nhiễm sang chép tế bào khác biệt Ngoài ra, kể từ họ khơng tích hợp vào hệ gen chủ, họ mang lại hiệu ứng gây đột biến gây kiện hòa nhập ngẫu nhiên Những khó khăn adenoviral vectơ bao gồm Biểu thống qua, DNA virus khơng tích hợp vào máy chủ 243 Sản xuất protein y học Vectơ Adenoviral dựa tác nhân gây bệnh phổ biến người thể có bị cản trở phản ứng miễn dịch tế bào chủ với loại virus 10.3.3 Liên quan đến Adeno-Virus (AAV) Adeno virus-liên lần phát chất gây ô nhiễm chế phẩm adenovirus (Atchison cộng sự, 1965) Mặc dù tên nó, AAV khơng cho biết liên quan đến adenovirus virus thuộc họ parvovirus, có sợi đơn DNA gen có kích thước khoảng 5000 nucleotide Các virus thường tìm thấy mơ amidan người, khơng có bệnh người có liên hệ với Các AAV khơng thể tồn cách độc lập, mà đòi hỏi diện virus khác, ví dụ adenovirus, để hồn thành replicative chu kỳ Một số gen adenovirus đầu cần thiết cho việc thúc đẩy nhân rộng AAV Tuy nhiên, việc điều trị tế bào nhiễm AAV với ánh sáng cực tím, số chất gây ung thư cycloheximide dùng để thay virus helper (Bantel-Schaal, 1991) Vì cần phải có loại virus trợ giúp cho thay đổi môi trường cellulase tốt protein virus Trong trường hợp khơng có virus helper, gen AAV tích hợp vào tế bào chủ, nơi mà provirus tiềm ẩn Khơng có tích hợp DNA virus vào gen tế bào vật chủ, nhiên, q trình ngẫu nhiên, tích hợp vào vị trí di truyền nhiễm sắc thể 19 (Kotin cộng sự, 1990.) AAV dựa vào vectơ khai thác hai chuỗi ITR 145 tìm thấy gen virus, yếu tố DNA cần thiết cho chép, vận chuyển, hội nhập provirus cứu hộ Các cấu trúc lặp lặp lại vòng lặp formhairpin cần thiết cho nhân virus Việc nhân vơ tính vào hệ gen AAV hỗ trợ việc lắp lặp lặp lại đầu cuối, đảo ngược thành vector plasmid sau nhân foreign DNA chúng Đoạn linear DNA chứa foreign gene hai bên ITRs chuẩn bị từ plasmid trình cắt enzyme giới hạn Sau DNA vận chuyển vào tế bào, với helper plasmid để cung cấp gen cần thiết cho hội nhập AAV virus Viral dư sau chuẩn bị cách tiêm nhiễm tế bào với adenovirus để kích thích AAV lytic nhân đóng gói Cuối cùng, phần virus AAV tinh chế từ adenovirus gây ô nhiễm cách sử dụng phương pháp hóa sinh (Gao cộng sự, 2000) Đây loại phương pháp tiếp cận làm chất lượng sử dụng adenovirus để phục hồi AAV hạt Khả nhiễm cao tái tổ hợp sản xuất AAV sử dụng để thử nghiệm liệu pháp gen người An cách tiếp cận khác để sản xuất tái tổ hợp hạt AAV hiển thị Hình 12.5 Ở đây, gene ngoại hai bên ITRs đồng transfected vào người 293 tế bào thận với hai mảnh DNA khác - có chứa gen cần thiết cho việc sản xuất sợi đơn AAV di truyền DNA, mang gen adenoviral khác cần thiết cho lytic nhân rộng bao bì (Matsushita cộng sự, 1998) 244 Sản xuất protein y học Hình 10.5 Việc sản xuất tái tổ hợp hạt AAV mà không nhiễm adenoviral Một đoạn DNA tuyến tính có chứa gen nước ngồi, kiểm sốt promoter thích hợp để thể hiện, transfected vào dòng tế bào thận 293ở người (trong thể gen E1 adenoviral) với DNA có chứa Rep AAV Cap gen, đoạn DNA mang E2A adenoviral, E4 RNA gen VA Các Rep Cap protein yêu cầu để sản xuất sợi đơn AAV để đóng gói chúng protein Các helper protein từ adenovirus cần thiết để nhân rộng lytic AAV (E1, E2A, E4 VA RNA) sản xuất tế bào để thúc đẩy hình thành hạt virus có chứa gen ngoại Những sau sử dụng để lây nhiễm tế bào mục tiêu Các hạt AAV tái tổ hợp đượcthu từ thủ thuật sau sử dụng để lây nhiễm tế bào mục tiêu, gen ngoại thể vector AAV sử dụng để chuyển DNA ngoại vào nhiều loại tế bào, bao gồm tế bào thần kinh (Davidson cộng sự, 2000), (Pruchnic cộng sự, 2000) tế bào biểu mô (Pajusola cộng sự, 2002) Các vị trí dự đốn hội nhập DNA vào tế bào chủ, khả biến đổi hai phân chia, phân chia tế bào, tiến khả lây nhiễm nhiều loại tế bào thể thực vector AAV hứa hẹn cho liệu pháp gen (Sanlioglu cộng , 2001) 10.3.4 Retrovirus Retroviruses virus động vật hoà nhập vào gen tế bào chủ chu kỳ sinh trưởng bình thường Có hai nhóm retrovirus gây bệnh người retroviruses HTLV (ví dụ virus bệnh bạch cầu tế bào T người, HTLV- 1) (yoshida seiki, 1987) lentiviruses (ví dụ virus gây bệnh xi - đa người, HIV - 1) (Luciw cộng sự, 1984) - retroviruses tìm thấy nhiều sinh vật, bao gồm động vật có xương sống động vật khơng xương sống Chúng bao bọc lớp vỏ (đường kính khoảng 100 nm), lớp vỏ bọc dạng màng kép lipid chiết xuất từ tế bào Lớp vỏ bao bọc chứa số protein mã hoá cho virus.Sự 245 Sản xuất protein y học gen tổng hợp vào vật chủ Tất retroviruses chứa ba cấu trúc gen chính, mã hoá số protein hoạt tính (Katz skalka, 1994): Mã hố dạng capsid protein Mã hoá transcriptase đảo ngược biến RNA gen thành DNA, integrase cần cho đầu bám DNA vào vật chủ gen protease cần cho phân cắt gen chín Mã hố bề mặt xun màng protein thấy bao bọc Một số retroviruses chứa gen khác; ví dụ protease mã hoá gen riêng biệt Mọi protein mã hoá bịt miệng, pol protease thể từ axit ribonucleic hệ gen hoàn chỉnh Để nén số gen vào gen nhỏ, virus sử dụng số chiến lược nối ribosomal frameshifting (Farabaugh, 1996) Ví dụ như, gen protease thường nằm gối lên bịt miệng pol tạo từ phân tử mRNA Gen cấu trúc retroviral cạnh sườn gien ltrs, trở thành lặp lại phần quy trình nhân trước tích hợp vào gen vật chủ Tổng hợp ARN virus người tổ chức đơn lefthand LTR kết thúc tín hiệu polyadenylat LTR bên phải Gói hàng ràng buộc vào lượng thêm acid nucleic trì gen virus nghĩa vật chủ trung gian dựa retroviruses thường nhân khơng hồn chỉnh Do đó, chúng tơi thảo luận cho vật chủ trung gian adenoviral trên, hạt virus nhiễm khuẩn phải tạo dòng tế bào xây dựng đặc biệt để cung cấp protein virus cần thiết Chẳng hạn như, gen ngoại dòng vơ tính vào plasmit chứa DNA phiên thành phần mô tả cho nằm bên phải-trái ltrs, Virus tạo từ dòng tế bào sau dùng để gây bệnh tế bào đích, nơi vật chủ trung gian tích hợp vào gen gen ngoại thể Ngoài gen ngoại, gen khác dùng để đánh giá tế bào riêng lấy DNA tái kết hợp Ưu chủ yếu để sử dụng vật chủ trung gian bazơ retroviral phát sinh từ ổn định tích hợp gen virus vào vật chủ Tích hợp DNA virus địa điểm ngẫu nhiên gen vật chủ cho phép cách diễn đạt lâu dài gen ngoại tích hợp Ngồi ra, retroviruses đại diện cho chế truyền ADN vào tế bào hiệu Sự bất lợi vật chủ trung gian chất ngẫu nhiên quy trình tích hợp, có ảnh hưởng độc tế bào chủ, yêu cầu tổng quát retroviruses phải gây bệnh phân chia tế bào Chỉ lentiviruses, ví dụ HIV1, gây bệnh chép tế bào khơng phân chia Do đó, nhiều nỗ lực hướng dẫn vào làm vật chủ trung gian lentivirus an toàn cách phù hợp (zufferey cộng sự, 1998) 10.4 Bút đánh dấu chọn Gene Amplification tế bào động vật Như DNA khác quy trình chúng tơi thảo luận, sát nhập ADN ngoại lai vào tế bào động vật cần theo kiểu hình biến thành phân biệt tế bào transfected với tế bào không lấy ADN ngoại lai (Hình 10.7) 247 Sản xuất protein y học Hình 10.7 Cấu trúc bleomycin-bleomycin ràng buộc prôtêin phức hợp (almaruyama sâu bên prôtêin nhị trùng (xanh xanh dương) Một vài thí nghiệm để nhận biết tế bào động vật transfected liên quan bổ sung dinh dưỡng khuyết điểm dòng tế bào Chẳng hạn như, tế bào người có khuyết điểm gen mã hố phosphoribosyltransferase guanine hypoxanthine (HPRT ; phận chu kỳ inosinate cho giá trị thu hồi vòng purin bazơ sản xuất inosine monophosphate) khơng thể tăng trưởng hypoxanthine, aminopterin thymidine hợp chất có chứa thymin đường ribose Rất khi, tế bào lập tăng trưởng, biểu lộ chúng có phải khả để làm HPRT từ tế bào dạng tự nhiên (szybalska szybalski, 1962) Tương tự, chuột nhắt tế bào thiếu hụt enzyme kinase thymidine hợp chất có chứa thymin đường ribose( TK, phần chuỗi phản ứng hóa sinh có giá trị thu hồi sinh tổng hợp nucleotide) phát triển HAT trung bình, transfected với virus bệnh mụn rộp (HSV) Tk gen phép sinh trưởng trung bình (wigler cộng sự, 1977) Một số bút đánh dấu chuyển hóa khác chẳng hạn kiểm sốt quy trình transfection, tất bị yêu cầu dòng tế bào đột biến để phát biến đổi tế bào Điều khắc phục cách sử dụng bút đánh dấu chọn kiểu hình trội kháng thuốc đến tế bào transfected (bảng 10.1) Kháng sinh ampicillin khơng có ảnh hưởng tế bào có nhân điển hình thiếu thành tế bào động vật Vài kháng sinh khác, đặc biệt tổng hợp protein chất ức chế, tích cực chống lại hai sinh vật có nhân điển hình sinh vật chưa có nhân điển hình Chẳng hạn như, trực khuẩn E.coli chuyển gen vị trí tn5 mã hố thuốc kháng sinh - gen kháng lại (yamamoto yokota, 1980) Thuốc kháng sinh kháng sinh aminoglycoside cản trở dịch mã gây chết tế bào vi khuẩn, cụ thể việc nhắm vào mục tiêu ribosomal 16S axit ribonuclenic Ở nồng độ cao, aminoglycosides ức chế tổng hợp protein tế bào động vật có vú có lẽ qua ràng buộc khơng rõ ràng để ribơxơm có nhân điển hình / acid nucleic (mingeot - leclercq, tulkens glupczynski, 1999) Để đạt sức đề kháng phương pháp chọn lọc, gen khác mã hoá Tn5 gen chuyển vị (tạo kháng sinh phosphotransferase) đặt vào kiểm sốt người tổ chức động vật có vú, ví dụ HSV Tk người tổ chức người tổ chức sớm SV40 Chúng ta 248 Sản xuất protein y học thảo luận người tổ chức thường điều khiển cách diễn đạt gen tế bào động vật chi tiết bên Bảng 10.1 Bút đánh dấu cho chọn lọc đoạn ADN bổ sung lên tế bào có nhân điển hình cao Phơi tế bào động vật mức độ cao thuốc độc lâu nhằm mục đích chọn lọc tái kết hợp cho tăng giá, tần số thấp rất, đến hình thành tế bào trở thành cách tự phát Chẳng hạn như, chuột nhắt tế bào tiếp xúc đến methotrexate (mô loại vitamin B quan trọng tổng hợp acid nucleic chất ức chế enzyme dihydrofolate reductase, DHFR) cho thấy để trải qua ba kiểu đột biến để tạo sức đề kháng (Schimke cộng sự, 1978) : Đột biến DHFR enzyme để tạo chất ức chế sức đề kháng, Đột biến ngăn ngừa sức hấp dẫn tế bào thuốc Sự khuếch đại dhfr vị trí để tăng số dhfr gen để tạo số lượng đủ enzyme để vượt qua ảnh hưởng thuốc Quy trình khuếch đại ngẫu nhiên, với vùng lớn cạnh sườn DNA xung quanh dhfr vị trí trở thành thổi phồng Đột biến lớp cuối đặc biệt quan trọng cách diễn đạt cao cấp gen dị vật ADN ngoại lai dòng vơ tính vào vật chủ trung gian plasmit có Dhfr gen Sau transfected vào methotrexate - tế bào đề kháng tái kết hợp chọn cho với có mặt mức độ cao thuốc Tế bào thổi phồng dhfr chứa nhiều ADN ngoại lai (Wigler cộng sự, 1980) 10.5 Biểu gen tế bào động vật Chúng quan sát biểu bên gen tế bào bị nhiễm Baculovirus (Chương 8), protein tái tổ hợp sản 249 Sản xuất protein y học xuất tế bào động vật có vú Việc chèn gen ngoại lai vào tế bào động vật thường không đủ để biểu hiệu trực tiếp sản xuất protein mã hóa Các gene ngoại lai biểu phải kết hợp với yếu tố kiểm soát phiên mã dịch mã phù hợp cho loại tế bào, protein sản xuất Hầu hết promoter sử dụng để biểu gen ngoại lai tế bào động vật tha nh lập Chúng thảo luận hệ thống biểu Tet để sản xuất protein tế bào động vật có vú (Chương 8) Nhiều promoter tha nh lập sử dụng để biểu gen tế bào chuyển đổi hoạt động phiên mã loạt loại tế bào mô, hầu hết số mức độ đặc hiệu mơ Ví dụ, sử dụng rộng rãi cytomegalovirus (CMV), promoter biểu độ hoạt động thấp tế bào gan (Najjar Lewis, 1999) Một promoter mạnh tha nh lập nhằm biểu gen cho nhiều loại tế bào bao gồm adenovirus MLP… Ngồi promoter thích hợp, gen biểu tế bào động vật yêu cầu trang Polyadenylation, kết thúc phiên mã tín hiệu loạt yếu tố kiểm sốt tịnh tiến Nói chung, lưu ý gen có chứa intron thể mức cao so với cDNA tương đương gen (Buchman Berg, 1988) Điều khớp nối phiên mã, nối tạo mRNA tế bào nhân chuẩn cao (Maniatis Reed, 2002) 250 ... hợp, protein biểu định hướng thể Sản xuất protein mức độ cao điều khiển từ promoter mạnh, sản xuất mức thấp từ promoter y u Mức độ sản xuất protein điều khiển cách thay đổi số lượng plasmid Trong. .. vú sản xuất protein dựa protein biểu mà kháng thể đơn dòng có sẵn để dùng Các hệ thống nên thiết kể để vận chuyển vào đoạn 91 Sản xuất protein y học ADN vector mà không cần phải sử dụng enzyme... gene bên phía bên tay trái đồ gene quy ước mã hóa cho protein đầu cuối mảnh thể ăn khuẩn 95 Sản xuất protein y học Theo sau gene mà sản phẩm protein liên quan với tái tổ hợp q trình hoạt hóa thực