Đang tải... (xem toàn văn)
Nội dung bài viết trình bày về phương pháp phân tích định lượng kết hợp với phân tích tổng thể sắc đồ được phát triển nhằm đánh giá chất lượng Đại hoàng dựa trên sắc đồ đặc trưng. 5 hoạt chất gồm: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin và sennoside A được định lượng.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG VÀ PHÂN TÍCH TỔNG THỂ SẮC ĐỒ NHẰM ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG ĐẠI HOÀNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chử Văn Mến*; Nguyễn Văn Long*; Vũ Tuấn Anh* TĨM TẮT Phƣơng pháp phân tích định lƣợng kết hợp với phân tích tổng thể sắc đồ đƣợc phát triển nhằm đánh giá chất lƣợng Đại hoàng dựa sắc đồ đặc trƣng hoạt chất gồm: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin sennoside A đƣợc định lƣợng Thực phân tách cột pha đảo C18 với chƣơng trình gradient sử dụng dung mơi A (dung dịch 0,05 M axit phosphoric nƣớc) dung môi B (acetonitrile), bƣớc sóng 280 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút Chƣơng trình rửa giải gồm: - phút (20% B), 18 phút (28% B), 25 phút (42% B), 30 phút (100% B) cho kết tách tốt Phƣơng pháp đƣợc áp dụng cho 31 mẫu Đại hoàng gồm loài khác Kết quả: hàm lƣợng hoạt chất biến động nhiều mẫu Đại hoàng khơng khác biệt lồi Đại hồng Ở phân tích tổng thể sắc đồ, 17 pic đƣợc chọn Phân tích phân biệt tuyến tính LDA cho thấy mẫu đƣợc phân loại thành nhóm với độ xác 100% Nghiên cứu cho thấy: việc kết hợp định lƣợng hoạt chất với phân tích tổng thể sắc đồ giúp tiếp cận toàn diện đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu nói chung Đại hồng nói riêng * Từ khóa: Đại hồng; Sắc ký lỏng hiệu cao; Đánh giá chất lƣợng QUANTITATIVE AND PATTERN ANALYSIS FOR THE QUALITY EVALUATION OF RHEI RHIZOMA BY HPLC SUMMARY A quantitative and pattern analysis for the quality evaluation of Rhei rhizoma by HPLC based on chromatographic fingerprints in 40 minutes was developed Five marker compounds, namely, chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin and sennoside A were quantitated The chromatographic separation was performed on a C18 column by gradient elution with 0.05 M phosphoric acid in water and acetonitrile, the wavelength was set at 280 nm, the flow rate was set at ml/min, gradient condition as followed: - (20% B); * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 16/8/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 31/10/2013 Ngày báo đăng: 5/11/2013 31 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 18 (28% B); 25 (42% B); 30 (100% B) gave the satisfied separation The developed method was applied to the quantitation of 31 samples of different Rhei Rhizoma species The results showed that the contents of bioactive compounds were fluctuated among samples and there were no difference among Rhubarb species For pattern analysis, seventeen common peaks were selected LDA (Linear Discriminant Analysis) showed that the samples were clustered into different groups of species with the accuracy of 100% This study showed that quantitative determination of marker compounds combined with patternrecognition method can provide a comprehensive approach for the quality assessment of herbal medicines * Key words: Rhei Rhizoma; HPLC; Quality evaluation ĐẶT VẤN ĐỀ Đại hồng (Rhei Rhizoma) nhóm lồi chi Rheum thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) Có ba lồi chi Rheum có Dƣợc điển Việt Nam, Hàn Quốc Trung Quốc bao gồm: R tanguticum, R palmatum R officinale [1, 2, 3] Trong dƣợc điển Nhật Bản, ngồi ba lồi có thêm Rheum coreanum loài lai loài dƣợc liệu Đại hoàng [4] Ngoài ra, loài khơng thức nhƣ Rheum undulatum, Rheum rhaponticum, Rumex crispus, Rumex aquatica Reynoutria elliptica thƣờng bị nhầm Đại hoàng Trong số trƣờng hợp, việc xác định loài dựa phân tích mơ học lồi mẫu Đại hồng thị trƣờng khó khăn Nhiều nhà nghiên cứu thầy thuốc đông y thƣờng bị nhầm lẫn không rõ ràng nhiều loài việc sử dụng dƣợc liệu Đại hoàng Do vậy, đánh giá chất lƣợng Đại hoàng dựa thành phần hoạt chất đóng vai trò quan trọng kiểm sốt chất lƣợng Đại hồng Đại hồng đƣợc biết đến với nhiều hoạt tính sinh học nhƣ nhuận tràng , lợi mật, bảo vệ gan, kháng virut, kháng viêm [5, 6, 7] Các hoạt chất Đại hoàng gồm: anthraquinone nhƣ chrysophanol, emodin [8], dianthrone nhƣ sennoside A [9] hay stilbene nhƣ rhaponticin [10] Phân tích định lƣợng đơn số chất đánh dấu khơng thể phân biệt Đại hồng thật giả Trong nghiên cứu này, chúng tơi kết hợp phân tích định lƣợng phân tích tổng thể sắc đồ nhằm đánh giá toàn diện chất lƣợng Đại hoàng từ lồi khác Hình 1: Cấu trúc hóa học hoạt chất Đại hồng: Sennoside A, Rhaponticin, Emodin-glucoside, Emodin, Chrysophanol 32 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa chất thiết bị Hóa chất: chất chuẩn chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin sennoside A đƣợc chiết xuất, phân tách, tinh chế xác định cấu trúc, chuẩn nội (eugenol), acetonitrile, methanol, nƣớc cất, axit phosphoric đạt tiêu chuẩn cho sắc ký lỏng hiệu cao, hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích Mẫu Đại hồng đƣợc thu hái từ nhiều vùng khác Trung Quốc Hàn Quốc, đƣợc GS Jae Hyun Lee, Khoa Y học Cổ Truyền, Đại học Dong Guk thẩm định lƣu trữ Khoa Dƣợc, Đại học Quốc gia Chung Nam, Hàn Quốc Thiết bị: máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu gồm bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, phận ổn nhiệt CTO20A (Shimadzu, Japan) Thực phân tách cột C18 (4,6 x 250 mm, µm, Optimapak, RStech Corp, Hàn Quốc) Phƣơng pháp nghiên cứu * Điều kiện sắc ký: Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak C18 (250 x 4,6; 5μm) Cơng ty RS tech (Hàn Quốc); bƣớc sóng phát hiện: 280 nm; pha động: dung môi A (dung dịch axit phosphoric 0,05 M nƣớc); dung môi B (acetonitrile); tốc độ dòng: ml/phút; thể tích tiêm: 10 μl Chƣơng trình rửa giải nhƣ sau: THỜI GIAN (phút) %A %B 80 20 5 18 80 72 20 28 18 25 72 58 28 42 25 30 58 42 100 30 35 80 100 20 35 40 80 20 * Chuẩn bị dung dịch chuẩn thử: - Nội chuẩn (IS): dung dịch eugenol nồng độ 1.000 µg/ml methanol - Mẫu chuẩn: dãy dung dịch chuẩn có nồng độ xác chrysophanol (từ - 200 µg/ml), emodin (1 - 100 µg/ml), emodin-glucoside (0,5 - 50 µg/ml), rhaponticin (2 - 200 µg/ml) sennoside A (0,5 - 50 µg/ml) dung dịch chuẩn nội eugenol 200 (µg/ml) methanol - Mẫu thử: cân xác 100 mg bột dƣợc liệu Đại hồng, cho vào bình định mức 10 ml Thêm ml ethanol 70% 200μl dung dịch chuẩn nội, bổ sung ethanol 70% vừa đủ, cân, lắc siêu âm 60 phút, cân lại, bổ sung khối lƣợng ethanol 70% Ly tâm, gạn lấy lớp lọc qua màng lọc 0,45 μm 34 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Hình 2: Sắc ký đồ so sánh phổ mẫu chuẩn (a) mẫu thử (b, c); (1): sennoside A; (2): rhaponticin; (3): emodin-glucoside (4): emodin; (5): chrysophanol Với điều kiện sắc ký phƣơng pháp xử lý mẫu lựa chọn, sắc ký đồ thu đƣợc cho pic tách rõ ràng, nhiễu thấp, thể qua sắc ký đồ mẫu thử Đại hoàng hỗn hợp chuẩn Trên sắc ký đồ, mẫu thử có thời gian lƣu trùng với thời gian lƣu pic sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol mẫu chuẩn lần lƣợt 12,25; 13,35; 17,56; 34,42; 36,06 phút Tại thời gian lƣu sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol sắc đồ mẫu thử mẫu chuẩn, so sánh phổ hấp thụ UV thu đƣợc pic Kết cho thấy phổ mẫu thử mẫu chuẩn trùng khít lên với hệ số phù hợp lần lƣợt 0,9997; 0,9996; 0,9998; 0,9992 0,9994 Điều chứng tỏ: pic thu đƣợc sắc ký đồ mẫu thử tinh khiết thành phần khác có mẫu thử khơng ảnh hƣởng đến q trình phân tích năm chất đối chiếu sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol, qua cho phép tiến hành định tính định lƣợng Khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lƣợng Pha gồm dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ từ 0,5 - 200 μg/ml Tiến hành sắc ký nhƣ điều kiện mô tả 35 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Bảng 1: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng NỒNG ĐỘ (g/ml) PHƢƠNG TRÌNH HỒI QUY r LOD (g/ml) LOQ ((g/ml) Sennoside A 0,9 - 50 Y = 0,0023 X - 0,0066 1,0000 0,28 0,94 Rhaponticin 2,0 - 200 Y = 0,0066 X - 0,0039 0,9998 0,15 0,50 Emodin- glucoside 0,5 - 50 Y = 0,0211 X - 0,0045 0,9997 0,05 0,15 Emodin 1,0 - 100 Y = 0,0155 X - 0,0069 0,9997 0,06 0,20 Chrysophanol 2,0 - 200 Y = 0,0061 X - 0,0055 0,9996 0,16 0,50 CHẤT CHUẨN Kết khảo sát cho thấy: với khoảng nồng độ sennoside A từ 0,9 - 50 μg/ml, rhaponticin từ 2,0 - 200 μg/ml, emodinglucoside từ 0,5 - 50 μg/ml, emodin từ 1,0 - 100 μg/ml, chrysophanol từ 2,0 200 μg/ml, có tƣơng quan tuyến tính nồng độ tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội Phƣơng trình tuyến tính chất sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol cho phép xác định giới hạn phát lần lƣợt 0,28, 0,15, 0,05, 0,06 0,16 µg/ml giới hạn định lƣợng chất lần lƣợt 0,94, 0,50, 0,15, 0,20 0,50 µg/ml Độ đúng, độ lặp lại phƣơng pháp Độ độ lặp lại phƣơng pháp đƣợc xác định mẫu chuẩn biết trƣớc nồng độ Tính độ độ lặp lại ngày cách phân tích mẫu chuẩn lần/ngày; độ độ lặp lại ngày đƣợc tiến hành cách phân tích mẫu chuẩn ngày liên tiếp Bảng 2: Kết xác định độ độ lặp lại phƣơng pháp CHẤT CHUẨN NỒNG ĐỘ TRONG NG (n 5) Độ lặp lại (%) Độ (%) GI A C C NG (n 5) Độ lặp lại (%) Độ (%) Sennoside A 12,5 0,73 100,2 0,93 99,2 Rhaponticin 50,0 0,83 100,9 0,83 101,1 Emodin- glucoside 12,5 1,13 99,6 1,32 99,5 Emodin 25,0 0,39 100,9 0,62 102,0 Chrysophanol 50,0 0,90 101,4 1,29 101,6 37 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Độ khoảng từ 99,2 - 102,0 độ ngày ngày Độ lặp lại phƣơng pháp thể độ lệch tƣơng đối (RSD) Kết cho thấy: RSD phƣơng pháp thấp 1,32% độ lặp lại ngày ngày Chứng tỏ phƣơng pháp định lƣợng đồng thời hoạt chất sinh học có độ xác lặp lại cao Kết phân tích định lƣợng hoạt chất mẫu dƣợc liệu Đại hoàng Kết khảo sát hàm lƣợng hoạt chất sennoside A, rhaponticin, emodinglucoside, emodin, chrysophanol có 31 mẫu Đại hoàng cho thấy: hàm lƣợng cao sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol 16,31; 94,41; 1,81; 3,11 12,64 mg/g dƣợc liệu khô Hàm lƣợng hoạt chất mẫu Đại hồng biến động nhiều tất mẫu Không thấy khác biệt lồi Đại hồng Hình 3: Kết phân tích hàm lƣợng hoạt chất mẫu Đại hoàng (mg/g): (a) Sennoside A, (b) Rhaponticin, (c) Emodinglucoside, (d) Emodin, (e) Chrysophanol Kết phân tích tổng thể sắc đồ Tiến hành phân tích tổng thể sắc đồ dựa 17 pic chung LDA (phân tích phân biệt tuyến tính) cho thấy: mẫu Đại hồng từ nguồn gốc khác đƣợc phân biệt với độ xác 100% 38 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QN SỰ SỐ 9-2013 Hình 4: Kết phân tích LDA mẫu Đại hoàng: (1) Rheum officinale, (2) Rheum palmatum, (3) Rheum tanguticum, (4) Rheum undulatum KẾT LUẬN Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao đơn giản, hiệu Đã đƣợc phát triển thẩm định phƣơng pháp để định lƣợng đồng thời hoạt chất dƣợc liệu Đại hoàng Hàm lƣợng hoạt chất biến đổi nhiều mẫu, khơng có khác biêt loài Đại hoàng Đại hoàng đƣợc phân biệt thành nhóm khác tƣơng ứng với lồi với độ xác 100% Phân tích định lƣợng đồng thời hoạt chất kết hợp với phân tích tổng thể sắc đồ sở để đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu nói chung Đại hồng nói riêng TÀI LIỆU THAM KHẢO Dược điển Việt Nam, tập IV 2010 Pharmacopoeia of the People's Republic of China 2005 virus activity from Rheum palmatum L ethanol extract Chemotherapy 2007, 53 (5), pp.320-326 Chang CH, Lin CC, Yang JJ, Namba T, Hattori M Anti-inflammatory effects of emodin from ventilago leiocarpa Am J Chin Med 1996, 24, pp.139-142 Yoshiki Kashiwada, Gen-ichiro Nonaka, Itsuo Nishioka Studies on Rhubarb (Rhei Rhizoma) XV Simultaneous determination of phenolic constituents by high-performance liquid chromatography Chem Pharm Bull 1989, 37 (4), pp.999-1004 Komatsu K, Nagayama Y, Tanaka K, Ling Y, Cai SQ, Omote T, Meselhy MR Comparative study of chemical constituents of rhubarb from different origins Chem Pharm Bull 2006, 54 (11), pp.1491-1499 10 Hu Cunhua, Ye Shaojian, Zhao Libo, Wang Jialing Effects of five stilbene compounds on NO mediated vasodilation and their structure - activity relationship Zhongguo Yiyuan Yaoxue Zazhi 2006, 26 (7), pp.826-829 Korean Pharmacopoeia 2007 The Japanese Pharmacopoeia 2001 Okamura Nobuyuki, Abo Naomi, Aono Mio, Eguchi Tomoyori, Yoshii Hisano, Ono Yukio, Yagi Akira Variation of sennoside A content and purgative activity during preparation of rhubarb decoction Wakan Iyakugaku Zasshi 2002, 19 (3), pp.114-118 Li Z, Li LJ, Sun Y, Li J Identification of natural compounds with anti-hepatitis B 39 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 40 ... Chrysophanol Kết phân tích tổng thể sắc đồ Tiến hành phân tích tổng thể sắc đồ dựa 17 pic chung LDA (phân tích phân biệt tuyến tính) cho thấy: mẫu Đại hoàng từ nguồn gốc khác đƣợc phân biệt với... cứu này, chúng tơi kết hợp phân tích định lƣợng phân tích tổng thể sắc đồ nhằm đánh giá toàn diện chất lƣợng Đại hồng từ lồi khác Hình 1: Cấu trúc hóa học hoạt chất Đại hoàng: Sennoside A, Rhaponticin,... tƣơng ứng với lồi với độ xác 100% Phân tích định lƣợng đồng thời hoạt chất kết hợp với phân tích tổng thể sắc đồ sở để đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu nói chung Đại hồng nói riêng TÀI LIỆU THAM