Đang tải... (xem toàn văn)
Qua khảo sát sàng lọc các cây có tác dụng chống oxy hóa với 3 phân đoạn cao dichloromethan, methanol, nước theo độ phân cực của các chất có trong cây trong nghiên cứu cho thấy kết quả cao methanol của cây diếp cá có tác dụng chống oxy hóa mạnh trên mô hình sàng lọc tác dụng chống oxi hóa DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl).
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN EX VIVO CỦA CAO CHIẾT DIẾP CÁ HOUTTUYNIA CORDATA Nguyễn Thị Phương Hạnh*, Võ Văn Giàu*, Huỳnh Ngọc Thụy* TÓM TẮT: Giới thiệu: Qua khảo sát sàng lọc có tác dụng chống oxy hóa với phân đoạn cao dichloromethan, methanol, nước theo độ phân cực chất có trong nghiên cứu cho kết cao methanol diếp cá có tác dụng chống oxy hóa mạnh mơ hình sàng lọc tác dụng chống oxi hóa DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)(3) Do cao methanol diếp cá dùng để kiểm tra tác dụng bảo vệ gan ex vivo, cao có tác dụng tiếp tục thử nghiệm mô hình in vivo.Việc sàng lọc tác dụng làm hạ men gan, bảo vệ tế bào gan triển khai dòng tế bào gan chuột tách ni cấy theo PP Kiso(2) sau bị gây độc CCl4 Đánh giá mức độ thương tổn tế bào gan đánh giá hoạt tính bảo vệ gan cao chiết nồng độ khác qua kết đo hoạt lực men gan Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Sử dụng mơ hình tách tế bào gan chuột Kiso(2) có thay đổi số bước cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam Tế bào đơn sau tách ủ phục hồi với thời gian h mơi trường EMEM có bổ sung số chất cần thiết cho tế bào, sau gây độc tế bào CCl4 1,5% thời gian 45‘ làm tăng cao hoạt độ enzym ALT môi trường Tiến hành thử nghiệm tác dụng bảo vệ tế bào gan cao chiết methanol từ diếp cá (Houytuynia cordata) mơ hình gây tổn thương tế bào gan carbon tetrachlorid (CCl4) (ex vivo) với tế bào tách nuôi cấy Kết quả: Kết thử nghiệm cho thấy nồng độ khác cao chiết methanol diếp cá có tác dụng hạ men gan, bảo vệ tế bào Kết luận: Từ kết thu sơ kết luận cao chiết methanol diếp cá có tác dụng việc làm hạ men gan tế bào gan bị gây nhiễm độc CCl4 Từ khóa: tế bào gan, diếp cá, CCl4, tác dụng bảo vệ gan ABSTRACT HEPATOPROTECTIVE ACTIVITIES OF HOUTTUYNIA CORDATA EXTRACT ON CARBON TETRACHLORIDE INDUCED HEPATOTOXICITY EX VIVO Nguyen Thi Phuong Hanh, Vo Van Giau, Huynh Ngoc Thuy * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 622 - 627 Introduction Houttuynia cordata Thunb is a medicinal herb that generally be used in Vietnamese traditional medicine Many studies have shown that flavonoids exhibited a wide range of biological or physiological effects including anti-inflammatory, anti-allergic, and anti-cancer activities However, no reports to be discussed about the relationship between the levels of H cordata flavonoids and its biological characteristics Method: In our present study, the hepatoprotective activities of the Houttuynia cordata extracts with different solvents were performed on carbon tetrachloride (CCl4) induced cytotoxicity model modified by Kiso procedure Suspension of isolated mouse hepatocytes was incubated in EMEM medium under a 95% O2 and 5% CO2, 37 oC in 2h before the addition of 1.5% CCl4 and incubated in 45 CCl4 administration significantly * ĐH Ton Duc Thang; * BM Dược liệu – Khoa Dược - ĐH Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS Huỳnh Ngọc Thụy ĐT: 0902373986 Email: huynhthuyth@gmail.com 622 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học increased serum alanine aminotransferase (ALT) activity, a biochemical marker of hepatocyte injury, in medium Results:the methanol extract of Houttuynia cordata have reduced the level of ALT and protected mice liver cells at a concentration of 0.05 mg/ml Conclusion: the methanol extract of Houttuynia cordata have reduced the level of ALT and protected mice liver cells Key words: hepatocyte, Houttuynia cordata, CCl4, hepatoprotective activity nghiên cứu cho kết cao ĐẶT VẤN ĐỀ methanol diếp cá có tác dụng chống oxy Bệnh gan vấn đề thường hóa mạnh mơ hình sàng lọc tác dụng chống gặp cộng đồng Có nhiều loại bệnh gan oxi hóa DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)(3) bệnh thường gặp tổn thương tác dụng chống oxy hóa có liên quan đến gan gây bệnh viêm gan dẫn đến xơ gan việc phòng ngừa chữa trị nhiều loại bệnh tật ung thư gan cuối gây tử vong với có tác dụng chữa bệnh viêm gan Do nguyên nhân chủ yếu virút nhiễm độc cao methanol diếp cá dùng để Phần lớn chất gây độc cho gan chủ yếu kiểm tra tác dụng bảo vệ gan ex vivo, cao superoxid hóa lipid thương tổn khác có tác dụng tiếp tục thử nghiệm stress oxy hóa(1) mơ hình in vivo Hiện phương pháp thử nghiệm in Việc sàng lọc tác dụng làm hạ men gan, bảo vitro dùng phổ biến để sàng lọc ban đầu vệ tế bào gan triển khai dòng tế bào cao chiết, phân đoạn chiết dược liệu gan chuột tách nuôi cấy theo phương pháp chất tinh khiết phương pháp Kiso(2) sau bị gây độc CCl4 CCl4 sàng lọc lượng lớn mẫu chất độc sử dụng phổ biến mơ hình thời gian ngắn với chi phí thấp, lượng mẫu sử thử nghiệm gây tổn thương gan in vitro in vivo dụng nhỏ kết có độ lặp lại cao Phương Chất gây nên xơ hóa gan làm thay đổi pháp sàng lọc in vitro có nhiều mơ hình khác số sinh hóa gan với triệu chứng sử dụng giới Trong nghiên tương tự với viêm gan virút cấp tính(3,4) Khi tế cứu sử dụng phương pháp tách tế bào bị tổn thương enzym transaminsase bào đơn từ gan thú vật thử nghiệm(2) có ALT, AST tiết môi trường làm cho hoạt độ ALT khảo sát thay đổi bước tiến hành đo môi trường tăng Đánh giá mức độ cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm thương tổn tế bào gan đánh giá hoạt tính bảo chúng tơi Sử dụng tế bào đơn tách vệ gan cao chiết nồng độ khác qua nuôi cấy được, tiến hành sàng lọc tác dụng làm kết đo hoạt lực men gan hạ men gan mơ hình tế bào gan bị nhiễm ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP độc carbon tetrachlorid (CCl4), đối tượng thử nghiệm diếp cá (Houttuynia cordata Hóa chất Blume), dược liệu sử dụng phổ biến Type I collagenase (Gibco), dimethyl với tác dụng cầm máu, trị trĩ, tác dụng bảo sulfoxide (DMSO) trypan blue (Merck), vệ gan dược liệu chưa Phosphate Buffered Saline (PBS; Oxoid); ý Albumin huyết bò, Mơi trường Eagle's Cây diếp cá có tác dụng trị bệnh trĩ, kháng minimal essential medium (E’MEM), huyết khuẩn Gần đây, việc tìm kiếm, sàng lọc bào thai bò, dexamethasone, insulin có tác dụng chống oxy hóa với phân (Sigma) Kit thử alanine aminotransferase (ALT) đoạn cao dichloromethan, methanol, nước theo Diagnosticum Zrt Các hóa chất khác đạt độ phân cực chất có trong tiêu chuẩn cho thí nghiệm phân tích Chuyên Đề Dược Khoa 623 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Đối tượng nghiên cứu Cây diếp cá thu mua Bình dương, thành phố Hồ Chí Minh Bộ phận dùng phần mặt đất Mẫu xác định việc khảo sát đặc điểm hình thái thực vật học dựa quan sát tươi Dược liệu rửa sạch, phơi bóng râm đến khơ, xay nhỏ làm nguyên liệu cho chiết xuất Chuột nhắt trắng (chủng Swiss albino) 20 – 25 g mua từ viện Vacxin sinh phẩm Y tế Nha Trang, nuôi phòng thí nghiệm Dược lý – Khoa Dược – trường ĐH Y Dược TP HCM Khảo sát nồng độ CCl4 thời gian ủ tế bào thích hợp Tiến hành thăm dò nồng độ CCl4 tối thiểu dùng gây độc tế bào, phóng thích enzym gan đủ để khảo sát thay đổi enzym trình thử nghiệm Pha CCl4 với 1% DMSO nước cất để có dãy nồng độ CCl4 1,0%; 1,5% 2,0% Chọn nồng độ CCl4 thích hợp để sử dụng cho thử nghiệm Thăm dò thời gian ủ tế bào với CCl4 thích hợp, dò tìm thời điểm hoạt độ men gan tăng cao cách tiến hành ủ tế bào thời Phương pháp nghiên cứu gian 90 phút, thời gian ủ, 15 phút Chuẩn bị mẫu thử hút dịch nuôi cấy đo hoạt lực enzym ALT 50 g dược liệu ngâm dichloromethan 24 tiếng sau đun hồi lưu cách thủy nhiệt độ 40 oC giờ, lọc nóng, chiết lặp lại đến giọt dịch chiết không để lại cắn Gộp dịch chiết, thu hồi dung môi để thu cao dichloromethan Bã dược liệu loại dung môi tiếp tục chiết cách đun hồi lưu cách thủy bã dược liệu với dung môi methanol 60 oC giờ, lọc nóng, chiết lặp lại đến giọt dịch chiết không để lại cắn, gộp dịch chiết, thu hồi dung môi để thu cao methanol tất mẫu Chọn thời điểm mà hoạt lực enzym cao để làm thí nghiệm Thử nghiệm sàng lọc tác dụng làm hạ men gan cao chiết diếp cá mơ hình tế bào gan chuột nhiễm độc CCl4 Tế bào gan chuột sau tách ủ phục hồi 2h điều kiện nêu trên, sau tiến hành gây độc tế bào CCl4 bổ sung cao chiết diếp cá (mẫu thử) vào ống đựng tế bào cho nồng độ cuối mẫu thử ống đựng tế bào đạt nồng độ mong muốn Tách tế bào gan khác để kiểm tra hoạt độ men gan ALT Theo phương pháp Kiso cộng (1983)(2) Tiến hành khảo sát phương pháp với số thay đổi cho phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm chỗ Tiến hành song song thử nghiệm mẫu Tế bào đơn sau tách đáp ứng mật độ tế bào tối thiểu (>105 tế bào/ml) hòa mơi trường E’MEM bổ sung huyết bào thai bò (10%), dexamethasone (10-6 M), insulin (10-8 M), gentamicin (50 µg/L) chia vào ống (vial) 0,5 ml ủ điều kiện 95% O2 5% CO2, 37 0C để tế bào phục hồi sau trình tách nhiều lần (N=10) với n =6 cho lần thử 624 chứng trắng không gây độc mẫu gây độc không dùng thuốc thử nghiệm để đánh giá so sánh kết Các thử nghiệm lặp lại nghiệm (N=số chuột sử dụng tách tế bào gan; n=số ống tế bào sử dụng cho mẫu)w Đánh giá kết Đo hoạt tính men gan ALT theo hướng dẫn cách đo nhà sản xuất (Diagnosticum) Kết đánh giá theo chương trình phân tích thống kê liệu phần mềm Exel Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chuẩn hóa quy trình tách ni cấy tế bào Tiến hành tách tế bào gan chuột theo phương pháp tách tế bào gan chuột Kiso cộng sự(3), nhiên việc bơm rửa gan đường tĩnh mạch chủ không thực bơm rửa gan dung dịch có bổ sung collagenase khơng thể thực phải sử dụng lượng lớn collagenase Chúng tiến hành thăm dò thay đổi số bước thực cho phù hợp với điều kiện có phòng thí nghiệm rút qui trình cụ thể sau: Chuột đạt đến trọng lượng yêu cầu (20 – 25g) gây mê ether mở ổ bụng để bộc lộ quan bên trong, quan hệ tiêu hóa dày, ruột kéo sang bên để quan sát tĩnh mạch cửa gan Dùng kim cong có luồn qua tĩnh mạch chủ cột cố định tĩnh mạch chủ phía ngực Cắt tĩnh mạch chủ vị trí tĩnh mạch thận để tạo đường thoát dịch cho việc bơm rửa gan Đâm kim luồn vào tĩnh mạch cửa gan, dùng cột cố định ống luồn với tĩnh mạch cửa Bơm PBS vào ống luồn tĩnh mạch để rửa gan Rửa gan chuyển sang màu vàng nhạt dung dịch PBS chảy từ tĩnh mạch thân khơng màu đỏ Gan sau rửa tách khỏi thể chuột giữ dung dịch PBS có chứa kháng sinh nhanh chóng chuyển vào tủ cấy vơ trùng Tại gan rửa lại PBS khơng có chứa kháng sinh Gan ngâm ngập dung dịch collagenase 0,075%, lắc 100 vòng/phút máy lắc phút 37oC Dùng kẹp nhẹ nhàng vuốt gan phân tán tế bào (luôn ln giữ gan chìm dung dịch collagenase 0,075%) Kết đạt sau trình tạo hỗn dịch trắng đục Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học Hỗn dịch tiếp tục lắc 10 phút (100 vòng/phút) 37oC dung dịch collagenase Cốc đựng hỗn dịch để tủ lạnh 15 phút Lọc qua gạc-cotton vơ trùng Sau thu lấy dịch chứa tế bào đơn, ly tâm 15.000 vòng/phút 15 phút 37 oC Thu lấy cặn tế bào Rửa cặn tế bào dung dịch PBS khơng có chứa kháng sinh để loại bỏ collagenase Ly tâm 15.000 vòng/phút 15 phút 37 0C thu lấy cặn tế bào Quá trình lặp lại từ – lần hồng cầu (Rửa – lọc – ly tâm) Xác định mật độ tế bào tỷ lệ sống chết cách nhuộm tế bào trypan blue 0.4% Sau nhuộm tế bào trypan blue, đếm tế bào chết, ghi nhận tế bào sống buồng đếm Neubauer Kết cho thấy tế bào gan với tỉ lệ sống cao trình bày bảng Thêm mơi trường ni EMEM có bổ sung 10% huyết bê, 10-7 M insulin, 1% DMSO vào tế bào Ủ tế bào tủ ủ điều kiện 37 oC, 5% CO2/95% O2 Tế bào tách tiếp tục sử dụng nghiên cứu theo hướng khác Việc chuẩn hóa q trình phân lập tách tế bào gan thay đổi số bước sau: Bỏ qua giai đoạn truyền men collagenase vào buồng gan thay vào ngâm hẳn buồng gan thể tích dung dịch men Collagenase định thời gian định Kết hợp thời gian ngâm buồng gan dung dịch men thời gian lắc tiếp xúc men với tế bào gan, giảm thời gian tách tế bào So sánh với qui trình Kiso, qui trình có ưu điểm sau: Do bỏ qua giai đoạn truyền collagenase liên tục vào buồng gan, tiến hành ngâm thẳng buồng gan tế bào gan sau phân tán vào dung dịch men collagenase nên - Giảm đáng kể lượng collagenase sử dụng mà bảo đảm tiếp xúc men với tế bào gan phân tán thời gian định - Giảm đáng kể chi phí cho thử nghiệm 625 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 - Đơn giản hóa qui trình như: bỏ qua giai đoạn cột rửa tĩnh mạch cửa (phức tạp, khó thực kéo dài thời gian tách tế bào) - Thời gian thực nhanh từ 10-15 phút (thay 30-45 phút) nên hạn chế tỷ lệ tế bào gan bị chết Collagenase enzym thuỷ phân liên kết peptid dạng poly-L prolin đặc trưng cho vùng xoắn collagen Theo quy trình Kiso2, việc truyền thẳng trực tiếp collagenase vào buồng gan giai đoạn ngắn, gây tốn men mà sau phải cho tiếp xúc men với tế bào gan phân tán, gộp giai đoạn bảo đảm hiệu tách tế bào gan thể qua kết thử nghiệm Các thử nghiệm cho thấy kết có tính lặp lại, mật độ tế bào tách cao ổn định Nhận xét bước rửa gan quan trọng Nếu rửa gan khơng kỹ hồng cầu nhiều dẫn đến việc phải lặp lại nhiều lần giai đoạn rửa gan, điều dẫn đến tỉ lệ tế bào gan chết cao, mật độ tế bào sống thấp Bảng Kết tách tế bào đơn enzym collagenase type I Lần thực Mật độ tế bào Số tế bào sống Tỷ lệ (%) (tế bào/ml) (tế bào/ml) Lần 79,7.10 77,8.105 97.6 Lần 88,1.105 83,6.105 94.9 Lần 59,3.105 54,6.105 92.1 Trung bình 75,7.105 71,9.105 94.8 Khảo sát nồng độ gây độc CCl4 thời gian thích hợp ủ tế bào với CCl4 Kết khảo sát việc sử dụng nồng độ CCl4 khác (1,0; 1,5; 2,0%) tìm thời gian ủ thích hợp khoảng thời gian 90 phút trình bày hình Kết cho thấy nồng độ 1,0 1,5%, lượng men gan tiết môi trường tăng theo thời gian ủ từ 15 đến 45 phút giảm dần thời gian 75 phút 90 phút nồng độ 2,0 % CCl4, hoạt độ men gan tăng dần khoảng 15-30 phút giảm dần khoảng 45-90 phút Hoạt độ men gan đo cao ổn định nồng độ CCl4 1,5% với thời gian 45 phút 626 ALT 500 (IU/L) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 CCl4 1,0% CCl4 1,5% CCl4 2,0% 20 40 60 80 100 Thời gian ủ CCl4 (phút) Hình Ảnh hưởng nồng độ CCl4 thời gian ủ đến thay đổi men gan môi trường nuôi tế bào Với kết trên, chọn nồng độ gây độc CCl4 1,5% thời gian gây độc tế bào 45 phút làm thơng số để thực thí nghiệm sàng lọc tác dụng bảo vệ gan mơ hình ex vivo Sàng lọc tác dụng hạ men gan mơ hình tế bào gan chuột bị nhiễm độc CCl4 Tác dụng bảo vệ gan cao methanol chiết từ diếp cá trình bày hình 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 Kết hoạt tính bảo vệ gan cao chiết H.cordata UI/l Nghiên cứu Y học Lô trắng Lô độc Lô thử Lô thử Lô thử Lô thử Lô chứng trắng: tế bào chưa bị nhiễm độc; Lô chứng độc: tế bào bị gây độc CCl4; Lơ 1,2,3,4: lơ thử nghiệm có dùng thuốc sau gây độc thứ tự nồng độ 0,05; 0,1; 0,25 0,5 mg/ml Hình 2.Hoạt tính bảo vệ gan ex vivo cao chiết diếp cá nồng độ khác Lô độc cho kết hoạt độ men gan 644 ± 23 UI/l, tăng 14,67 lần so với nhóm chứng trắng (tế bào trước ủ CCl4) 361.6 UI ủ tế bào gan nồng độ 1,5% CCl4 khoảng thời gian 45 phút Kết cho thấy lô thử nồng độ khác diếp cá (0,05; 0,1; 0,25 0,5 mg/ml) có tác dụng làm hạ men gan, bảo vệ Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 gan (Hình 2) Ở lơ thử (có nồng độ 0,05 mg/ml) cho kết hạ men gan với hoạt độ men gan 220,6 ± 19 UI/L giảm 2,9 lần so với lô chứng độc Ở nồng độ 0,1 0,25 mg/ml cao chiết diếp cá (lô 2,3) cho tác dụng hạ men gan mạnh nhất, với hoạt độ 136.6 ± 15 UI/L 127.4 ± 18 UI/L giảm 4,7 lần lần so với lô chứng độc Từ kết thu thử nghiệm kết luận diếp cá có tác dụng hạ men gan theo kết thử nghiệm ex vivo Nhận xét lô chứng trắng hoạt độ enzym cao mức bình thường, thử nghiệm lặp lại cho kết tương tự, nhận định tế bào nhiều bị thương tổn, thời gian thử nghiệm ngắn (chỉ vòng 45 phút) nên thương tổn tế bào q trình rửa tách chưa hồi phục hồn toàn Để kết tốt nên kéo dài thời gian hồi phục tế bào sau tách nuôi cấy đưa vào thử nghiệm cấy tế bào gan sàng lọc sinh học cho mẫu thử nghiệm Nồng độ gây độc CCl4 1,5%; thời gian thử nghiệm 45 phút dùng làm thông số cho nghiên cứu sàng lọc bảo vệ gan cao chiết, phân đoạn hay chất tinh khiết nghiên cứu Qua thử nghiệm ex vivo cho thấy cao methanol diếp cá có tác dụng hạ men gan, nồng độ 0,1 mg/ml có tác dụng chống lại chất gây độc, làm hạ men gan, bảo vệ tế bào gan có hiệu (giảm 4,7 lần so với lô chứng độc), nồng độ 0,05 mg/ml có tác dụng làm hạ men gan 2,9 lần so với lô độc Như vậy, cao methanol diếp cá nghiên cứu sâu qua nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan in vivo phân lập chất tinh khiết có tác dụng bảo vệ gan phân đoạn TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Đã đề nghị số bước chuẩn hóa qui trình tách tế bào gan để thử nghiệm sàng lọc bảo vệ tế bào gan ex vivo, tế bào gan thu được dùng cho nghiên cứu khác nuôi Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học Dianzani M.U., Muzia G., Biocca M.E., and Canuto R.A (1991)Lipid peroxidation in fatty liver induced by caffeine in rats International journal of tissue reactions 13, 79-85 Kiso Y., Tohkin M., Hikino H (1983), Assay method for antihepatotoxic activity using carbon tetrachloride induced cytotoxicity in primary cultured hepatocytes Planta Medica 49(12), 222-225 Kumar V, Cotran RS, Robbins SL.(1992), Cell injury and adaptation; 5th ed Bangalore India: Prime Books Publ, 3-24; Viện Dược liệu (2004),Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (tập 1),NXB KHKT, 672-675 627 ... men gan mơ hình tế bào gan chuột bị nhiễm độc CCl4 Tác dụng bảo vệ gan cao methanol chiết từ diếp cá trình bày hình 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 Kết hoạt tính bảo vệ gan. .. Hình 2 .Hoạt tính bảo vệ gan ex vivo cao chiết diếp cá nồng độ khác Lô độc cho kết hoạt độ men gan 644 ± 23 UI/l, tăng 14,67 lần so với nhóm chứng trắng (tế bào trước ủ CCl4) 361.6 UI ủ tế bào gan. .. lô chứng độc Từ kết thu thử nghiệm kết luận diếp cá có tác dụng hạ men gan theo kết thử nghiệm ex vivo Nhận xét lô chứng trắng hoạt độ enzym cao mức bình thường, thử nghiệm lặp lại cho kết tương