Đang tải... (xem toàn văn)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành giải trình tự exon 2 gen RHOA cho 38 bệnh nhân ung thư dạ dày thể lan tỏa nhằm phát hiện đột biến exon 2 gen RHOA. Kết quả cho thấy tần số đột biến RHOA là 5,3% (2/38) với điểm nóng là Tyr42 trong chuỗi protein RHOA. Các đột biến này ảnh hướng đến vùng chức năng và gây nên những thiếu sót trong tín hiệu RHOA, điều khiển quá trình né tránh anoikis trong phát triển bào quan.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN EXON GEN RHOA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY THỂ LAN TỎA Đặng Thị Nga, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn, Đặng Thị Ngọc Dung Trường Đại học Y Hà Nội Ung thư dày thể lan tỏa type ung thư có xu hướng xâm lấn dẫn đến di sớm tỷ lệ sống thêm thấp Không giống ung thư dày thể ruột nơi mà khối u có khuếch đại HER2 điều trị trastuzumab, thiếu liệu pháp điều trị đích hiệu cho ung thư dày thể lan tỏa Sự khác biệt dần làm sáng tỏ đột biến gen RHOA- gen mã hoá RhoA GTPase nhỏ quan sát thấy bệnh nhân ung thư dày thể lan tỏa số nghiên cứu gần Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành giải trình tự exon gen RHOA cho 38 bệnh nhân ung thư dày thể lan tỏa nhằm phát đột biến exon gen RHOA Kết cho thấy tần số đột biến RHOA 5,3% (2/38) với điểm nóng Tyr42 chuỗi protein RHOA Các đột biến ảnh hướng đến vùng chức gây nên thiếu sót tín hiệu RHOA, điều khiển q trình né tránh anoikis phát triển bào quan Những nghiên cứu chúng tơi giúp tìm liệu pháp điều trị đích đầy tiềm cho thể ung thư dày tiên lượng nghèo nàn khơng có thuốc điều trị phân tử đích hữu hiệu Từ khóa: Ung thư dày thể lan tỏa, gen RHOA I ĐẶT VẤN ĐỀ phát bệnh nhân ung thư dày Ung thư dày loại ung lan tỏa có tính chất gia đình đột biến gen thư phổ biến giới đứng hàng RHOA - gen mã hoá RhoA GTPase nhỏ đầu ung thư đường tiêu hóa [1] quan sát thấy bệnh nhân ung thư Ung thư dày Lauren chia thành dày thể lan tỏa [6 - 10] thể mô bệnh học riêng biệt thể ruột thể Gen RHOA nẳm nhánh ngắn nhiễm lan tỏa với khác biệt rõ rệt dịch tễ, bệnh sắc thể số 3, mã hóa protein RhoA GTPase nguyên đặc biệt tiên lượng [2; 3] Thể lan đóng vai trò quan trọng di chuyển, tỏa có xu hướng xâm lấn chuyển thành di kết dính, sống sót, phân chia tế bào sớm có tiên lượng xấu Hơn nữa, biểu gen RHOA ban đầu mô tả không giống thể ruột, nơi khối u gen sinh ung thư tăng cường tăng cường biểu HER2 điều trị hiệu biểu dẫn đến chuyển dạng ác tính Trastuzumab, hình thành khối u in vivo [11; 12] Trong thiếu phương pháp điều trị đích hiệu thực tế, tăng cường biểu gen RHOA cho bệnh nhân thể lan tỏa [4; 5] Sự khác quan sát thấy nhiều bệnh lý ác tính biệt dần làm sáng tỏ đột thường liên quan đến tiến triển nhiều biến gen CDH1-gen mã hóa E-cadherin loại ung thư ung thư vú, u Lympho, ung thư gan nguyên phát, ung thư đại trực tràng Địa liên hệ: Đặng Thị Ngọc Dung, Bộ mơn Hóa Sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Email: ngoczung@hmu.edu.vn Ngày nhận: 24/9/2018 Ngày chấp thuận: 22/10/2018 32 [13; 14] Một số nghiên cứu gần nhận thấy đột biến gen RHOA xuất cách đặc hiệu ung thư dày thể lan tỏa gợi ý phân tử đích đầy tiềm TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC để điều trị thể ung thư dày có tiên thư dày nguyên phát với mô bệnh học lượng xấu [15; 16] thuộc type lan tỏa theo phân loại Lauren 1965 Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu đột biến gen RHOA bệnh nhân ung thư dày thể lan tỏa, tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Xác định đột biến exon gen RHOA bệnh nhân ung thư dày thể lan tỏa + Tình nguyện tham gia vào nghiên cứu - Tiêu chuẩn loại trừ: + Bệnh nhân, gia đình bệnh nhân khơng đồng ý tham gia nghiên cứu + Không đủ hồ sơ thông tin bệnh nhân thời điểm kết thúc nghiên cứu II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng 38 bệnh nhân chẩn đoán xác định ung thư dày thể lan tỏa theo phân loại Lauren 1965 dựa mô bệnh học bệnh viện 2.3 Lấy mẫu Mẫu mô ung thư dày lan tỏa sinh thiết đúc khối nến thu thập sau bệnh nhân chẩn đoán xác định dựa vào kết mô bệnh học K sở Tân Triều, Bệnh viện 108 Bệnh 2.4 Kỹ thuật tách chiết DNA viện Đại học Y Hà Nội đưa vào nghiên Các mẫu mô lựa chọn vùng tập trung cứu từ tháng 06/2017 đến tháng 06/2018 Các bệnh nhân xác định đột biến exon gen RHOA Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Phương pháp 2.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán ung thư dày thể lan tỏa Bệnh nhân chẩn đoán ung thư dày thể lan tỏa theo phân loại mô bệnh học Lauren 1965: gồm mảng tế bào dạng thượng bì tế bào rải rác tế bào ung thư (tại Khoa Giải phẫu bệnh) cách đánh dấu vùng mô ung thư để phân biệt với vùng mô lành xung quanh Các mẫu DNA tách chiết từ mẫu mô farafin theo QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức) Nồng độ độ tinh DNA kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD 260/280) 2.5 Kỹ thuật PCR - Phản ứng PCR khuếch đại exon gen RHOA sử dụng cặp mồi: chất mơ đệm khơng có + Mồi xi: GGATCGGCGTACTAGAAGTTTG chứng tạo tuyến, khơng có tính kết dính Ung + Mồi ngược: ACATGGAAAATGGCAT- thư thể lan tỏa gồm tế bào nhẫn, CAGTTGTT lan rộng theo lớp niêm mạc, thâm nhập - Thành phần phản ứng PCR (thể tích 25 µl): 12.5 µl Hotstart, 0.5 µl mồi xuôi, 0.5 µl mồi tế bào viêm, thường có mức độ biệt hóa 2.2 Tiêu chuẩn lựa chọn loại trừ ngược, µl DNA 10.5 µl H2O - Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 950C/5 - Tiêu chuẩn lựa chọn: phút, 40 chu kỳ [950C/30 giây, 600C/30 giây, + Tuổi ≥ 18 tuổi 720C/30 giây], 720C/5 phút + Bệnh nhân chẩn đoán xác định ung TCNCYH 115 (6) - 2018 - Bảo quản mẫu ở: 100C 33 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ngày 21 tháng năm 2016 Các đối tượng 2.6 Tinh DNA Sản phẩm PCR tinh phương pháp Ethanol precipitation tham gia hoàn toàn tự nguyện có quyền rút khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia Các thông tin liên quan đến bệnh 2.7 Kỹ thuật giải trình gen trực tiếp nhân đảm bảo bí mật Sản phẩm PCR sau tinh tiến hành giải trình tự trược tiếp máy ABI se- III KẾT QUẢ quencer 3500 Kết thu thập sử lý Kết khuếch đại exon gen RHOA phần mềm BioEdit 7.2.6 ApE-A plasmid Editor 2.0.3 Trình tự so sánh GeneBank để phát đột biến DNA (NG_051308.1), mRNA (NM_001313941.1) Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon gen RHOA để khuếch đại DNA tách từ mẫu mơ farafin Kết hình cho thấy, sản phẩm PCR Đạo đức nghiên cứu thu có băng đặc hiệu, rõ nét, kích Nghiên cứu chấp thuận thước 307 bp, khơng có sản phẩm phụ Sản hội đồng đạo đức nghiên cứu Y sinh học phẩm PCR đảm bảo phản ứng giải trình tự Trường Đại học Y Hà Nội, số 198/HĐĐĐĐHYHN để phát đột biến M (+) (-) 307 bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2, gen RHOA M: marker; (-) chứng âm; (+): chứng dương, - 7: mẫu bệnh nhân Kết xác định đột biến exon gen RHOA Tiến hành xác định đột biến kỹ thuật giải trình tự exon gen RHOA Bảng Kết đột biến exon gen RHOA bệnh nhân ung thư dày thể lan tỏa MS Thay đổi c.DNA Thay đổi acid amin Tài liệu công bố 4249 c.36634 A > G Tyrocine 42 Cysteine (Y42C) Kakiuchi (2014) [8] 65360 c.36634 A > G Tyrocine 42 Cysteine (Y42C) Wang(2014) [9] Kết phát 2/38 (5,3%) có đột biến điểm exon gen RHOA Cả hai đột 34 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biến đột biến sai nghĩa (missense mutation) Tại vị trí 36634 phân tử mRNA gen RHOA tương ứng với nucleotid A người bình thường thay nucleotid G dẫn đến thay đổi acid amin Tyrocine vị trí 42 thành Cystein Hình Kết giải trình tự gen bệnh nhân 65360 IV BÀN LUẬN Ung thư dày thể lan tỏa đặc trưng kết dính tế bào nên có xu hướng di sớm, thể ác tính với mức độ biệt hóa có tiên lượng xấu hai giới Ở Việt Nam, hàng năm số lượng lớn người bị bệnh thường đến viện giai đoạn muộn với nhiều tổn thương phức tạp biến chứng nặng nề Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu đề cập tỷ lệ mắc bệnh, biểu lâm sàng, kết điều trị biến chứng bệnh Việc phát đột biến gen RHOA bệnh nhân ung thư dày thể lan tỏa lại quan sát thấy type ung thư dày khác làm sở đầy tiềm triển khai liệu pháp điều trị đích tỉ lệ đột biến exon 13,3% tỷ lệ đột biến hotspot Tyr42Cys 4,1%, theo Kakiuchi tỷ lệ 18,4% (16/87) 6,9% (6/87) [8; 9] Đây loại đột biến nằm vị trí gắn GTP, ảnh hưởng sau sắc đến hoạt động thân protein, làm khả gắn GTP Wang cộng nhận thấy RHOA đột biến Tyr42Cys khiến tế bào khỏi q trình anoikis (một dạng đặc biệt apoptosis) mơ hình ni cấy mơ ruột non chuột liên quan đến đặc trưng hình thái type lan tỏa Kakiuchi chứng minh ảnh hưởng thúc đẩy tăng trưởng đột biến RHOA Tyr42Cys dòng tế bào bị đột biến RHOA (SW948) hướng đến bệnh nhân có HER2 âm Tất đột biến dạng dị hợp tính Đột biến gen RHOA chủ yếu nằm hai tử, điều giải thích bệnh nhân mang exon Vì nghiên cứu bước đầu đột biến dù dạng dị hợp tử tiến hành giải trình tự exon vùng có đột vùng chức ảnh hưởng sâu sắc biến thường gặp gen RHOA đến trình phát triển bệnh Nghiên cứu phát 2/38 (5,3%) Tần suất mắc đột biến khác bệnh nhân mang đột biến exon gen quốc gia nghiên cứu khác RHOA, hai đột biến Tyr42Cys Tỷ lệ nhau, nhiên có đặc điểm chung thấp so với nghiên cứu Wang đột biến Tyr42Cys hotspots TCNCYH 115 (6) - 2018 35 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ý nhiều nghiên cứu gen vanced gastric or gastro-oesophageal junction RHOA bệnh nhân ưng thư dày thể lan cancer (ToGA): a phase 3, open-label, ran- tỏa domised controlled trial Lancet, 376(9742), 687 - 697 V KẾT LUẬN Đã phát 2/38 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Tyr42Cys exon gen RHOA Đây đột biến hotspot có tính chất định chức gen nhiều nghiên cứu đề cập tới Tuy nhiên, để hiểu cặn kẽ chế bệnh sinh RHOA ung thư dày thể lan tỏa cần nghiên cứu với cỡ mẫu lớn nghiên cứu chuyên sâu Lời cảm ơn Jin Zhou., Yoku Hayakawa., Timothy C Wang et al (2014) RhoA Mutations Identified in Diffuse Gastric Cancer Cancer Cell, 26 (1), - 11 Guilford P., Hopkins J., Harraway J et al (1998) E-cadherin germline mutations in familial gastric cancer Nature, 392(6674), 402 - 405 Ina Chen., Lesley Mathews‑Greiner., Dandan Li et al (2017) Transcriptomic profiling and quantitative high-throughput (qHTS) drug screening of CDH1 deficient hereditary diffuse gastric cancer (HDGC) cells identify Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát treatment leads for familial gastric cancer triển khoa học công nghệ Quốc gia Journal of Translational Medicine, 15(1), - 16 (NAFOSTED) đề tài mã số 106-YS.02- Kakiuchi M., Nishizawa T., Ueda H.,et al (2014) Recurrent gain-of- function mutations of RHOA in diffuse-type gastric carci- 2015.37 Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO WHO (2014) World Cancer Report 2014 Lauren P (1965) The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-called intestinal-type carcinoma An attempt at a histo - clinical classification Acta Pathol Microbiol Scand, 64, 31 - 49 Lazăr D., Tăban S., Sporea I et al (2009) Gastric cancer: Correlation between clinicopathological factors and survival of patients Romanian Journal of Morphology and noma Nature genetics, 46(6), 583 - 587 Wang K., Yuen S.T., Xu J et al (2014) Whole-genome sequencing and comprehensive molecular profiling identify new driver mutations in gastric cancer Nature genetics, 46 (6), 573 - 582 10 TCGA (2014) Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma Nature, 513(7517), 202 - 209 11 Yoshizaki H., Ohba Y., Kurokawa K et al (2003) Activity of Rho- family GTPases during cell division as visualized with FRETbased probes J Cell Biol, 162(2), 223 - 232 12 Kathleen O'Connor., Min Chen Embryology, 50(2), 185 - 194 Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereis- (2013) Dynamic functions of RhoA in tumor lova A et al (2010) Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy (3), 141 - 147 alone for treatment of HER2-positive ad36 cell migration and invasion Small GTPases, 13 Sakata-Yanagimoto M., Enami T., Yoshida K et al (2014) Somatic RHOA mutaTCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tion in angioimmunoblastic T cell lymphoma ated with diffuse-type gastric cancer progres- Nat Genet, 46(2), 171 - 175 14 Hu T., Guo H., Wang W et al (2013) Loss of P57 Expression and RhoA Overexpression Are Associated With Poor Survival of sion, but is it gain or loss? Gastric Cancer, 19 (2), 326 - 328 Patients With Hepatocellular Carcinoma On- tric cancer: a comparative clinicopathology col Rep, 30(4), 1707 - 1714 analysis of 87 cases Gastric Cancer, 19(2), 15 Masahiro Maeda., Toshikazu Ushijima (2016) RHOA mutation may be associ- 16 Ushiku T., Ishikawa S., Kakiuchi M et al (2016) RHOA mutation in diffuse-type gas- 403 - 411 Summary MUTATE EXON GENE RHOA IN DIFFUSE GASTRIC CANCER The propensity of diffuse gastric cancer for invasion translates into early metastasis and poor survival Unlike in IGC where tumors with HER2-amplification are treated with trastuzumab, we lack effective targeted therapies for DGC This difference is gradually being clarified as mutations of RHOA - encoding the small GTPase RhoA have been observed in DGC patients in recent studies In this study, we performed exon RHOA sequencing on 38 DGC cases to detect mutations at exon RHOA gene The results showed that RHOA mutations occurs in 5.3% (2/38) of diffuse-type tumors with mutational hotspot Tyr42 in RHOA protein The hotspot affected the functional domains resulting in defective RHOA signaling and promoting escape from anoikis in organoid cultures Our findings identify a potential therapeutic target for this poor-prognosis subtype of gastric cancer with no available molecularly targeted drugs Keywords: RHOA, diffuse gastric cancer TCNCYH 115 (6) - 2018 37 ... bệnh nhân xác định đột biến exon gen RHOA Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Phương pháp 2. 1 Tiêu chuẩn chẩn đoán ung thư dày thể lan tỏa Bệnh nhân chẩn đoán ung thư dày. .. đại exon 2, gen RHOA M: marker; (-) chứng âm; (+): chứng dương, - 7: mẫu bệnh nhân Kết xác định đột biến exon gen RHOA Tiến hành xác định đột biến kỹ thuật giải trình tự exon gen RHOA Bảng Kết đột. .. đoán xác định ung thư dày thể lan tỏa theo phân loại Lauren 1965 dựa mô bệnh học bệnh viện 2. 3 Lấy mẫu Mẫu mô ung thư dày lan tỏa sinh thiết đúc khối nến thu thập sau bệnh nhân chẩn đốn xác định