Đang tải... (xem toàn văn)
Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) với 2 loại probe 13q14‐34 và 17p13 để phát hiện những bất thường nhiễm sắc thể. Bài viết nhằm khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể (NST) 13q14 và 17p13 trên bệnh nhân bệnh đa u tủy.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH KHẢO SÁT BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ 13q14‐34 VÀ 17p13 TRÊN BỆNH NHÂN ĐA U TỦY Lê Nguyễn Kim Dung*, Suzanne Monivong Cheanh Beaupha**, Phan Thị Xinh** TĨM TẮT Mục tiêu: Khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể (NST) 13q14 và 17p13 trên bệnh nhân bệnh đa u tủy. Phương pháp: Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) với 2 loại probe 13q14‐34 và 17p13 để phát hiện những bất thường NST. Kết quả: Trong 20 bệnh nhân được khảo sát, 11 bệnh nhân (55%) có bất thường nhánh dài NST 13 và 9 trường hợp có bất thường NST 17, trong đó chỉ có 6 bệnh nhân (30%) có bất thường đơn độc của 17p13, còn 3 trường hợp còn lại có bất thường đi kèm với NST 13. Kết luận: Kỹ thuật FISH với các đoạn dò đặc hiệu giúp phát hiện các bất thường NST 13 và 17 một cách nhanh chóng, chính xác, giúp thêm dữ liệu cho việc phân nhóm nguy cơ cho bệnh nhân đa u tủy. Từ khóa: Đa u tủy, bất thường NST 13q, bất thường NST 17. ABSTRACT DETECTION OF 13q14‐34 AND 17p13 ABNORMALITIES IN MULTIPLE MYELOMA PATIENTS USING FISH TECHNIQUE Le Nguyen Kim Dung, Suzanne Monivong Cheanh Beaupha, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 175 ‐ 178 Objective: To detect the abnormalities of chromosome 13q14‐34 and 17p13 in patients with multiple myeloma. Methods: The fluorescent in situ hybridization (FISH) technique with two kinds of probe including 13q14‐ 34 and 17p13 was used to detect chromosomal abnormalities Results: Among 20 patient samples were analyzed, 11 patients (55%) had deletion of chromosome 13q and 9 patients had abnormalities chromosome 17. Six (30%) out of 9 patients had only abnormalities chromosome 17, and the remaining 3 out of 9 patients had abnormalities of both chromosome 13 and 17. Conclusion: The interphase FISH with specific probes can detect the abnormalities chromosome 13 and 17 in patients with multiple myeloma quickly, exactly. The result of this study can give more data for risk classification in multiple myeloma. Keywords: multiple myeloma (MM), abnormality chromosome 13q, abnormality chromosome 17. gen gặp trong khoảng 90% trường hợp đa u tủy ĐẶT VẤN ĐỀ mới chẩn đốn và có giá trị tiên lượng bệnh. Các Đa u tủy là một rối loạn tăng sinh ác tính bất thường NST gồm có bất thường về số lượng dòng tương bào đặc trưng bởi sự tích tụ quá và cấu trúc. Bất thường số lượng NST thường mức tương bào trong tủy xương, gây thiếu máu, gặp là trisomy 3, 7, 9, 11, 15 hoặc 17. Đối với tăng protein đơn dòng, hủy xương, tăng calci nhóm bất thường cấu trúc NST, phần lớn có liên máu và suy thận(2). Những nghiên cứu gần đây quan đến gen IgH nằm trên NST 14q32, chuyển cho thấy các bất thường nhiễm sắc thể (NST) và vị với các NST khác như 4, 6, 11, 16 hoặc 20. * ** Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh, ĐT: 0932728115, Email: phanthixinh@yahoo.com 174 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Ngồi ra, còn có những bất thường khác như mất đoạn NST 1, monosomy hay mất đoạn NST 17p13, monosomy 13 hoặc mất đoạn kẽ trên nhánh dài NST 13 và những bất thường liên quan đến gen MYC(3,4). Kumar S và cộng sự nghiên cứu trên 484 bệnh nhân (BN) đa u tủy mới chẩn đoán cho thấy bất thường NST 13q chiếm tỉ lệ cao nhất là 47% và được xếp vào nhóm tiên lượng chuẩn. Các bất thường 17p13, t(4;14), t(14;16) và t(14;20) chiếm tỉ lệ 24% được xếp vào nhóm tiên lượng xấu với thời gian sống trung bình của nhóm này là 3,9 năm so với nhóm tiên lượng chuẩn còn đang lui bệnh tốt (4). Trong 4 kiểu bất thường thuộc nhóm tiên lượng xấu thì 17p13 là thường gặp nhất (13%). Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tơi ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) bước đầu khảo sát 2 dạng bất thường NST thường gặp trong 2 nhóm tiên lượng là bất thường 13q và 17p trên BN đa u tủy tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BV.TMHH), để Nghiên cứu Y học góp thêm dữ liệu giúp các bác sĩ lâm sàng phân nhóm tiên lượng. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Các BN được chẩn đoán đa u tủy theo tiêu chuẩn của IMWG (International Myeloma Working Group) tại BV.TMHH Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 01/2013 đến 06/2013 có gởi mẫu tủy xương khảo sát các bất thường NST. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Mơ tả loạt ca Phương pháp tiến hành Thu hoạch trực tiếp 2 ml mẫu tủy xương của BN đa u tủy trong chống đơng heparin để thu nhận tế bào bạch cầu và cố định tế bào trên tiêu bản. Tiêu bản có thể sử dụng ngay hoặc lưu trữ trong 6 tháng. Hình 1: Cấu trúc đoạn dò 13q14 và 17p13 175 Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Tiến hành biến tính và lai hóa tiêu bản ở 77 C trong 6 phút với các đoạn dò đặc hiệu LSI ® D13S319 SpectrumOrange/LSI 13q34 SpectrumGreen Probe (Hình 1A) và LSI ® TP53 SpectrumOrange/CEP 17 SpectrumGreen Probe (Hình 1B) (Vysis, Hoa Kỳ). Tiếp tục ủ qua đêm ở 37oC trong 18 đến 20 giờ. Sau khi ủ, rửa tiêu bản để loại bỏ những mẫu dò khơng bắt cặp đặc hiệu bằng dung dịch 0,4 x SSC / 0,3% NP‐40 ở 73 oC trong 2 phút, và dung dịch 2 x SSC / 0,1% NP‐ 40 ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Để khơ tiêu bản và phủ 15μl dung dịch DAPI II counterstain (Vysis). Phân tích tìm bất thường nhiễm sắc thể trên 200 tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang BX51 (Olympus, Nhật Bản).Đoạn dò 13q14.3 trải dài 135kb gắn chất phát huỳnh quang màu đỏ và đoạn dò 13q34 gắn chất phát huỳnh quang màu xanh trải dài 612kb (A). Trong khi đó, trên NST 17 đoạn dò gắn chất phát huỳnh quang màu đỏ phủ vùng 17p13.1 trải dài 172kb, đoạn dò gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm tại vùng tâm của NST 17 dùng để kiểm tra sự hiện diện của NST 17 (B). o KẾT QUẢ Trong nghiên cứu này, 20 BN đa u tủy được khảo sát bất thường NST 13q và 17p. Kết quả được xác định khi phân tích 200 tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang. Bất thường NST 13q có 2 dạng là del(13q14) (Hình 2A) hoặc del(13)(q14q34) (Hình 2B) và bất thường NST 17 cũng có 2 dạng là del(17p13) (Hình 2C) hoặc monosomy 17 (Hình 2D). Các bất thường này được nhận diện dựa vào số lượng tín hiệu xanh và đỏ trên mỗi tế bào. Kết quả phân tích cho thấy có 11 BN có bất thường 13q, chiếm tỉ lệ 55% và 9 BN có bất thường NST 17, chiếm tỉ lệ 45%. Trong 9 BN có bất thường NST 17 thì có 3 BN có kèm bất thường NST 13, như vậy bất thường NST 17 đơn độc gặp trong 6 trường hợp, chiếm tỉ lệ 30% (Bảng 1). Ngồi ra, có 1 BN có 4 tín hiệu NST 17 (BN 4) và đây có thể là do đa bội NST. Trong 11 BN có bất thường NST 13 thì có đến 9 BN (9/11 = 81,8%) là mất đoạn dài từ băng q14 đến băng Nghiên cứu Y học q34 (Bảng 1), trường hợp này có thể được xem như là monosomy13 vì tồn bộ chất liệu di truyền của nhánh dài NST13 đã bị mất. Hình 2: Bất thường NST 13 có 2 dạng là del(13q14) (A) và del(13)(q14q34)(B). Bất thường NST 17 cũng có 2 dạng thường gặp là del(17p13) (C) và monosomy 17(D). Bảng 1: Kết quả FISH của bệnh nhân đa u tủy STT Giới tính Năm sinh Nữ 1964 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nữ 1961 1949 1968 1940 1951 1965 1941 1937 1949 1966 1953 1967 1954 1960 1968 1958 1944 1959 1938 Kết FISH 13q14 17p13 del(17p13) del(13)(q14q34) Monosomy 17 del(13)(q14q34) Bình thường Bình thường del(17pl3) del(13)(q14q34) tín hiệu NST 17 Bình thường del(17p13) Bình thường del(17p13) del(13q14) Monosomy 17 Bình thường del(17p13) Bình thường Bình thường del(13q14) Bình thường Bình thường Bình thường del(13)(q14q34) Bình thường del(13)(q14q34) Bình thường del(13)(q14q34) Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Monosomy 17 del(13)(q14q34) Bình thường del(13)(q14q34) Bình thường Bình thường Monosomy 17 del(13)(q14q34) Bình thường BÀN LUẬN Một số nghiên cứu trước đây cho thấy các BN đa u tủy có mất đoạn gen p53 trên NST 17 và chuyển vị của NST 14q32 với NST 4, 16, 20 177 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Nghiên cứu Y học thuộc nhóm tiên lượng xấu (1,4,5). Nhóm BN này có thời gian sống toàn bộ ngắn hơn hẳn so với nhóm BN mang các bất thường thuộc nhóm tiên lượng tốt (1). Kết quả khảo sát của chúng tơi cho thấy có 6 trong 20 BN (30%) có bất thường NST 17 đơn độc, tỷ lệ này cao hơn các nước khác (4,5) có thể do cỡ mẫu trong nghiên cứu còn nhỏ. Tuy nhiên, nhóm BN này nên được điều trị tích cực và tiến hành ghép tế bào gốc tạo máu. Trong 20 BN, có 3 BN (15%) khơng phát hiện bất thường NST 13 và 17 và các BN này nên được khảo sát các bất thường NST khác như t(4;14), t(6;14), t(11;14), t(14;16) và t(14;20) hoặc bất thường về số lượng NST bằng kỹ thuật FISH và NST đồ để phân nhóm tiên lượng. Bệnh nhân có bất thường NST 13 thuộc nhóm tiên lượng chuẩn chiếm 55% trường hợp, kết quả này cũng tương đồng với các nghiên cứu khác (3,6). Trong 11 BN, có 3 BN đồng thời có bất thường của NST 13 và NST 17 nên việc phân nhóm tiên lượng sẽ khó khăn hơn. Tuy nhiên, Kumar và cộng sự đã báo cáo về tình trạng có nhiều kiểu bất thường NST trên một bệnh nhân cho thấy bất thường NST trong đa u tủy phức tạp và khơng đồng nhất (4). Hiện nay, có nhiều kiểu bất thường NST được phát hiện trong đa u tủy nên cần nhiều loại đoạn dò FISH và phối hợp với kỹ thuật NST đồ để giúp nhận diện đầy đủ hơn các bất thường giúp phân nhóm tiên lượng chính xác hơn. KẾT LUẬN BVTMHH đã xây dựng thành cơng kỹ thuật FISH sử dụng các đoạn dò đặc hiệu giúp xác 178 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 định các bất thường NST 13q và 17p một cách nhanh chóng, chính xác, trên một lượng mẫu nhỏ giúp ích cho việc phân nhóm tiên lượng và lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân đa u tủy. TÀI LIỆU THAM KHẢO Drach J, Ackermann J, Fritz E, et al. (1998). Presence of a p53 gene deletion in patients with multiple myeloma predicts for short survival after conventional‐dose chemotherapy. Blood, 92: 802 – 809. Klein U, Jauch A, Hielscher T, et al. (2011). Chromosomal aberrations +1q21 and del(17p13) predict survival in patients with recurrent multiple myeloma treated with lenalidomide and dexamethasone. Cancer, 117: 2136 – 2144. Kröger N, Schilling G, Einsele H, et al. (2004). Deletion of chromosome band 13q14 as detected by fluorescence in situ hybridization is a prognostic factor in patients with multiple myeloma who are receiving allogeneic dose‐reduced stem cell transplantation. Blood, 103: 4056 – 4061. Kumar S, Fonseca R, Ketterling RP, et al. (2012). Trisomies in multiple myeloma: impact on survival in patients with high‐ risk cytogenetics. Blood, 119: 2100 – 2105. Neben K, Jauch A, Bertsch U, et al. (2010). Combining information regarding chromosomal aberrations t(4;14) and del(17p13) with the International Staging System classification allows stratification of myeloma patients undergoing autologous stem cell transplantation. Haematologica, 95: 1150 – 1157. Zojer N, Königsberg R, Ackermann J, et al. (2000). Deletion of 13q14 remains an independent adverse prognostic variable in multiple myeloma despite its frequent detection by interphase fluorescence in situ hybridization. Blood, 95: 1925 – 1930. Ngày nhận bài báo: Ngày 30 tháng 7 năm 2013 Ngày phản biện: ngày 28 tháng 9 năm 2013 Ngày bài báo được đăng: 22 tháng 10 năm 2013 ... phát huỳnh quang (FISH) bước đ u khảo sát 2 dạng bất thường NST thường gặp trong 2 nhóm tiên lượng là bất thường 13q và 17p trên BN đa u tủy tại Bệnh viện Truyền m u Huyết ... nhóm tiên lượng chuẩn còn đang lui bệnh tốt (4). Trong 4 ki u bất thường thuộc nhóm tiên lượng x u thì 17p13 là thường gặp nhất (13%). Vì vậy, trong nghiên c u này chúng tơi ứng dụng kỹ thuật lai ... thấy bất thường NST trong đa u tủy phức tạp và khơng đồng nhất (4). Hiện nay, có nhi u ki u bất thường NST được phát hiện trong đa u tủy nên cần nhi u loại đoạn dò FISH và phối hợp với kỹ thuật NST