Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm đánh giá TMEM16E có chức năng là kênh CaCC như protein TMEM16A trong cùng nhóm hay không. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 THREONINE 612 QUYẾT ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM CỦA CHUỖI NUCLEOTID GIẢ ĐỊNH HÌNH THÀNH KÊNH ION CỦA TMEM16E /GDD1/Ano5 Tạ Tố Trân*, Kei Tobiume**, Chikara Hirono***, Nobuyuki Kamata** TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định TMEM16E có chức kênh CaCC protein TMEM16A nhóm hay khơng Phương pháp nghiên cứu: so sánh dòng điện đo từ tế bào mang TMEM16E-GFP với tế bào mang TMEM16A-GFP ngoại sinh tế bào mang chimera nhân tạo Kết quả: TMEM16E khơng có chức CaCC giống TMEM16A chuỗi nucleotide cho hình thành kênh ion TMEM16E cho phép ion Chloride qua tạo thêm đột biến điểm Thr612Cys Kết luận: Threonine612 định đặc điểm chuỗi nucleotid giả định hình thành kênh ion TMEM16E /GDD1/Ano5 ABSTRACT THREONINE612 DEFINES THE PUTATVE CHANNEL PORE-FORMING DOMAIN CHARACTER OF TMEM16E/GDD1/Ano5 Ta To Tran, Kei Tobiume, Chikara Hirono, Nobuyuki Kamata * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 164 - 170 Objective: to determine whether TMEM16E functions as CaCC, similar to TMEM16A Methods: comparing the currents consulted from HEK293T cells expressing exogenous TMEM16E-GFP to cells expressing exogenous TMEM16A-GFP or constructed chimeras Results: TMEM16E is not equivalent to TMEM16A in functioning as CaCC and the putative pore-forming domain of TMEM16E could transit ion chloride only with additional Thr612Cys mutation Conclusion: The putative channel pore-forming domain of TMEM16E determines its specific character through Threonine 612 Key words: GDD, TMEM16, CaCC GIỚI THIỆU Loạn sản xương hàm-thân xương dài (Gnathodiaphyseal dysplasia, GDD) bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường, đặc trưng loạn sản xương hàm, xương dài cong dễ gãy, dày lên vỏ thân xương dài(1,10) Từ năm 2003, nhóm nghiên cứu tìm ngun nhân gây bệnh GDD nằm vị trí nhiễm sắc thể 11p14.3-15.1 xác định điểm đột biến gây bệnh(11,12) Nhóm đặt tên gen GDD1 GDD1 có tên TMEM16E/Ano5(4), thuộc nhóm protein TMEM16 có tám đoạn nucleotide xuyên màng Đột biến gây bệnh GDD TMEM16E (TMEM16Egdd) giải mã Cystein356Argrinin (phát bệnh nhân người Nhật) Cystein356Glycin (phát bệnh nhân * Bộ môn PTM- Khoa RHM- Đại học Y Dược TP HCM ** Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Graduate School of Biomedical and Health Sciences, Hiroshima University, Hiroshima, Japan *** Department of Physiology and Oral Physiology, Graduate School of Biomedical and Health Sciences, Hiroshima University, Hiroshima, Japan Tác giả liên lạc: TS Tạ Tố Trân ĐT: 0913632526 Email: totrandent@yahoo.com 164 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 người Mỹ gốc Phi) Nghiên cứu hóa mô miễn dịch mô chuột phát protein TMEM16E mô mô xương(6) Tầm quan trọng mặt sinh lý TMEM16E mô rõ nét TMEM16E chức không tồn nguyên gây bệnh loạn dưỡng (LGMD2L) bệnh Miyoshi (MMD3)(2) Một số đột biến lặn (gây kết thúc mã hóa sớm) tìm thấy bệnh bệnh nhân có gen dị hợp tử đột biến Mặc dù đột biến gen TMEM16E gây bệnh mô chuyên biệt rõ chức protein TMEM16E chưa xác định Trong nhóm, TMEM16A protein xác định kênh chloride-hoạt hóa calci(3,9,13) (Calci activated Chloride Channel, CaCC), sau đến TMEM16B(8) TMEM16F(7) Trong nghiên cứu này, khảo sát khả TMEM16E kênh chloride-hoạt hóa calci, giống TMEM16A hay khơng Do TMEM16E, biểu tế bào HEK293T, không nằm màng tế bào nên đưa đoạn nucleotide nucleotide xuyên màng thứ năm thứ sáu TMEM16E lên màng tế bào phương pháp tạo chimera (A5E6A) với TMEM16A Tuy nhiên, chimera AEA không tạo dòng điện trừ tạo thêm đột biến Threonin612Cystein Kết gợi ý Threonin612 định đặc điểm chuỗi nucleotide giả định hình thành kênh ion TMEM16E /GDD1/Ano5 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nuôi cấy tế bào (cell culture): nuôi cấy tế bào HEK293FT (Invitrogen) tế bào HEK293T (ngân hàng RIKEN) DMEM (Sigma) 10% FBS 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen) Sự tạo thành plasmid (plasmid construction): ghép TMEM16E-GFP TMEM16A-GFP vào vector pCR8/GW/TOPO (Invitrogen) tạo thành plasmid Tạo chimera cách: tạo enzym SnaBI NheI vị trí nucleotide xuyên màng thứ năm thứ sáu TMEM16E-GFP Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Nghiên cứu Y học TMEM16A-GFP, cắt nucleotide plasmid enzym tạo enzym XbaI vector Thu thập đoạn polypeptide ghép chéo chúng với “enzym ligestion high” (Takara) Xác minh chuỗi nucleotide máy phân tích sơ đồ gen 3130xl Genetic analyzer (ABI) Sau đó, chuyển vector khung pCR8/GW sang khung plenti6.2-DEST Gateway (Invitrogen) LR Clonase II enzym Mix (Invitrogen) Tạo dòng tế bào bền vững (stable cell establishing): đưa pLenti6.2 vector vào tế bào HEK293FT với plasmid Virapower Lentiviral Packaging Mix (Invitrogen) dùng tác nhân FuGENE (Roche) để tạo virus chứa chimera 48 sau, xuất dung dịch bề mặt chứa virus lây nhiễm vào tế bào HEK293T sử dụng tác nhân polybrene (Sigma) Sử dụng Blasticidin (Invitrogen) để loại tế bào không phơi nhiễm Sau tuần, tế bào sống tế bào chứa vector mang gen ngoại sinh chimera Chụp huỳnh quang (fluorescent imaging): gen gốc hay chimera mang đoạn gen GFP phát huỳnh quang Nuôi cấy tế bào đĩa 24 giếng, đáy kính (IWAKI) quan sát kính hiển vi laser cắt lớp FV10i (OLYPUS) kính hiển vi huỳnh quang (KEYENCE) độ phóng đại 60X Đo dòng điện tế bào phương pháp toàn vẹn tế bào (Patch-clamp recordings): nuôi cấy tế bào HEK293T mang gen nghiên cứu kính nhỏ cách rời rạc hai ngày trước đo dòng điện để tế bào bám vào mặt kính vừa đủ Sau di chuyển kính lên kính hiển vi đo cơng cụ chun biệt đó, pipet vừa tiếp xúc phá vỡ phần màng tế bào kết nối với màng tế bào thành thể thống Dung dịch bên tế bào (120mM NMDG-Cl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, 120mM Mannit 10mM NMDG-HEPES (pH 7,4)), dung dịch bên tế bào hay dung dịch pipet “có diện Ca2+” (120mM NMDG-Cl, 3,5mM CaCl2, 5mM EGTA-NMDG, 50mM 165 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Mannit, 2mM ATP-Hemi muối Mg, 10mM NMDG-HEPES (pH 7,4)) “không diện Ca2+” (120mM NMDG-Cl, 10mM NMDG-EGTA, 50mM Mannit, 2mM ATP-Hemi muối Mg, 10mM NMDG-HEPES (pH 7,4)) Điện màng giữ 0mV Sau kết nối pipet với màng tế bào thành thể thống nhất, đo dòng điện +100mV -100mV cách thay đổi điện màng tế bào đến điện cần đo giữ giây, lần đo cách 10 giây Những chi tiết khác thực giống nghiên cứu trước(5,8) Phân tích thống kê: sử dụng test Tukey để so sánh trung bình nhóm KẾT QUẢ TMEM16E ngoại sinh tế bào HEK293T khơng có hoạt tính kênh chloride-hoạt hóa calci Do TMEM16A protein nhóm TMEM16 phát có chức kênh chloride-hoạt hóa calci, chúng tơi đánh giá xem TMEM16E có chức TMEM16A hay không Khi đo điện màng tế bào phương pháp toàn vẹn tế bào, tế bào HEK293T mang TMEM16A-GFP tạo dòng điện rõ ràng theo hướng từ ngồi màng (hình 1A) cho hình ảnh đặc trưng kênh chloride-hoạt hóa calci, phụ thuộc điện phụ thuộc calci (hình 1B) Ngược lại, tế bào mang TMEM16E-GFP khơng cho dòng điện có khơng có calci diện dung dịch pipet, tương tự tế bào mang GFP (hình 1) TMEM16E tồn bên tế bào chimera với TMEM16A di chuyển lên màng tế bào Hình ảnh chụp kính hiển vi cho thấy TMEM16E-GFP tồn tại bên tế bào (hình 2A) Do phương pháp đo dòng điện sử dụng nghiên cứu đo kênh chloride nằm màng tế bào nên vị trí TMEM16E ảnh hưởng đến kết 166 Tiếp theo, cố di chuyển TMEM16E lên màng tế bào cách trao đổi đoạn polypeptide gen với TMEM16A Chúng thành công việc di chuyển đoạn polypeptide, cho kênh, nơi ion vào, TMEM16E lên màng tế bào, chimera A5E6A-GFP (hình 2A) Đoạn polypeptide giả định hình thành kênh ion TMEM16E khơng thay đoạn polypeptide tương ứng TMEM16A hoạt động kênh chloride-hoạt hóa calci A5E6A -GFP biểu màng tế bào cho phép đánh giá liệu đoạn polypeptide giả định hình thành kênh TMEM16E có khả kênh chloride không Chúng so sánh đặc điểm điện-sinh lý tế bào mang A5E6A -GFP với tế bào mang TMEM16A Tế bào mang A5E6A -GFP cho dòng điện nhỏ đo có khơng có diện Ca2+ Tuy nhiên, dòng điện ±100mV khác biệt khơng có ý nghĩa so với tế bào mang GFP, với tế bào mang TMEM16A đo khơng có Ca2+ (hình 6B) Kết cho thấy đoạn polypeptide giả định hình thành kênh TMEM16E khơng có khả kênh chloride-hoạt hóa calci A5E6A cho dòng điện kênh chloride-hoạt hóa calci tạo đột biến Thr612Cys đoạn polypeptide giả định hình thành kênh Khi so sánh amino acid đoạn gen cho hình thành kênh ion TMEM16, TMEM16E có acid amin Thr612 thay Cys kênh chloride-hoạt hóa calci khác (TMEM16A, TMEM16B) (hình 7A) Do đó, chúng tơi thử thực đột biến Thr612Cys A5E6A-GFP xem có phải diện ba Cys đoạn gen hình thành kênh ion Protein A5E6CysA-GFP tạo thành biểu màng tế bào giống A5E6A -GFP (hình 7A) Khi đo dòng điện, tế bào mang A5E6CysA-GFP cho dòng điện có dạng kênh chloride-hoạt hóa calci, giống tế bào Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 mang TMEM16A-GFP (hình 7C E) Để đánh giá vai trò Thr612 việc hình thành kênh ion, lần thực đột biến Cys635Thr TMEM16A-GFP (giãn đồ hình 7A) Tuy nhiên, TMEM16AThr-GFP biểu màng tế bào giống TMEM16A-GFP (hình 7A) khơng làm thay đổi đặc tính kênh chloride-hoạt hóa calci (hình 7D) Điều Nghiên cứu Y học ngụ ý polypeptide xung quanh Thr612 đoạn polypeptide giả định hình thành kênh TMEM16E định khả khơng kênh chloride-hoạt hóa calci Những kết chất TMEM16E có chức khác so với TMEM16A cấu trúc chuyên biệt protein làm cho TMEM16E khác biệt so với protein khác nhóm Chú giải hình Hình 1: Khơng ghi nhận Kênh chloride-hoạt hóa calci tế bào HEK293T mang TMEM16E ngoại sinh A, Biểu đồ đại diện dòng điện theo thời gian đo tế bào mang TMEM16A-GFP, TMEM16E-GFP GFP, tương ứng, đo có diện Ca2+ dung dịch pipet Điện màng thay đổi từ 0mV đến ±100mV biểu đồ đính kèm B, Dòng điện đo từ tế bào tương ứng hình A với diện (bốn hình trên) khơng có diện Ca2+ (bốn hình dưới) dung dịch pipet Dòng điện ghi nhận từ phút sau pipet kết nối với màng tế bào thành thể thống nhất, điện màng thay đổi từ điện chuẩn (0 mV) đến -100 mV +100 mV biểu đồ đính kèm Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 167 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Hình 2: Vị trí bên tế bào ngun nhân TMEM16E khơng kênh ion A, Hình chụp kính hiển vi huỳnh quang tế bào mang TMEM16E-GFP, TMEM16A-GFP A5E6A-GFP B, Dòng điện tế bào mang TMEM16A-GFP, A5E6A-GFP GFP ±100mV có (+) khơng có (-) diện Ca2+ (trung bình ± SE, ∗∗p