Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá khả năng chịu đựng dịch dạ dày và dịch mật của một số dạng bào chế probiotic. Đối tượng và phương pháp: vi khuẩn (VK) probiotic thử nghiệm gồm Lactobacillus acidophilus dạng bột đông khô, cốm đông khô, bột đông khô có đóng gói nitơ, vi nang, bao kép.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 ĐÁNH GIÁ HẢ NĂNG CHỊU ĐỰNG DỊCH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẠNG BÀO CHẾ PROBIOTIC Nguyễn Tú Anh*; Nguyễn Nam Duy* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá khả chịu đựng dịch dày dịch mật số dạng bào chế probiotic Đối tượng phương pháp: vi khuẩn (VK) probiotic thử nghiệm gồm Lactobacillus acidophilus dạng bột đơng khơ, cốm đơng khơ, bột đơng khơ có đóng gói nitơ, vi nang, bao kép; Enterococcus faecalis vi nang; Enterococcus faecium bao kép; Bacillus hỗn dịch Xác định số lượng VK sau tiếp xúc với dịch dày dịch mật sau khoảng thời gian định Xác định số lượng probiotic sau thử nghiệm phương pháp đếm sống trải đĩa thạch Kết kết luận: lượng VK Lactobacillus acidophilus dạng bột giảm đáng kể sau tiếp xúc với dịch dày (giảm 85% so với ban đầu) dịch mật (tiếp tục giảm 88% so với lượng VK sau tiếp xúc dịch dày) Trong đó, dạng hạt dạng đóng gói có nitơ, L acidophilus có độ bền tốt dịch sinh học (lần lượt giảm 25% 29%) VK bao vi nang bao kép bảo vệ tốt tiếp xúc dịch dày, lại không hiệu dịch mật (trong dịch dày, Enterococcus giảm ~ 30%, L acidophilus giảm > 60%) Bacillus cho thấy khả chịu đựng tốt, giảm ~ 20% dịch dày gần không thay đổi dịch mật * Từ khóa: Probiotic; Dạng bột; Đóng gói có nitơ; Vi nang; Bao kép; Dịch sinh học; Vi khuẩn sống sót Evaluation of Endurance to Biological Fluids of some Probiotic’s Products Summary Objectives: To evaluate endurance to gastric juice and bile fluid of some probiotic’s products Subjects and methods: Some probiotic’s preparations were tested including Lactobacillus acidophilus in the freeze-drying powder, granular, nitrogen-packed, micro-capsuled and duocoated forms; Enterococcus faecalis in micro-capsuled form; Enterococcus faecium in duocoated form; Bacillus in suspension After certain intervals, the number of survival bacteria is enumerated by plating method Results and conclusion: Population of Lactobacillus acidophilus in the freeze-drying powder form decreases significantly after hours exposed to gastric juice (decrease 85%) and bile (decrease 88% of survival bacteria after hours in gastric juice) Meanwhile, L acidophilus in the granular and nitrogen-packed preparation has better endurance to biological fluids (decrease 25% and 29%) Bacteria in micro-capsuled and duo-coated are well-protected when exposing to gastric juice but not to bile (in gastric fluid, Enterococcus decreases ~ 30%, L acidophilus decreases > 60%) Bacillus shows a well tolerance, decrease ~ 20% in gastric fluid and almost not change in bile * Key words: Probiotic; Powder; Nitrogen-packed; Granular; Biological fluid; Survival bacteria * Đại học Y - Dược TP Hồ Chí Minh Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tú Anh (nguyentuanhvn@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/01/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 02/03/2016 Ngày báo đăng: 10/03/2016 35 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, probiotic dùng nhiều dạng dược phẩm, đặc biệt chế phẩm đường uống Vì vậy, yêu cầu bắt buộc đặt VK probiotic phải có khả sống sót qua dày ruột, đến nơi tác động bám dính lên thành ruột để phát huy tác dụng sinh học [3] Hai điều kiện môi trường khắc nghiệt thể mà VK phải vượt qua dịch dày dịch mật [4, 5] Ngoài yếu tố pH thấp, dịch dày chứa nhiều enzym tiêu hóa gây tổn hại vi sinh vật Trong đó, dịch mật với nồng độ muối mật cao, khả ức chế phát triển vi sinh vật nhiều [6] Thực tế cho thấy dạng nuôi cấy ban đầu, số lượng probiotic bị giảm đáng kể tiếp xúc với dịch dày dịch mật Do đó, biện pháp hiệu để khắc phục tượng bảo vệ probiotic dạng bào chế khác dạng bột, cốm, đóng gói nitơ, vi nang, bao kép, hỗn dịch… [1, 2, 7] Với mục đích đánh giá khả bảo vệ VK probiotic dạng bào chế khác qua hàng rào dày ruột hệ tiêu hóa, nghiên cứu nhằm: Đánh giá khả chịu đựng dịch sinh học số dạng bào chế probiotic Dựa kết thu được, đề xuất dạng bào chế phù hợp với số vi sinh vật probiotic VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU * VK probiotic thử nghiệm: Lactobacillus acidophilus dạng bột đông khô, cốm đông khô, bột đơng khơ có đóng gói nitơ, vi nang, bao kép; Enterococcus 36 faecalis vi nang; Enterococcus faecium bao kép; Bacillus hỗn dịch * Môi trường đếm VK: Đếm Lactobacillus môi trường MRS (Merck), Bacillus TSA (Merck), Enterococcus natri azide - TTC * Xác định số lượng VK sống ban đầu: Cân 0,5 g chế phẩm (dạng hỗn dịch, hút 0,5 ml chế phẩm) Bổ sung nước muối 0,85% vừa đủ ml, tiếp tục pha loãng thành dãy nồng độ cấp số 10 đến nồng độ 10-5 Tại độ pha lỗng, hút 100 µl dịch trải đĩa petri chứa mơi trường thích hợp Mỗi độ pha loãng lặp lại lần * Dịch sinh học: Chuẩn bị môi trường dịch vị nhân tạo gồm pepsin (HiMedia) 3,2 g/l, NaCl g/l, HCl vừa đủ điều chỉnh pH dịch mật nhân tạo 0,5% pH 6,8 gồm KH2PO4 6,81 g/l, NaOH 896 mg/l, muối mật (HiMedia) * Xác định số lượng VK sau tiếp xúc với dịch dày: Cân 0,5 g chế phẩm cho vào ml dịch vị, lắc với tốc độ 80 vòng/phút Sau thời gian giờ, giờ, hút 100 µl dịch pha loãng thành dãy nồng độ cấp số 10 đến độ pha loãng 10-5 Tại độ pha loãng, hút 100 µl dịch để trải đĩa petri chứa mơi trường thích hợp Mỗi độ pha lỗng lặp lại lần [6, 8, 9] * Xác định số lượng VK sau tiếp xúc với dịch mật: Sau tiếp xúc với dịch vị, ly tâm VK 10 phút với tốc độ 9.600 vòng/phút Loại bỏ phần dịch nổi, thêm dịch mật vừa đủ ml, lắc với tốc độ 50 vòng/phút Sau thời gian giờ, giờ, xác định TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 số lượng VK tương tự thử nghiệm với dịch dày [6, 8, 9] Chọn đĩa petri có 30 - 300 khóm, số đơn vị tạo khuẩn lạc CFU (Colony Forming Unit)/1 ml dịch xác định theo công thức: N C C: tổng số khóm đếm tất đĩa nồng độ pha loãng n: số đĩa đếm số khóm nồng độ pha lỗng d: hệ số pha lỗng V: thể tích dịch trải (ml) n.d V N: số đơn vị tạo khuẩn lạc/1 ml dịch (CFU/ml) Xử lý kết phân tích ANOVA, đánh giá khác biệt dân số VK thử nghiệm ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ă g chịu đự g dịch si h học g bào chế đô g hô Bảng 1: Dân số L acidophilus bột đông khô sau thời gian tiếp xúc với dịch sinh học Dân số VK (CFU/ml) Thời gian Lần Lần 6,8.10 Lần 6,5.10 Trung bình 6,6.10 Ban đầu (0 giờ) 6,5.10 Tiếp xúc dịch dày Sau Sau Sau 9,0.10 3,7.10 7,9.10 9,7.10 3,9.10 8,4.10 9,8.10 3,8.10 8,3.10 9,5.10 3,8.10 8,2.10 Tiếp xúc với dịch mật Sau Sau Sau 2,4.10 1,5.10 9,0.10 2.5.10 1,6.10 9,8.10 2,5.10 1,5.10 9,7.10 2,5.10 1,5.10 9,5.10 Bảng 2: Dân số L acidophilus dạng đóng gói nitơ sau thời gian tiếp xúc với dịch sinh học Thời gia Dâ số V Lần Lần 1,7.10 (CFU/ml) Lần 1,4.10 Trung bình 1,5.10 Ban đầu (0 giờ) 1,4.10 Tiếp xúc dịch dày Sau Sau Sau 4,6.10 3,7.10 3,1.10 5,1.10 3,5.10 3,4.10 5,0.10 3,9.10 3,4.10 4,9.10 3,7.10 3,3.10 Tiếp xúc với dịch mật Sau Sau Sau 2,2.10 1,8.10 1,3.10 2,3.10 1,8.10 1,6.10 2,0.10 1,7.10 1,8.10 2,2.10 1,8.10 1,6.10 6 37 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Bảng 3: Dân số L acidophilus dạng cốm sau thời gian tiếp xúc với dịch sinh học Dâ số V (CFU/ml) Thời gia Lần Ban đầu (0 giờ) Lần 5,8.10 4,4.10 2,8.10 4,0.10 3,1.10 2,4.10 5,2.10 Lần 6,1.10 4,5.10 3,1.10 4,7.10 3,4.10 2,4.10 Trung bình 5,7.10 6 4,3.10 3,1.10 4,5.10 3,3.10 2,4.10 3,2.10 Tiếp xúc dịch dày Sau 4,0.10 Sau 3,4.10 Sau 4,8.10 6 Tiếp xúc với dịch mật Sau 3,4.10 Sau 2,3.10 Sau 3,2.10 3,3.10 3,1.10 6 So với ban đầu, L acidophilus Trong thử nghiệm với dịch mật, sau dạng bột đơng khơ bị giảm nhanh chóng tiếp xúc, bột L acidophilus bị giảm sau tiếp xúc với dịch dày 88% so với lượng VK sau tiếp xúc giờ, tỷ lệ chết cao dịch dày Trong đó, tỷ lệ L acidophilus dạng bột (85%) thấp dạng bột đóng gói nitơ 51% thấp dạng cốm (25%) Sau giờ, dân số dạng cốm với 29% (hình 1, bảng 1, L acidophilus dạng bột giảm từ 6,6.107 2, 3) Hiện tượng VK dạng CFU/ml xuống 8,2.105 CFU/ml (bảng 1), dạng bột khơ đóng gói có nitơ giảm từ 1,5.107 CFU/ml xuống 3,3.106 CFU/ml (bảng 2) Trong đó, lượng VK dạng cốm giảm từ 5,7.10 CFU/ml xuống 4,5.10 CFU/ml (bảng 3) Theo phân tích ANOVA, tất so sánh đông khô chưa bảo vệ suốt trình sản xuất bảo quản VK phải tiếp xúc trực tiếp với số yếu tố bất lợi nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm hay lực học nên tế bào VK bị tổn thương Vì vậy, thay đổi mơi trường sống đột ngột - mơi trường dịch dày, khả thích ứng với mơi trường sống có F > Fcrit, nghĩa khác biệt có ý VK bị giảm đáng kể Bên cạnh đó, nghĩa thống kê dân số VK kỹ thuật đơng khơ có ảnh hưởng nhiều thử nghiệm Sau giờ, cốm L acidophilus có đến sản phẩm đơng khơ q trình tăng sinh nên đến cuối thứ ba, so với làm đông VK nhanh hay chậm, chọn VK lượng ban đầu lượng VK giảm 21% giai đoạn phát triển để tiến hành đông (bảng 3, hình 1) khơ đóng vai trò quan trọng 38 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 BĐ 1h 2h 3h 1h’ 2h’ 3h’ BĐ: ban đầu giờ, giờ, giờ: thời gian tiếp xúc dịch dày giờ’, giờ’, giờ’: thời gian tiếp xúc dịch mật Hình 1: Dân số L acidophilus dạng bột đông khô sau thời gian tiếp xúc với dịch sinh học ă g chịu đự g dịch si h học g vi a g bao ép Bảng 4: Dân số E faecalis L acidophilus dạng vi nang sau thời gian tiếp xúc với dịch sinh học Dân số VK (CFU/ml) Thời gian L.acidophilus Lần Ban đầu Lần 5,0.10 2,4.10 1,7.10 4,8.10 Lần 5,1.10 2,4.10 1,9.10 E faecalis Trung bình 5,0.10 2,4.10 1,8.10 Lần 3,8.10 3,0.10 3,0.10 Lần 4,2.10 3,1.10 2,8.10 Lần 4,0.10 3,1.10 2,8.10 Trung bình 4,0.10 7 3,1.10 2,8.10 2,7.10 2,1.10 1,6.10 1,1.10 DD 2,3.10 1,8.10 1,6.10 8,9.10 1,8.10 6 1,9.10 8,8.10 1,8.10 8,7.10 2,7.10 1,9.10 2,8.10 2,6.10 2,2.10 2,2.10 7 Mật 8,4.10 3,2.10 1,8.10 3,2.10 1,6.10 5 3,3.10 1,8.10 3,2.10 1,8.10 1,5.10 1,1.10 1,7.10 1,6.10 1,2.10 9,9.10 7 DD: tiếp xúc với dịch dày Mật: tiếp xúc với dịch mật 39 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Bảng 5: Dân số E faecium L acidophilus dạng bao kép sau thời gian tiếp xúc với dịch sinh học Dân số VK (CFU/ml) Thời gian L.acidophilus Lần Lần Lần 2,6.10 9,9.10 9,3.10 8,2.10 6 5,0.10 3,8.10 1,9.10 Ban đầu 2,5.10 DD giờ Mật giờ 4,9.10 3,9.10 2,0.10 E faecium Trung bình 2,4.10 2,5.10 1,2.10 8,8.10 8,4.10 1,2.10 8,9.10 7,9.10 5,0.10 4,0.10 1,9.10 5,0.10 3,9.10 1,9.10 Lần 1,2.10 1,1.10 9,0.10 8,2.10 7,8.10 7,9.10 7,0.10 Lần 1,3.10 9,5.10 8,6.10 8,3.10 7 8,3.10 8,0.10 7,1.10 Lần 1,2.10 9,6.10 8,6.10 8,3.10 7 8,2.10 8,2.10 7,1.10 1,2.10 1,0.10 8,8.10 8,3.10 9,7.10 8,7.10 8,3.10 8,1.10 8,0.10 7,1.10 DD: tiếp xúc dịch dày Mật: tiếp xúc dịch mật 8.5 7.5 log(CFU/ml) 6.5 5.5 thời gian BĐ 3h' 1h 2h 3h 1h' 2h' L acidophilus (Vi nang) E faecalis (Vi nang) L acidophilus (Bao kép) E faecium (Bao kép) BĐ: ban đầu giờ, giờ, giờ: thời gian tiếp xúc dịch dày giờ’, giờ’, giờ’: thời gian tiếp xúc dịch mật Hình 2: Dân số L acidophillus Enterococcus sau thời gian tiếp xúc với dịch sinh học 40 Trung bình 7 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 So với dạng bột đông khô, dân số VK hai dạng vi nang bao kép ổn định sau thời gian tiếp xúc với dịch dày Sau giờ, vi nang, dân số E faecalis giảm 32% so với ban đầu E faecium giảm 31% Trong đó, L acidophilus vi nang giảm 64% so với ban đầu L acidophilus bao kép giảm 67% (bảng 4, hình 2) (phân tích ANOVA cho F > Fcrit) Tuy tỷ lệ L acidophilus giảm dạng vi nang bao kép sau tiếp xúc với dịch dày tương đối cao, chủ yếu xảy đầu Có thể nhận thấy, dạng vi nang bao kép hạn chế đáng kể tác động dịch dày lên tế bào VK so với dạng đơng khơ Tỷ lệ sống sót L acidophilus viên bao tăng ~ 30% so với dạng đông khô Đáng ý, Enterococcus bền vững mơi trường axít dày, đặc điểm bật so với Lactobacillus Mặc dù vậy, tiếp xúc với dịch mật, lớp bao tan rã để phóng thích VK chúng chịu tác động trực tiếp dịch sinh học, nên tỷ lệ VK sống sót giảm Dân số VK dạng bao kép vi nang ổn định tiếp xúc với dịch dày Tuy nhiên, gặp điều kiện môi trường dịch mật, dạng bao kép có tác dụng bảo vệ VK tốt so với vi nang Lượng VK E faecium L acidophilus bao kép sau tiếp xúc với dịch mật giảm 14% 76% so với lượng VK sau tiếp xúc dịch dày (bảng 5) Trong đó, tỷ lệ cao E faecalis L acidophilus vi nang, 59% 90% (F > Fcrit) (bảng 4, hình 2) Với kết thực nghiệm thu nhận định dạng bào chế vi nang bao kép công cụ hiệu để bảo vệ VK trước điều kiện khắc nghiệt môi trường dịch dày Lớp bao thứ hai kỹ thuật bao vi nang bao kép tan rã ruột, để VK phóng thích nơi tác động Đây nguyên nhân làm dân số VK giảm nhanh so với thời gian tiếp xúc dịch dày ă g chịu đự g dịch si h học Bacillus g hỗ dịch Bảng 6: Dân số Bacillus sau thời gian tiếp xúc với dịch sinh học Thời gia Ban đầu (0 giờ) Dâ số V Lần Lần 5,1.10 4,6.10 3,6.10 5,1.10 (CFU/ml) Lần 4,8.10 5,0.10 3,8.10 Trung bình 5,0.10 7 4,8.10 3,8.10 3,0.10 3,0.10 3,0.10 3,2.10 Tiếp xúc dịch dày Sau 4,7.10 Sau 4,0.10 Sau 3,0.10 3,1.10 2,9.10 3,0.10 2,9.10 7 Tiếp xúc với dịch mật Sau 3,0.10 3,1.10 3,4.10 Sau 3,0.10 Sau 3,0.10 3,1.10 3,2.10 7 41 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Bào tử Bacillus sau đầu tiếp xúc với dịch dày giảm 4% Tuy nhiên, sau - giờ, tỷ lệ 20,8% (so với lượng VK sống sót sau giờ) 21% (so với lượng VK sống sót sau giờ) Kết chứng tỏ, bào tử Bacillus có độ ổn định tốt điều kiện tăng trưởng khắc nghiệt so với số VK probiotic khảo sát Nguyên nhân tượng dạng bào tử có khả chịu đựng thích nghi với hồn cảnh mơi trường khác Sau thời gian tiếp xúc với dịch dày, bào tử Bacillus tiếp tục cho tiếp xúc với dịch mật Kết cho thấy khơng có thay đổi dân số Bacillus dịch mật Thậm chí sau giờ, dân số VK tăng 6,7% so với dân số sau Phân tích ANOVA cho thấy F < Fcrit khơng có khác biệt số lượng VK ban đầu sau tiếp xúc dịch sinh học Như vậy, Bacillus bắt đầu thích nghi với điều kiện sống dịch mật ẾT LUẬN Mỗi dạng bào chế probiotic khác bột đông khô thử nghiệm tiếp xúc với dịch dày Dân số VK gần thay đổi sau khoảng thời gian giờ, Hiệu đặc biệt thể rõ E faecalis E faecium Tuy nhiên, khả bảo vệ VK hai dạng bào chế giảm mơi trường dịch mật Có thể lớp bao tan ruột tan rã để phóng thích VK nên khơng tác dụng bảo vệ VK môi trường dày Bào tử Bacillus dạng hỗn dịch thể khả chịu đựng tốt với dịch dày dịch mật Lượng VK sau tiếp xúc với dịch dày giảm, sau VK nhanh chóng thích nghi Khi chuyển sang tiếp xúc với dịch mật, dân số VK ổn định mà bắt đầu tăng sinh sau TÀI LIỆU THAM HẢO Lê Quang Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa Bào chế Sinh dược học, tập Nhà xuất Y học Hà Nội, 2010, tr.160-180 Lê Quang Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa Bào chế sinh dược học, tập Nhà xuất Giáo dục Hà Nội 2007, tr.336-346 có khả chịu đựng dịch sinh học Food and Agriculture Organization of the khác Bột đơng khơ có dân số VK United Nations, World Health Organisation L acidophilus giảm nhiều sau Health and Nutritional Properties of Probiotics tiếp xúc với dịch dày dịch mật in Food including Powder Milk with Live Lactic Trong đó, bột đơng khơ dạng cốm Acid Bacteria 2001, p.5 chứa L acidophilus thể khả Floch MH, Binder HJ, Filburn B, chịu đựng dịch dày dịch mật tốt Gershengoren W The effect of bile acids on Dạng bào chế vi nang bao kép có intestinal microflora The American Journal of khả bảo vệ VK cao so với dạng Clinical Nutrition 1972, 25 (12), pp.26-1418 42 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Pan X, Chen F, Wu T, Tang H, Zhao Z The acid, bile tolerance and antimicrobial property of Lactobacillus acidophilus NIT Food Control 2008, 20 (6), pp.135-140 Journal of Applied Microbiology 2007, 102 (3), pp.748-756 Conway PL, Gorbach SL, Goldin BR Survival of lactic acid bacteria in the Sahadeva R.P.K, Leon, SF, Chua KH, human stomach and adhesion to intestinal Tan CH, Chan HY, Tong EV, Wong SYW, cells Journal of Dairy Science 1987, 70 (1), Chan HK Survival of commercial probiotic pp.1-12 strains to pH and bile International Food Del Piano M, Ballar`e M, Anderloni A, Research Journal 2011,18 (4), pp.1515-1522 Carmagnola S, Montino F, Garello E et al Santivarangkna C, Wenning M, Foerst P In vitro sensitivity of probiotics to human bile & Kulozik U Damage of cell envelope of Digestive and Liver Disease 2006, 38 (1), Lactobacillus helveticus during vacuum drying pp.129-135 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TEST THỬ NHANH PHÁT HIỆN 43 ... nhằm: Đánh giá khả chịu đựng dịch sinh học số dạng bào chế probiotic Dựa kết thu được, đề xuất dạng bào chế phù hợp với số vi sinh vật probiotic VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU * VK probiotic. .. Hóa Bào chế Sinh dược học, tập Nhà xuất Y học Hà Nội, 2010, tr.160-180 Lê Quang Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa Bào chế sinh dược học, tập Nhà xuất Giáo dục Hà Nội 2007, tr.336-346 có khả chịu đựng dịch sinh. .. khắc phục tượng bảo vệ probiotic dạng bào chế khác dạng bột, cốm, đóng gói nitơ, vi nang, bao kép, hỗn dịch [1, 2, 7] Với mục đích đánh giá khả bảo vệ VK probiotic dạng bào chế khác qua hàng rào