Đang tải... (xem toàn văn)
Để phục vụ nhu cầu chẩn đoán và tư vấn di truyền tại địa phương, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm hai mục tiêu sau: Cải tiến và hoàn thiện việc làm tiêu bản NST tế bào máu ngoại vi; cải tiến và hoàn thiện quy trình nhuộm nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật nhuộm band G.
TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 15, 2003 NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHUỘM BAND G ĐỂ LẬP KARYOTYPE TRONG CHẨN ĐỐN CÁC BỆNH RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ Hà Thị Minh Thi Đồn Thị Dun Anh, Nguyễn Viết Nhân Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bất thường nhiễm sắc thể (NST) là một trong những ngun nhân quan trọng gây ra các bệnh lý di truyền, được gặp với tỷ lệ 1/150 trẻ sinh sống và trongû 50% trường hợp sẩy thai ngẫu nhiên ở ba tháng đầu thai kỳ [6] Lập karyotype là một xét nghiệm cần thiết cho tất cả các trường hợp trên lâm sàng nghi ngờ có bất thường số lượng hoặc cấu trúc NST [2]. Kết quả khơng những phục vụ việc chẩn đốn xác định mà còn có ý nghĩa quyết định trongû cơng tác tư vấn di truyền Từ năm 1970, người ta đã khơng cơng nhận những Karyotype được lập với kỹ thuật nhuộm Giemsa thường (khơng có band) vì với kỹ thuật nhuộm này khó nhận dạng chính xác từng NST cũng như khơng thể phát hiện được những bất thường cấu trúc kiểu đảo đoạn, nhân đơi đoạn, [6]. Từ đó đến nay, tất cả các karyotype thơng thường được lập tại các phòng xét nghiệm di truyền trên thế giới chỉ sử dụng các kỹ thuật nhuộm band, trong đó thơng dụng nhất là kỹ thuật nhuộm band G Để việc nhuộm band G đạt kết tối ưu làm cơ sở cho việc lập karyotype, cần phải hồn thiện hai bước quan trọng đó là (1) làm được tiêu bản với các cụm NST phân tán tốt, khơng bị biến dạng (sau khi đã ni cấy mẫu); (2) xử lý tiêu bản và nhuộm đúng kỹ thuật với kết quả các band trên NST đạt tiêu chuẩn Việc lập karyotype có thể tiến hành đối với các mẫu nghiệm như tế bào máu ngoại vi (tế bào lympho), tế bào nước ối, tủy xương, tế bào da nhưng tế bào máu ngoại vi được sử dụng nhiều nhất. Vì vậy, chúng tơi chọn ni cấy tế bào máu ngoại vi để nghiên cứu hồn thiện kỹ thuật nhuộm band G các cụm NST Tuy nhiên, việc nhuộm NST bằng kỹ thuật nhuộm band đòi hỏi phải có hố chất đặc biệt, thao tác kỹ thuật tinh tế cũng như điều kiện mơi trường (nhiệt độ, độ ẩm) thích hợp cho việc làm tiêu bản [1]. Vì vậy, hiện nay một số phòng xét nghiệm di truyền tồn quốc phải lập karyotype với kỹ thuật nhuộm Giemsa thường 129 Để phục vụ nhu cầu chẩn đốn và tư vấn di truyền tại địa phương, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm hai mục tiêu sau: Cải tiến và hồn thiện việc làm tiêu bản NST tế bào máu ngoại vi Cải tiến và hồn thiện quy trình nhuộm nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật nhuộm band G 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu: Chúng tơi nghiên cứu lập Karyotype tế bào máu ngoại vi người. Các mẫu máu được nghiên cứu lấy từ những người bình thường tình nguyện cũng như những bệnh nhân với lâm sàng có chỉ định lập Karyotype được giới thiệu từ khoa Nhi và Khoa Sản Bệnh viện Trung ương Huế Nghiên cứu thiết kế tủ làm tiêu bản, giá gác tiêu bản khi nhuộm Nghiên cứu hồn thiện kỹ thuật nhỏ tiêu bản nhằm tăng chất lượng tiêu bản Nghiên cứu hồn thiện các bước làm già, xử lý và nhuộm tiêu bản 2.2. Phương pháp nghiên cứu: Tất cả các nghiên cứu cải tiến cũng như hồn thiện quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G của chúng tơi đều dựa trên những tiêu chuẩn kỹ thuật của Hội kỹ thuật Di truyền thế giới (AGT). Đối với mỗi bước kỹ thuật đều có nhiều cách làm khác nhau tuỳ theo từng phòng xét nghiệm. Vì vậy, đối với mỗi mẫu ni cấy thu hoạch từ mỗi người được nghiên cứu, chúng tơi chia nhiều lơ để thử nghiệm Tế bào máu ngoại vi sau nuôi cấy môi trường F10 và phytohemagglutinin trong 3 ngày sẽ được thu hoạch với colcemide, sốc nhược trương bằng dung dịch KCl và sodium citrate, cố định Carnoy (3 methanol: 1 acid acetic). Sau đó tiến hành các bước làm tiêu bản và nhuộm như sau: 2.2.1. Làm tiêu bản: Chúng tơi nghiên cứu để tiêu bản đạt chất lượng chuẩn là: các NST phân tán tốt, tối đa chỉ 3 NST có biểu hiện chồng chéo và khơng có NST bị biến dạng hoặc đứt gãy Để đạt được kết quả này, q trình làm tiêu bản phải được thực hiện với các điều kiện sau: Điều kiện nhiệt độ, độ ẩm khu vực nhỏ tiêu bản thích hợp nhằm giúp tiêu bản khơ trong khoảng thời gian 3045 giây : Hầu hết các phòng xét nghiệm di truyền tế bào trên thế giới đều sử dụng Thermotron để ổn định nhiệt độ, độ ẩm. Trong điều kiện độ ẩm Thừa Thiên Huế cao (8090%), lại khơng có Thermotron, chúng tơi thiết kế một tủ làm tiêu bản bằng cách nối máy hút ẩm thơng thường với một tủ kính có cửa sổ. Lam kính được chuẩn bị tốt : chúng tơi sử dụng các loại lam ướt như sau: o Lam ngâm trong nước 1020 C o Lam ngâm trong nước 5060 C o Lam ngâm nước 3040 C Sau khi nhỏ, lượng nước trên tiêu bản được làm ráo bằng giấy Kimwipes 130 Tư thế lam kính khi nhỏ dịch treo tế bào phù hợp : chúng tơi lần lượt thử nghiệm với các tư thế như sau: Lam kính được đặt nằm ngang o Lam kính được đặt nằm nghiêng 2030 2.2.2. Làm già tiêu bản: Có các cách như sau: Để ở nhiệt độ phòng trong 34 ngày o Để trong tủ sấy 9095 C, trong 20 phút o Để trong tủ sấy 60 C, trong 1224 giờ 2.2.3. Xử lý tiêu bản bằng trypsin 0,025%: Tác dụng của trypsin lên NST nhằm tạo band khi nhuộm phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với tiêu bản, độ pH của trypsin. Chúng tôi chỉnh pH = 8 bằng Na 2HPO4. Thời gian ngâm tiêu bản trong trypsin được thử nghiệm ở 10, 15, 20 giây Sau khi ngâm trypsin, tiêu bản được rửa 2 lần trong dịch muối đẳng trương 2.2.4. Nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright: Sử dụng thuốc nhuộm Wright mẹ pha với dung dịch đệm Gurr tỷ lệ 1: 4 Thời gian nhuộm là 3 phút Vì thuốc nhuộm Wright rất dễ kết tủa nên thay vì ngâm nhiều tiêu bản trong cốc nhuộm, chúng tơi cải tiến bằng cách tạo 1 giá nhuộm lavabơ. Trên giá này chúng tơi gác các tiêu bản đã xử lý trypsin và đổ thuốc nhuộm sử dụng lên mỗi tiêu bản. Tiêu bản được rửa và làm khơ bằng khơng khí ép 3. KẾT QUẢ 3.1. Thiết bị tự thiết kế: 3.1.1. Tủ làm tiêu bản: Chúng tơi đã thiết kế thành cơng tủ làm tiêu bản bằng cách nối máy hút ẩm với một tủ kính có 2 cửa sổ Sau khi bật máy hút ẩm 3060 phút, độ ẩm trong tủ còn khoảng 5060%. Người kỹ thuật viên dễ dàng luồn tay qua cửa sổ để thao tác việc làm tiêu bản 3.1.2. Giá gác tiêu bản để nhuộm: Chúng tơi đã thiết kế một giá để gác các tiêu bản khi nhuộm ngay tại lavabơ. Để nhuộm 1 tiêu bản, chỉ cần trộn 1 ml dung dịch Wright mẹ với 4 ml đệm Gurr rồi phủ lên tiêu bản đã gác trên giá. Sau 3 phút, rửa ngay tiêu bản tại lavabơ. 131 3.2. Chất lượng tiêu bản: Bảng 1: Chất lượng tiêu bản theo tư thế và điều kiện nhiệt độ của lam kính khi nhỏ tiêu bản Nhiệt độ nước ngâm lam kính o Thời gian khơ 1020 C > 60 giây 3040oC 3050 giây 5060oC 3) Cụm NST khơng phân tán Cụm NST khơng phân tán 3.3. Hình ảnh NST sau khi nhuộm band G : Bảng 2: Sự thay đổi chất lượng hình ảnh NST được nhuộm band G theo các chế độ làm già tiêu bản và thời gian xử lý bằng trypsin Kiểu làm già tiêu bản Nhiệt độ phòng 34 ngày 60oC 1224 giờ 9095oC 20 phút Trypsin 10 giây NST sắc nét, bắt màu đậm, khơng hiện band NST sắc nét, bắt màu đậm, khơng hiện band NST khơng sắc nét, bắt màu đậm khơng hiện band Chất lượng hình ảnh NST Trypsin 15 giây Trypsin 20 giây NST sắc nét, bắt màu tốt, band hiện rõ NST phồng lên, trong lòng có những chỗ trống NST sắc nét, bắt màu tốt, band hiện rõ NST phồng lên, trong lòng có những chỗ trống NST khơng sắc nét, nhưng bắt màu tốt và hiện band NST nh, phồng lên, trong lòng có những chỗ trống 4. BÀN LUẬN 4.1. Về những trang thiết bị tự thiết kế: Tủ làm tiêu bản tự thiết kế: trong điều kiện độ ẩm của Thừa ThiênHuế cao, thường đến 8090%, tủ làm tiêu bản tự thiết kế tỏ ra rất hữu hiệu vì đã đưa độ ẩm xuống còn 5060% trong vòng 3060 phút. Đồng thời, việc thao tác trong tủ kín giúp tránh được sự thay đổi của luồng khơng khí lưu thơng, điều này giúp ổn định thời gian khơ của tiêu bản. Ngồi ra, nhờ tủ làm tiêu bản này, người kỹ thuật viên tránh được tác hại do hơi methanol và acid acetic bay lên trong q trình phun tiêu Giá gác tiêu bản để nhuộm: trước đây, với phương pháp ngâm tiêu bản trong cốc nhuộm, mỗi cốc chứa 50 ml thuốc nhuộm đã pha (tương đương 10 ml Wright mẹ) chỉ ngâm được 4 tiêu bản. Sau đó, nếu muốn nhuộm thêm phải hòa thuốc nhuộm mới vì thuốc vừa ngâm đã bị kết tủa. Như vậy, kiểu nhuộm cũ rất tốn thuốc nhuộm 132 và khó rửa sạch thuốc nhuộm trên các tiêu bản trong cốc cùng một lần. Nhờ giá gác tiêu bản này, chúng tơi có thể nhuộm lần lượt từng tiêu bản mà khơng xảy ra hiện tượngû kết tủa thuốc nhuộm. Việc nhuộm sẽ dừng khi nào đủ số cụm NST đạt chất lượng để đánh giá. Thơng thường, mỗi bệnh nhân chỉ cần nhuộm tối đa 5 tiêu bản nên lượng thuốc nhuộm Wright mẹ cần dùng khơng q 5 ml 4.2. Chất lượng tiêu bản: Theo Hội kỹ thuật di truyền thế giới, có thể nhỏ dịch treo tế bào lên lam kính khơ hoặc ướt. Tuy nhiên, lam kính khơ thường chỉ áp dụng cho các vùng có điều kiện nhiệt độ, độ ẩm lý tưởng. Các lam ướt làm cụm NST dễ phân tán vì các “thấu kính” nước trên lam kính sẽ rút lại ngay lập tức khi Carnoy trong dịch treo tế bào chạm vào nó [1]. Theo Holmquist và Motara, năng lượng khử nước từ dung dịch Carnoy đã đóng vai trò quan trọng trong việc giúp phân tán cụm NST [4]. Vì vậy, chúng tơi chọn phương pháp lam kính ướt. Chúng tơi kiểm sốt thời gian khơ tiêu bản nhờ vào việc thay đổi nhiệt độ của nước ngâm. Thời gian khơ tiêu bản rất quan trọng vì nó quyết định chất lượng phân tán của cụm NST. Theo phần lớn các nhà kỹ thuật di truyền, thời gian khơ lý tưởng là 3045 giây [1]. Nhiệt độ nước ngâm lam kính cũng có sự thay đổi tương đối tuỳ theo từng tác giả, tuy nhiên Hansen cho rằng nên sử dụng nước ngâm nhiệt độ từ 2048oC [3]. Nghiên cứu của chúng tơi bảng 1 cho thấy khi làm tiêu bản với những lam kính ngâm trong nước 3040oC thì thời gian khơ mới đạt 3050 giây. Ở các nhiệt độ nước ngâm khác trong nghiên cứu của chúng tơi chất lượng tiêu bản đều khơng tốt dù tư thế lam kính khi nhỏ là nằm ngang hay nằm nghiêng. Với nhiệt độ nước ngâm lam kính 3040oC, chúng tơi nhận thấy với lam kính đặt nghiêng 2030oC theo trục ngắn thì chất lượng tiêu bản tốt hơn. Một số nhà kỹ thuật di truyền vẫn làm tiêu bản với lam kính nằm ngang, nhưng theo Hội kỹ thuật di truyền thế giới, hiện nay đa số các phòng xét nghiệm áp dụng tư thế lam kính nằm nghiêng 2030o theo trục ngắn [1]. Ngồi ra, theo kinh nghiệm của chúng tơi, nếu dùng những lam kính có sự phân bố nước đồng đều khi lấy ra khỏi nước ngâm sẽ tạo được tiêu bản có NST phân tán tốt hơn 4.3. Chất lượng hình ảnh NST sau khi nhuộm band G: Kết quả bảng 2 cho thấy chế độ làm già tiêu bản 9095oC trong 20 phút khơng đảm bảo chất lượng hình ảnh sau khi nhuộm band G. Ở chế độ làm già tiêu bản này, hình ảnh NST có thể đem phân tích được nếu xử lý bằng trypsin đúng 15 giây, nhưng chúng tơi khơng chọn vì NST tuy có bắt màu và hiện band tốt nhưng khơng được sắc nét. Tuy nhiên, một số tác giả vẫn sử dụng khi cần có kết quả karyotype nhanh [1]. Có lẽ phòng xét nghiệm của các tác giả này nằm trong khu vực có độ ẩm thích hợp hơn chúng tơi nên kết quả nhuộm đạt chất lượng hơn Cả 2 chế độ làm già tiêu bản là để ở nhiệt độ phòng 34 ngày và 60 oC trong 12 24 giờ đều cho kết quả giống nhau. Qua kết quả này, chúng tơi đã chọn chế độ làm già tiêu bản là 60oC trong 1224 giờ để tiết kiệm thời gian trả kết quả. Thơng thường chúng tơi làm tiêu bản vào buổi chiều và để tiêu bản trong tủ sấy 60 oC qua đêm. Q trình làm già tiêu bản rất quan trọng trong việc tạo nên hình ảnh NST đạt chất lượng sau nhuộm. Tuy nhiên, người ta vẫn chưa thực sự hiểu rõ tác dụng của nó, có lẽ là do 133 q trình này đã làm khơ hết lượng nước trên tiêu bản mà có thể ảnh hưởng đến việc nhuộm band [1] Bảng 2 còn cho thấy chỉ bằng cách xử lý 15 giây với trypsin thì mới cho hình ảnh NST đạt chất lượng. Theo Wang và Federoff, trypsin đã thủy phân protein của nhiễm sắc chất làm cho thuốc nhuộm có thể phản ứng với DNA được bộc lộ [7]. Về sau, Hsu cho rằng trypsin tác động bằng sự chelat hóa (tạo phức hợp “càng cua” có tính hồ tan) hơn là tiêu hủy protein [5] Tóm lại, qua việc thử nghiệm các kiểu tiến hành làm tiêu bản và nhuộm, chúng tơi đưa ra quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G như sau: Q trình làm tiêu bản thực hiện trong tủ làm tiêu bản sau khi bật máy hút ẩm 3060 phút để đạt độ ẩm 5060% (có kiểm tra bằng ẩm kế) o Nhỏ dịch treo tế bào lên lam kính đã được ngâm trong nước 3040 C với lam o kính nằm nghiêng 2030 theo trục ngắn o Sau khi tiêu bản khô, làm già tiêu bản trong tủ sấy 60 C để qua đêm Sáng hôm sau, xử lý tiêu bản bằng trypsin 0,025% pH = 8 trong 15 giây. Rửa sạch trypsin 2 lần trong dung dịch muối đẳng trương Nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright: gác tiêu bản lên giá, trộn 1 ml dung dịch Wright mẹ với 4 ml đệm Gurr rồi phủ lên tiêu bản trong 3 phút. Sau đó rửa sạch tiêu bản và làm khơ bằng khơng khí ép 5. KẾT LUẬN Qua q trình nghiên cứu và cải tiến quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G, chúng tơi rút ra một số kết luận như sau: Việc thiết kế tủ làm tiêu bản đã giúp ổn định độ ẩm và sự lưu thơng khơng khí khu vực làm tiêu bản, tạo điều kiện đảm bảo chất lượng tiêu bản (có nhiều cụm nhiễm sắc thể đạt tiêu chuẩn) Việc thiết kế giá gác tiêu bản giúp đảm bảo chất lượng thuốc nhuộm khi cần nhuộm nhiều tiêu bản, đồng thời tiết kiệm được lượng thuốc nhuộm Wright mẹ Chúng tơi đã thiết lập được quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G đạt chất lượng cao với các cụm NST phân tán tốt, hình ảnh NST sắc nét, bắt màu thuốc nhuộm tốt và hiện band rõ TÀI LIỆU THAM KHẢO Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual 3rd edition. Lippincott Raven (1997) Geleherter T.D., Collins F.S., Ginsburg D Principles of Medical Genetics 2nd edition. William & Wilkins (1998) Hansen S. Slide preparation. Karyogram, 1980. In: Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual 3rd edition Lippincott Raven (1997) Holmquist G.P., Motara M.A., The magic of cytogenetic technology In: Obe G, Basler A., Cytogenetics. SpringerVerlag (1987) 134 Hsu T.C., Longitudinal differentiation of chromosomes Annu Rev Genet, 1973. In: Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual 3rd edition. Lippincott Raven (1997) Jorde L.B., Carey J.C., Bamshad M.J., White R.L.Medical Genetics 2nd edition, Mosby (2000) Wang H.C., Federoff S. Banding in human chromosomes treated with trypsin. Nature New Biol, 1972 In: Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual. 3rd edition. Lippincott Raven (1997) TĨM TẮT Lập karyotype là một xét nghiệm cần thiết cho tất cả các trường hợp trên lâm sàng nghi ngờ có bất thường số lượng hoặc cấu trúc NST. Để lập Karyotype đạt tiêu chuẩn cần phải nhuộm NST với kỹ thuật nhuộm band, trong đó thơng dụng nhất là nhuộm band G Nhóm nghiên cứu đã thiết kế được tủ làm tiêu bản và giá gác tiêu bản để nhuộm. Đồng thời, thiết lập được quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G với một số đặc điểm kỹ thuật như sau: o lam kính được ngâm trong nước 3040 C o tư thế lam kính khi nhỏ tiêu bản: nghiêng 2030 theo trục ngắn o làm già tiêu bản trong tủ sấy 60 C để qua đêm xử lý tiêu bản bằng trypsin 0,025% pH = 8 trong 15 giây. nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright trong 3 phút Kết quả: các cụm NST phân tán tốt, hình ảnh sắc nét, bắt màu thuốc nhuộm tốt và hiện band rõ GBANDING TECHNIQUE FOR MAKING KARYOTYPE USED IN THE DIAGNOSIS OF CHROMOSOMAL DISORDERS Ha Thi Minh Thi Đoan Thi Duyen Anh, Nguyen Viet Nhan Collge of Medicine, Hue University SUMMARY Making karyotype is very necessary for all the clinical cases doubted to have abnormal number or structure. To make karyotype get the standard required, chromosomes ought to be dyed using banding techniques, of which Gbanding id the most common. The authors of the study designed successfully a cabinet for slide preparation and a rack for staining The procedure for slide making and Gbanding was established with the following technical properties: The slides are rinsed in the water of 30400C The slides are held at an angle of 20300C during the time of dropping cells Slide aging at 600C Slide treating with tripsin of 0.025pH=8 for 15 seconds Staining with Wright for 3 minutes Result: The chromosomes in each metaphase is well separated, the pictures of chromosomes are clear, the color good, and the bands visible 135 136 ... Cải tiến và hồn thiện quy trình nhuộm nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật nhuộm band G 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu: Chúng tơi nghiên cứu lập Karyotype tế bào máu ngoại vi người. Các mẫu máu được nghiên cứu lấy từ... có bất thường số lượng hoặc cấu trúc NST. Để lập Karyotype đạt tiêu chuẩn cần phải nhuộm NST với kỹ thuật nhuộm band, trong đó thơng dụng nhất là nhuộm band G Nhóm nghiên cứu đã thiết kế được tủ làm tiêu bản và giá g c tiêu bản để nhuộm. Đồng thời,... lòng có những chỗ trống NST sắc nét, bắt màu tốt, band hiện rõ NST phồng lên, trong lòng có những chỗ trống NST khơng sắc nét, nhưng bắt màu tốt và hiện band NST nh, phồng lên, trong lòng có những chỗ