Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết báo cáo kết quả bước đầu áp dụng quy trình chẩn đoán tiền làm tổ tại Học viện Quân y. Đối tượng và phương pháp: 20 bệnh nhân (BN) có con bị mắc bệnh di truyền hoặc có tiền sử bị đình chỉ thai vì bệnh di truyền, tiến hành thụ tinh ống nghiệm, sinh thiết phôi chẩn đoán di truyền tiền làm tổ.
Tạp chí y - dợc học quân số 6-2016 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN TIỀN LÀM TỔ TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Nguyễn Đình Tảo*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng* Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang* TÓM TẮT Mục tiêu: báo cáo kết bước đầu áp dụng quy trình chẩn đốn tiền làm tổ Học viện Quân y Đối tượng phương pháp: 20 bệnh nhân (BN) có bị mắc bệnh di truyền có tiền sử bị đình thai bệnh di truyền, tiến hành thụ tinh ống nghiệm, sinh thiết phơi chẩn đốn di truyền tiền làm tổ Kết quả: gia đình thành cơng sau chuyển phơi, gia đình có bị bệnh teo tuỷ (SMA), gia đình có bị bệnh thalassemia Kết luận: thành công việc xây dựng quy trình chẩn đốn số bệnh di truyền trước phôi cấy truyền phôi với thành cơng gia đình * Từ khóa: Teo tủy; Gen SMN; Thalassemia; Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ Primary Results of Applying Protocol of Preimplantation Genetic Diagnosis in Military Medical University Summary Objectives: To report the primary results of applying protocol of preimplantation genetic diagnosis in Military Medical University Subjects and methods: 20 patients who had their children with the genetic disease or history of suspended pregnancy for genetic diseases were conducted in vitro fertilization and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis Results: families succeeded after embryo transfer, in which families having children with SMA, families having children with thalassemia Conclusion: We have succeeded in building diagnostic procedures of some genetic diseases before embryo transfer with the success of families * Key words: Spinal muscular atrophy; SMN gene; Thalassemia; Preimplantation genetic diagnosis ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh teo tủy (Spinal muscular atrophy - SMA) bệnh thần kinh cơ, di truyền lặn đột biến gen nhiễm sắc thể thường Bệnh SMA đặc trưng thoái hoá tuần tiến tế bào sừng trước tuỷ sống, dẫn đến yếu đối xứng gốc chi, trương lực phản xạ gân xương bị giảm mất, biến dạng lồng ngực cứng khớp Tỷ lệ bệnh SMA chung toàn giới 1/10.000 trẻ đẻ sống tỷ lệ người mang gen bệnh dao động từ 1/40 1/60 Theo cách phân loại quốc tế hành, SMA chia thành ba thể lâm sàng dựa vào tuổi khởi phát bệnh mức độ nặng bệnh: thể nặng, thể vừa thể nhẹ tương đương với SMA týp I, II III [8] * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đình Tảo (dinhtao1955@yahoo.com) Ngày nhận bài: 20/05/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 08/07/2016 Ngày bỏo c ng: 24/07/2016 13 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 6-2016 Gen SMN bao gồm exon mã hoá cho phân tử protein SMN dài 294 axít amin Gen SMN hai giống gen SMNt (SMN1) gen SMNc (SMN2) Hai gen khác cặp base: cặp intron 6, cặp exon 7, hai cặp intron cặp exon Sự khác exon exon sử dụng để phân biệt gen SMNt SMNc chẩn đốn SMA Người bình thường có exon gen SMNc gen SMNt, người bị SMA có exon gen SMNc, khác biệt vị trí nucleotid 214 exon gen SMNt nucleotit C, exon gen SMNc nucleotit T Hình 1: Sự khác biệt gen SMNt với SMNc Sự khác nucleotid thuộc exon SMNt SMNc, khiến cho SMNt tổng hợp phân tử protein SMN đủ chiều dài có đủ chức năng, protein SMNc tổng hợp có chức hạn chế Có ba dạng đột biến gen SMN gây bệnh SMA gồm: dạng 1: đột biến đồng hợp toàn gen SMNt đồng hợp phần gen SMNt; dạng 2: đột biến chuyển đổi gen SMNt thành SMNc; dạng 3: đột biến điểm xảy gen SMNt nhiễm sắc thể, gen SMNt nhiễm sắc thể lại cặp tương đồng số bị đột biến dạng Trong đó, khoảng 95% BN SMA có gen SMNt bị đột biến thuộc dạng 2, 5% BN SMA bị đột biến gen SMNt thuộc dạng Cả hai dạng dạng chẩn đốn cách phân tích có mặt hay không exon SMNt, 14 sở phương pháp chẩn đoán gen bệnh SMA Mỗi trẻ em mắc bệnh SMA đời gánh nặng cho gia đình tâm lý tài chính, đồng thời gánh nặng cho tồn xã hội Do đó, việc chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi (Preimplantation genetic diagnosis - PGD) với gia đình tiểu sử có người mắc bệnh SMA nhằm chọn phôi lành để cấy chuyển vào tử cung mẹ, từ sinh em bé khỏe mạnh cần thiết, có ý nghĩa khoa học thực tiễn, nhân văn cao Thalassemia bệnh di truyền đơn gen phổ biến giới Ở Việt Nam, ước tính có khoảng triệu người mang gen bị bệnh Hàng năm có khoảng 2.000 trẻ sinh mắc bệnh thalassemia Điều trị cho trẻ tạo gánh nặng kinh tế tinh thần cho gia đình tồn T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2016 xó hi Chn oỏn di truyền trước chuyển phôi phương pháp sàng lọc phôi bất thường mặt di truyền, thực trước cấy phôi vào tử cung người mẹ, phương pháp dự phòng hiệu cho bệnh di truyền, có thalassemia Để thực điều này, cần quy trình phát đột biến gen tế bào Đây khó khăn kỹ thuật PGD mang lại hy vọng cho cặp vợ chồng bị thất bại nhiều lần thụ tinh ống nghiệm không rõ nguyên nhân Ngồi ra, PGD áp dụng cho bà mẹ lớn tuổi để hạn chế bất thường di truyền Trên giới có khoảng 300 gen liên quan đến bệnh phát PGD Trên sở thực nghiên cứu “Nghiên cứu quy trình chẩn đốn số bệnh di truyền trước chuyển phôi để sàng lọc phôi thụ tinh ống nghiệm”, báo cáo: Kết bước đầu áp dụng quy trình chẩn đốn tiền làm tổ Học viện Quân y ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 20 gia đình, vợ < 35 tuổi, có điều trị Bệnh viện Nhi Trung ương Viện Huyết học Truyền máu Trung ương, chẩn đoán bị bệnh SMA đồng hợp tử exon gen SMNt bị bệnh thalassemia Phương pháp nghiên cứu - Tách ADN từ tế bào máu ngoại vi bố, mẹ tất gia đình có bị bệnh thalassemia SMA - Chuẩn bị kích trứng cho người mẹ gia đình đăng ký tham gia làm PGD - Sinh thiết phôi bào từ phôi - Khuếch đại gen từ tế bào phơi sau sinh thiết kít RepliG (Qiagen) - Tiến hành phản ứng PCR nhân exon 7, exon gen SMN từ mẫu phơi chẩn đốn SMA - Tiến hành nhân gen chạy minisequencing TripAssay cho mẫu phơi bố mẹ, gia đình chẩn đoán thalassemia - Chẩn đoán bệnh thalassemia SMA cho phôi sinh thiết KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết chẩn đốn phơi gia đình mang gen SMA Khuếch đại exon 7, exon gen SMN kỹ thuật nested-PCR hai cặp mồi đặc hiệu exon 7, exon gen SMN qua hai vòng Chu trình nhiệt PCR thực máy khuếch đại gen efpendorft điều kiện: 960C/5 phút; [940C/1 phút; 550C/1 phút; 720C/1 phút] x 25 chu kỳ; 720C/10 phút Lấy sản phẩm PCR vòng làm mẫu cho phản ứng PCR vòng Chu trình nhiệt PCR thực máy khuếch đại gen efpendorft điều kiện: 960C/5 phút; [950C/30 giây; 550C/30giây; 720C/45 giây] x 35 chu kỳ; 720C/5 phút Sản phẩm PCR ủ với enzym giới hạn Dra I DdeI thời gian từ - Điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 3% 15 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2016 - Sản phẩm sau cắt enzym exon gen SMNt (188 bp) exon gen SMNc (164 bp 24 bp) - Sản phẩm sau cắt enzym exon gen SMNt (190 bp) exon gen SMNc (120 bp, 70 bp) Hình 2: Kết điện di gel agarose 2% sản phẩm PCR gia đình BN C3: ladder 50 bp Sản phẩm PCR exon chưa ủ với enzym DraI (Ko DraI) exon chưa ủ với enzym DdeI (Ko DdeI) bố BN C3 (B3), mẹ BN C3 (M3), BN C3 giống nhau, có băng 188 bp - sản phẩm nhân exon băng 190 bp - sản phẩm nhân exon Nhưng ủ sản phẩm PCR với enzym DraI thấy: - B3 M3 có hai băng tương ứng 188 bp 164 bp, có nghĩa B3 C3 có exon SMNt (khơng bị cắt 188 bp), exon SMNc bị cắt thành hai mảnh (164 bp 24 bp) - Trong C3 có băng tương ứng 164 bp, nghĩa C3 bị đồng hợp exon SMNt, có exon SMNc nên bị enzym giới hạn cắt thành hai băng (164 bp, 24 bp), điều phù hợp với kết Bệnh viện Nhi Trung ương 16 Hình 3: Kết điện di gel agarose 3% sản phẩm PCR sau ủ với enzym giới hạn gia đình BN C7: ladder 100 bp Cả bố (B7) mẹ (M7) BN C7 có exon gen SMNt nên ủ sản phẩm PCR với enzym giới hạn DraI có hai băng (188 bp exon SMNt 164 bp exon SMNc), tương tự exon gen SMN Như vậy, BN C7 đồng hợp exon exon gen SMNt BNC3 đồng hợp exon v gen SMNt Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 6-2016 Các phơi sinh thiết gia đình có bị bệnh SMA chẩn đốn phương pháp Gia đình số có phơi sinh thiết ngày 3; gia đình số thụ tinh phôi, phôi không phát triển đến ngày Do vậy, khơng có phơi sinh thiết; gia đình số 18 phơi sinh thiết ngày Chúng thu số kết sau: Bảng 1: Kết phát đột biến gen SMNt máu tồn phần phơi sinh thiết gia đình có mắc bệnh SMA TT BN Gen SMNt Exon Exon SMAC3 - - P1_3 + + Bố BN Gen SMNt Exon Exon SMAB3 + + P2_3 + + Mẹ BN Gen SMNt Exon Exon SMAM3 + + P3_3 + + + SMAM7 + + Kết quả: phơi bình thường SMAC7 - - SMAB7 + Khơng có phơi sinh thiết SMAC18 - - SMAB18 + + SMAM18 + + P1_18 - - P2_18 - - P3_18 - - P4_18 + + P5_18 - - Kết quả: phôi số chuyển thành công Tất bố, mẹ BN có mặt exon 7, SMNt thực tế, cặp bố mẹ người khơng có biểu bệnh SMA Nghĩa là, nhiễm sắc thể cặp tương đồng số có gen SMNt bình thường (dạng dị hợp) dịch mã đủ lượng protein SMN (survival motor neurone) cho tế bào thần kinh vận động hoạt động bình thường Các phơi bình thường gia đình chuyển phơi, kết quả: gia đình có bị bệnh SMA có khỏe mạnh (Lê Thị H, Nguyễn Văn V, SMA, chọc noãn 25/11/2014 chuyển phôi lần không kết quả; chuyển phôi lần ngày 30/3/2015, sinh khỏe mạnh ngày 12/12/2015 Phạm Thị Việt H, Nguyễn Tuấn A, SMA Nghệ An; chọc noãn 19/5/2015, sinh thiết phôi; phôi bị bệnh; phôi 2, 3, bình thường; phơi chưa có thơng tin di truyền; chuyển phôi ngày 18/6/2015; mang thai, sinh gái ngày 28/2/2016 Gia đình Phạm Thị H, Nguyễn Văn V, SMA; chọc noãn ngày 16/12/2014; sinh thiết phơi; phơi 1; phơi bình thường; phơi bị bệnh; chuyển phôi 12/3/16, không kết quả) 17 Tạp chí y - dợc học quân số 6-2016 Kết chẩn đốn thalassemia gia đình mẫu phơi sinh thiết 17 gia đình tham gia nghiên cứu Hình 3: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THM16, THB16 THM16 mang kiểu gen dị hợp tử Cd26, píc màu đen nucleotid C (bình thường), píc màu đỏ nucleotid T (đột biến) THB16 mang kiểu gen dị hợp tử Cd17, píc xanh nucleotid A (đột biến), píc đỏ nucleotid T (bình thường) Hình 4: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THC16 Mẫu nghiên cứu THC16 mang kiểu gen dị hợp tử hai đột biến Cd26/Cd17 18 T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2016 Hỡnh 5: Hỡnh ảnh TripAssay mẫu nghiên cứu THB16, THC16, THM16 Kết chẩn đoán xác định đột biến kỹ thuật minisequencing kiểm chứng kít TripAssay cho kết phù hợp: vị trí đột biến mẫu bố Cd17 dị hợp tử, mẹ Cd26 dị hợp tử, mang đột biến Cd17 Cd26 Hình 6: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THB24, THM24 THB24, THM24 mang kiểu gen dị hợp tử Cd17, píc xanh nucleotid A (đột biến), píc đỏ nucleotid T (bỡnh thng) 19 Tạp chí y - dợc học quân sù sè 6-2016 Hình 7: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THC24 THC24 mang kiểu gen đồng hợp tử Cd17, xuất píc xanh A (đột biến) Gia đình có phơi sinh thiết ngày để chẩn đốn xác định đột biến với kết quả: phơi bình thường không mang gen đột biến (phôi số 1), phôi đồng hợp tử Cd17 (phôi phôi 3) phôi mang gen dị hợp tử Cd17 (phôi số 4, 5, 6) Dưới kết nhân gen kỹ thuật minsequencing kiểm tra lại kít TripAssay: Hình 8: Hình ảnh điện di minisequenicng phơi gia đình 24 Từ hình ảnh cho thấy mẫu số có xuất píc huỳnh quang nucleotid T, vị trí nucleotid bình thường Do vậy, phôi số phôi không mang gen gây bệnh, phơi bình thường Phơi số phơi số xuất píc huỳnh quang nucleotid A Vị trí nucleotid vị trí đột biến, phôi số phôi số mang gen đồng hợp tử Cd17, phôi bị bệnh Các phôi số 4, 5, xuất píc huỳnh quang nucleotid A T, phôi mang gen dị hợp tử Cd17, phôi mang gen khơng phát bệnh 20 T¹p chí y - dợc học quân số 6-2016 Hỡnh 9: Hình ảnh chẩn đốn phơi sinh thiết kít TripAssay Đây hình ảnh chẩn đốn phơi sinh thiết ngày gia đình số 24, phôi này, phôi mang gen đồng hợp tử Cd17, phôi số số Các phôi lai TripAssay thấy xuất vạch vị trí đột biến Cd17 vạch vị trí bình thường Cd17 Phơi số khơng xuất vạch đột biến Do vậy, phơi số bình thường Phôi số 4, 5, xuất vạch đột biến, chưa vạch vị trí bình thường nên phôi mang gen dị hợp tử Cd17, phôi không biểu bệnh Tương tự trên, kết gia đình số 23 16 phơi ngày 3, 14 phơi tốt - 10 tế bào, phôi - tế bào, ngày có phơi phát triển bình thường sinh thiết Đã chẩn đoán di truyền bệnh thalassemia cho tất phơi Một số gia đình tạo phơi, phôi phát triển bất thường; Do vậy, phơi sinh thiết Một số gia đình có phơi chẩn đốn chuyển phơi, số gia đình khác phơi chuyển lần 1, chưa đậu phôi, chờ chuyển lần Trong số BN thalassemia, có gia đình đậu phơi, gia đình sinh khỏe mạnh gia đình mang thai 21 T¹p chÝ y - dợc học quân số 6-2016 KT LUN - ó xây dựng quy trình chẩn đốn số bệnh di truyền trước chuyển phôi để sàng lọc phôi thụ tinh ống nghiệm Taylor JE, Thomas NH, Lewis CM et al Correlation of SMNt and SMNc gene copy number with age of onset and survival in spinal muscular atrophy Eur J Hum Genet 1998, 6, pp.467-474 - Đã ứng dụng quy trình PGD thành cơng BN thalassemia SMA, tổng số gia đình, gia đình SMA gia đình thalassemia Ng IS, Law HY Challenges in screening and prevention of thalassaemia in Singapore Asian-Oceanian Journal of Paediatrics and Child Health 2003, 2, pp.29-38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Dreesen JC, Bras M, Die - Smulders C et al Preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy Mol Hum Reprod 1998, (9), pp.881-885 Graeme Daniels, Rachel Pettigrew, Alan Thornhill et al Six unaffected livebirths following preimplatation diagnosis for spinal muscular atrophy Mol Hum Reprod 2001, (10), pp.995-1000 Wang W, Kham SK, Yeo GH, Quah TC, Chong SS Multiplex minisequencing screen for common Southeast Asian and Indian betathalassaemia mutations Clin Chem 2003, 49, pp.209-218 Kuliev A, Rechitsky S, Verlinsky O, Ivakhnenko V, Evsikov S, Wolf G et al Preimplantation diagnosis of thalassaemias J Assist Reprod Genet 1998, 15, pp.219-225 Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S et al Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene Cell 1995, 80, pp.155-165 Deng J, Peng WL, Li J, Fang C, Liang XY, Zeng YH et al Successful preimplantation genetic diagnosis for alpha-and betathalassaemia in China Prenat Diagn 2006, 26, pp.1021-1028 Rodrigues NR, Owen N, Talbot K, Ignatius J, Dubowitz V, Davies KE Deletions in the survival motor neurone gene on 5q13 in autosomal recessive spinal muscular atrophy Hum Mol Genet 1995, 4, pp.631-634 10 De Rycke M, Van de Velde H, Sermon K, Lissens W, De Vos A, Vandervorst M et al Preimplantation genetic diagnosis for sicklecell anemia and for beta-thalassaemia Prenat Diagn 2001, 21, pp.214-222 22 ... bệnh di truyền trước chuyển phôi để sàng lọc phôi thụ tinh ống nghiệm”, báo cáo: Kết bước đầu áp dụng quy trình chẩn đốn tiền làm tổ Học viện Quân y ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng... đình mang thai 21 Tạp chí y - dợc học quân số 6-2016 KẾT LUẬN - Đã x y dựng quy trình chẩn đốn số bệnh di truyền trước chuyển phơi để sàng lọc phôi thụ tinh ống nghiệm Taylor JE, Thomas NH, Lewis... chuyển phơi, kết quả: gia đình có bị bệnh SMA có khỏe mạnh (Lê Thị H, Nguyễn Văn V, SMA, chọc nỗn 25/11/2014 chuyển phơi lần khơng kết quả; chuyển phôi lần ng y 30/3/2015, sinh khỏe mạnh ngày