Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định HLA, nhưng phương pháp dựa trên sinh học phân tử là hiện đại, chính xác. Và nghiên cứu tiến hành từ 9/2010 Trung tâm truyền máu Bệnh viện Chợ Rẫy triển khai kỹ thuật HLA (Human Leucocyte Antigen) bằng phương pháp PCR-SSO (Polymerase Chain Reaction – Sequence-specific Oligonucleotide Probes).
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR-SSO ĐỂ XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẦU Ở NGƯỜI (HLA) TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY Nguyễn Trường Sơn*, Trần Văn Bảo**, Phạm Thị Hồng Ngọc**, Huỳnh thị Thanh Hà**, Đỗ Thị Ngọc Thảo**, Trần Thị Mỹ Duyên**, Phạm Lê Nhật Minh** TÓM TẮT Mở đầu: Hiện có nhiều phương pháp để xác định HLA, phương pháp dựa sinh học phân tử đại, xác Phương pháp: Từ 9/2010 Trung tâm truyền máu Bệnh viện Chợ Rẫy triển khai kỹ thuật HLA (Human Leucocyte Antigen) phương pháp PCR-SSO (Polymerase Chain Reaction – Sequence-specific Oligonucleotide Probes) Kết quả: Kết khảo sát 24 người, xác định có 49 kiểu hình HLA-A, 38 kiểu hình HLA-B, 45 kiểu hình HLA –DRB1, 45 kiểu hình HLA –DQA1 47 kiểu hình HLA –DQB1 Chiếm tỷ lệ cao số kiểu hình HLA sau: HLA-A*11 với 27,27 %, HLA-A*2 với 22,72 %, HLA-A*24 với 11,36 %, HLAB*07, HLA-B*15 với 18,43%, HLA-DRB1*12 với 28,89%, HLA-DRB1*15 với 17,78%, HLA-DRB1*04 HLA-DRB1*14 13,34%, HLA-DQA1*01 với 46,66%, HLA-DQA1*06 với 26,67%, HLA-DQB1*03 với 51,06% HLA-DQB1*05 với 38,30% Kết luận: Việc triển khai kỹ thuật xác định HLA phương pháp SSO có nhiều tiện ích cơng tác chẩn đoán trước ghép tạng, chọn lựa người cho tổ chức, đặc biệt phương pháp nhanh chóng, xác đặc hiệu cho kiểu hình HLA ABSTRACT INITIAL APPLYING PCR-SSP METHOD TO IDENTIFY HUMAN LEUCOCYTE ANTIGEN (HLA) IN CHỢ RẪY HOSPITAL Nguyen Truong Son, Tran Van Bao, Pham Thi Hong Ngoc, Huynh Thi Thanh Ha, Do Thi Ngoc Thao, Tran Thi My Duyen, Pham Le Nhat Minh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 378 - 381 Background & Methods: Since September 2010, in Chợ rẫy Blood Tranfusion Center, we have performed HLA (Human Leucocyte Antigen) phenotyping techniques by PCR-SSO (Polymerase Chain Reaction – Sequence- specific Oligonucleotide Probes) Results: Collected are that 49 phenotyping of HLA-A, 38 phenotyping of HLA-B, 45 phenotyping of HLA – DRB1, 45 phenotyping of HLA –DQA1 and 47 phenotyping of HLA –DQB1 among 24 persons The most popular phenotype of HLA-A*11 is 27.27 %, HLA-A*2 is 22.72 %, HLA-A*24 is11.36 %, HLA-B*07, HLAB*15 are 18.43%, HLA-DRB1*12 is 28.89%, HLA-DRB1*15 is 17.78%, HLA-DRB1*04 and HLA-DRB1*14 are 13.34%, HLA-DQA1*01 is 46.66%, HLA-DQA1*06 is 26.67%, HLA-DQB1*03 is 51.06% and HLADQB1*05 are 38.30% Conclusion: The method helps us alots in diagnosis before organic transplantationt, choose donor for transplantation, especially it is fastest, accurate and specific for HLA phenotyping * BV Chợ Rẫy, ** Trung Tâm truyền máu BV Chợ Rẫy Tác giả liên lạc: DS Trần Văn Bảo ĐT: 0903978845 Email: tranvanbao178@yahoo.com 378 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Chợ Rẫy 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Năm 1936 Peter Gorer nghiên cứu thải loại ghép dòng chuột chủng đến kết luận thải ghép đáp ứng miễn dịch khác biệt kháng nguyên tổ chức Sau đó, Jaen Dausset nghiên cứu nhóm bạch cầu người xác định kháng nguyên bạch cầu có liên quan đến việc thải loại ghép đặt tên nhóm tổ chức mà ngày thống HLA (Human Leucocyte Antigen)(2,3) Đối tượng Do tính đa dạng phân tử nhóm phù hợp mơ nên việc định nhóm khơng phải đơn giản định nhóm máu Ngày nay, nhiều kỹ thuật định nhóm HLA áp dụng Với kỹ thuật vi độc tế bào lympho (microlymphotoxicity), người ta dùng kháng thể đơn đặc hiệu với nhóm HLA cho thyêm vào bổ thể Các tế bào có mang kháng nguyên HLA tương ứng với kháng thể đặc hiệu với diện bổ thể, tế bào bị gây độc chết Từ đó, ta suy tế bào có mang nhóm kháng nguyên Các kỹ thuật huyết dùng tốt cho định nhóm HLA lớp I nhóm DR lớp II, khó khăn với DP DQ(3,5) Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử ngày áp dụng rộng rãi Phân tích trình tự axit nhân cuả kỹ thuật phản ứng chuỗi đặc hiệu kháng nguyên phù hợp mô HLA Kỹ thuật thông thường khuếch đại vùng đặc hiệu cho phân tử HLA với kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Sản phẩm sau lai ghép với cặp mồi đặc hiệu cho biến thể allele Các kỹ thuật cho phép phân nhiều biến thể kỹ thuật huyết thanh(4) Tất người cho quan (thận, tủy…) người bệnh nhận quan đến xét nghiệm Bệnh viện Chợ Rẫy Phương pháp nghiên cứu Kỹ thuật PCR-SSO, với kỹ thuật ly trích DNA QIAamp DNA Mini Kit kỹ thuật PCR với Micro SSO HLA ClassI II ABDR, DQ DNA Typing Tray công ty One Lambda (Mỹ)(4) Trong kỹ thuật sinh học phân tử này, ta khuếch đại vùng đặc hiệu cho phân tử HLA với kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Sản phẩm sau lai ghép với cặp mồi đặc hiệu giúp phát kiểu gen HLA KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát 24 người, xác định có 49 kiểu hình HLA-A, 38 kiểu hình HLA-B, 45 kiểu hình HLA –DRB1, 45 kiểu hình HLA –DQA1 47 kiểu hình HLA –DQB1 (Bảng 1-5): 3.1 Kết HLA-A: Chiếm tỷ lệ cao số kiểu hình HLAA sau: HLA-A*11 với 27,27 %, HLA-A*2 với 22,72 %, HLA-A*24 với 11,36 % (Bảng 1) Kết tương tự với kết tác giả Phan Nguyễn Thanh Vân năm 2008 với phương pháp PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers) Bảng Số lượng tỷ lệ HLA - A Từ tháng 9/2010 đến nay, Bệnh viện Chợ Rẫy triển khai kỹ thuật xác định HLA phương pháp PCR-SSO (Polymerase Chain Reaction – Sequence- specific Oligonucleotide Probes) Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Chợ Rẫy 2011 Stt HLA - A HLA-A*01 HLA-A*02 HLA-A*11 HLA-A*24 HLA-A*29 HLA-A*30 HLA-A*31 HLA-A*33 Tổng cộng Số lượng 10 12 4 44 Tỷ lệ % 6,81 22,72 27,27 11,36 9,1 4,54 9,1 9,1 100 379 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Với kit này, chưa thể phân biệt số trường hợp HLA-A*0203 hay HLA-A*3406, HLA-A*3108 khơng sử dụng cặp mồi chun biệt cho allen Kết HLA-B Chiếm tỷ lệ cao số kiểu hình HLAB HLA-B*07, HLA-B*15 với 18,43% HLAB*38 HLA-B*51 với 10,53 % (Bảng 2) Kết tương tự với kết tác giả Phan Nguyễn Thanh Vân năm 2008 kiểu hình HLA-B*15, có khác biệt kiểu hình HLA-B*07, HLA-B*38 HLA-B*51(1) Các kiểu hình khơng có khác biệt vượt trội số lượng mẫu chưa đủ lớn Bảng Số lượng tỷ lệ HLA - B Stt 10 11 12 HLA -B HLA-B*07 HLA-B*13 HLA-B*15 HLA-B*35 HLA-B*38 HLA-B*40 HLA-B*46 HLA-B*51 HLA-B*54 HLA-B*55 HLA-B*56 HLA-B*57 Tổng cộng Số lượng 7 4 1 2 38 Bảng Số lượng tỷ lệ HLA - DR Stt 10 11 12 HLA-DRB1* HLA-DRB1*03 HLA-DRB1*04 HLA-DRB1*07 HLA-DRB1*08 HLA-DRB1*09 HLA-DRB1*10 HLA-DRB1*11 HLA-DRB1*12 HLA-DRB1*13 HLA-DRB1*14 HLA-DRB1*15 HLA-DRB1*16 Tổng cộng Số lượng 1 13 45 Tỷ lệ % 4,44 13,34 4,44 2,22 2,22 2,22 6,67 28,89 2,22 13,34 17,78 2,22 100 Kết HLA- DQ Chiếm tỷ lệ cao số kiểu hình HLADQA1 HLA-DQA1*01 với 46,66 % HLA-DQA1*06 với 26,67 % (Bảng 4) Tỷ lệ % 18,43 7,89 18,43 5,26 10,53 7,89 5,26 10,53 2,63 2,63 5,26 5,26 100 Bảng Số lượng tỷ lệ HLA - DQ A1 Stt HLA-DQ Số lượng Tỷ lệ % HLA-DQA1*01 21 46,66 HLA-DQA1*02 6,67 HLA-DQA1*03 6,67 HLA-DQA1*04 2,22 HLA-DQA1*05 11,11 HLA-DQA1*06 12 26,67 45 100 Tổng cộng Tương tự HLA – A, chưa xác định số trường hợp HLA – B*5102 khơng sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho allen này, nhiều mẫu chưa xác định Kết HLA- DR Đối với HLA-DQB1 HLA-DQB1*03 với 51,06% HLA-DQB1*05 với 38,30 % (Bảng 5) Bảng Số lượng tỷ lệ HLA - DQ B1 Stt HLA-DQ HLA-DQB1*02 HLA-DQB1*03 HLA-DQB1*05 HLA-DQB1*06 Tổng cộng Số lượng 24 18 47 Tỷ lệ % 8,51 51,06 38,30 2,13 100 Chiếm tỷ lệ cao số kiểu hình HLADRB1* HLA-DRB1*12 với 28,89%, HLA-DRB1*15 với 17,78%, HLA-DRB1*04 HLA-DRB1*14 13,34% Các kết có khác biệt với tác giả Phan Nguyễn Thanh Vân với phương pháp PCR-SSP(1) Ưu điểm kỹ thuật phát HLA-DQA1 HLA-DQB1 mà kỹ thuật vi độc tế bào không phát được(1) Đối với kiểu hình HLA-DRB3, HLADRB4, HLA-DRB5 BỘ Kit chưa đủ khả phân biệt subtype Phân tử nhóm phù hợp tổ chức chính, người nhóm HLA, sản phẩm phức hợp gen gần giống đa dạng chúng có nhiều allen Bởi tính đặc 380 KẾT LUẬN Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Chợ Rẫy 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 hiệu kháng nguyên phân tử thể khác khơng có quan hệ huyết thống Việc triển khai kỹ thuật xác định HLA phương pháp SSO có nhiều tiện ích cơng tác chẩn đoán trước ghép, chọn lựa người cho tổ chức, đặc biệt phương pháp nhanh chóng, xác, đặc hiệu cho kiểu hình HLA Trong hướng phát triển tới tiến hành thực cặp mồi chuyên biệt Nghiên cứu Y học cho kiểu hình HLA thiếu, nhằm đem lại chẩn đốn HLA xác toàn diện TÀI LIỆU THAM KHẢO Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Chợ Rẫy 2011 Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2008), “Kỹ thuật xác định HLA phương pháp PCR-SSP Bệnh viện Truyền máu- Huyết học”,Y học Việt nam (344), tr815-820 Trần văn Bé (1999), Huyết học lâm sàng, NXB Y học – T.P Hồ Chí Minh: Vũ Triệu An, Nguyễn Ngọc Lanh, Phạm Mạnh Hùng, Phan thị Phi Phi (1997), Miễn dịch học, Nxb Y học-Hà nội.tr.306-320.2 381 ... phương pháp PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primers) Bảng Số lượng tỷ lệ HLA - A Từ tháng 9/2010 đến nay, Bệnh viện Chợ Rẫy triển khai kỹ thuật xác định HLA phương pháp PCR-SSO. .. nhiều biến thể kỹ thuật huyết thanh(4) Tất người cho quan (thận, tủy…) người bệnh nhận quan đến xét nghiệm Bệnh viện Chợ Rẫy Phương pháp nghiên cứu Kỹ thuật PCR-SSO, với kỹ thuật ly trích DNA QIAamp... LIỆU THAM KHẢO Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Chợ Rẫy 2011 Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2008), “Kỹ thuật xác định HLA phương pháp PCR-SSP Bệnh viện Truyền máu- Huyết học”,Y học Việt nam (344),