Đang tải... (xem toàn văn)
Nội dung của bài viết trình bày về khảo sát tái sắp xếp nhiễm sắc thể 11q23 trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho B, kết quả cho thấy kỹ thuật FISH với các đoạn dò đặc hiệu giúp phát hiện TSX NST 11q23 một cách nhanh chóng, chính xác, giúp thêm dữ liệu cho việc phân nhóm nguy cơ và định hướng điều trị cho bệnh nhân BCCDL‐B.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT TÁI SẮP XẾP 11q23 TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DỊNG LYMPHO B TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC Nguyễn Tấn Bỉnh* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Khảo sát tái sắp xếp (TSX) nhiễm sắc thể (NST) 11q23 trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho B (BCCDL‐B). Phương pháp: Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) với probe LSI MLL dual color, break apart rearrangement để phát hiện bất thường NST 11q23 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ tháng 10/2012 đến 10/2013. Kết quả: Trong 76 bệnh nhân được khảo sát, 6 bệnh nhân (7,89%) có TSX NST 11q23. Khi so sánh với kết quả của RT‐PCR và NST đồ thì 5 bệnh nhân (6,58%) có chuyển vị t(4;11)(q21;q23) và trường hợp còn lại là tái sắp xếp của NST 11q23 với NST khác ngoại trừ NST 4. Kết luận: Kỹ thuật FISH với các đoạn dò đặc hiệu giúp phát hiện TSX NST 11q23 một cách nhanh chóng, chính xác, giúp thêm dữ liệu cho việc phân nhóm nguy cơ và định hướng điều trị cho bệnh nhân BCCDL‐B. Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng lympho B, FISH, tái sắp xếp NST 11q23. ABSTRACT DETECTION OF 11q23 REARRANGEMENT IN B CELL ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA PATIENT AT BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL Nguyen Tan Binh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 237 ‐ 241 Objective: To detect chromosome 11q23 rearrangement in patients with B cell acute lymphoblastic leukemia. Methods: The fluorescent in situ hybridization (FISH) technique with probe LSI MLL dual color, break apart rearrangement was used to detect chromosomal abnormalities of 11q23 at The Blood Transfusion and Hematology Hospital from October 2012 to October 2013. Results: Among 76 patient samples were analyzed, 6 patients (7.89%) had chromosome 11q23 rearrangement. Comparing with the result of RT‐PCR and karyotype, 5 cases (6.58%) were t(4;11)(q21;q23) translocation and the remaining patient was translocation of 11q23 with other chromosomes except for chromosome 4 . Conclusion: The interphase FISH with specific probes can detect the rearrangement of chromosome 11q23 quickly and exactly. The result of this study can give more data for risk classification in B cell acute lymphoblastic leukemia. Keywords: acute lymphoblastic leukemia, FISH, 11q23 rearrangement. BCCDL‐B chiếm ưu thế với gần 90% trường hợp ĐẶT VẤN ĐỀ được chẩn đốn BCCDL. BCCDL xuất phát từ Bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) là bệnh một tế bào tiền thân của dòng lympho với lý ác tính của hệ tạo máu chiếm khoảng 1/3 những thay đổi gen chuyên biệt dẫn tới sự trong các loại bệnh ung thư ở trẻ em, gồm có hai chuyển dạng ác tính và tăng sinh khơng kiểm thể là BCCDL‐B và BCCDL‐T(1). Trong đó, sốt. Do đó, đánh giá tiên lượng BCCDL dựa * Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS.BS. Nguyễn Tấn Bỉnh ĐT: 0913769173 Huyết Học Email: nguyentanbinhmd@gmail.com 237 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 vào di truyền học góp thêm 1 dữ liệu đáng tin cậy để lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp. Hơn 75% trường hợp BCCDL được đánh giá tiên lượng hay phân nhóm điều trị và theo dõi điều trị dựa trên số lượng NST, các kiểu tái sắp xếp (TSX) nhiễm sắc thể (NST) chuyên biệt hay các thay đổi di truyền ở mức độ phân tử như t(12;21), t(9;22), t(1;19), t(4;11), t(8;14), t(8;22) và t(2;8) tạo ra các tổ hợp gen TEL/AML1, BCR/ABL, E2A/PBX1, MLL/AF4, cMYC/IgH, cMYC/IgL và IgK/cMYC tương ứng và các bất thường khác liên quan đến 11q23(2). Các rối loạn phân tử quan trọng trên lâm sàng ở BCCDL‐B giai đoạn tiền tế bào B bao gồm BCR/ABL, TEL/AML1, E2A/PBX1 và các TSX gen MLL (11q23) và các bất thường NST này rất có ý nghĩa trong tiên lương và điều trị(6,9,). Bất thường liên quan đến 11q23 được nhận thấy có hơn 30 chuyển đoạn khác nhau, được tìm thấy trên bệnh BCCDL precursor‐B, bạch cầu cấp dòng tủy, hội chứng loạn sinh tủy, vài trường hợp BCCDL‐T, và trong bệnh ung thư máu thứ phát(1,7). Chuyển vị t(4;11) chiếm khoảng 50‐70% những ca BCCDL nhũ nhi, và khoảng 5% những ca trẻ em và người lớn(5). Một số tác giả thấy trong các bất thường liên quan đến 11q23 thì t(4;11) là xấu nhất, còn Katz thấy tất cả bệnh nhân có bất thường liên quan 11q ở trẻ em dưới 11 tuổi đều tiên lượng xấu, tái phát sớm và có xâm lấn thần kinh trung ương(2). Các tác giả như Negrin, Larson, Hoffbrand đều cho rằng những bệnh nhân có t(4;11) là những bệnh nhân có tiên lượng xấu trong điều trị hóa chất và có chỉ định ghép tủy xương nhưng phải ghép ngay đợt lui bệnh đầu(3). Bên cạnh đó, theo Young và Godley, bệnh nhân BCCDL có chuyển đoạn t(4;11) có tiên lượng xấu với tỷ lệ đáp ứng điều trị ban đầu cao nhưng thời gian lui bệnh ngắn dưới 1 năm(10). Hiện nay, có 3 kỹ thuật được sử dụng để phát hiện các bất thường liên quan đến 11q23 là NST đồ, lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) và PCR.Trong 3 kỹ thuật thì PCR là kỹ thuật có 238 độ nhạy cao nhưng chỉ có thể phát hiện được tổ hợp gen MLL/AF4 tương ứng với t(4;11). NST đồ và FISH thì có thể giúp phát hiện nhiều kiểu chuyển đoạn khác nhau liên quan đến 11q23 nhưng FISH thì có độ nhạy cao hơn.Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi ứng dụng kỹ thuật FISH bước đầu khảo sát TSX 11q23 trên BN BCCDL‐B tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BV.TMHH), để góp thêm dữ liệu giúp các bác sĩ lâm sàng phân nhóm tiên lượng và định hướng điều trị được hiệu quả hơn. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Các BN được chẩn đốn BCCDL‐B bằng tủy đồ và dấu ấn miễn dịch có chỉ định làm xét nghiệm FISH tại BV.TMHH Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 10/2012 đến 10/2013. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Mơ tả loạt ca. Phương pháp tiến hành Thu hoạch trực tiếp 2 ml mẫu tủy xương của BN BCCDL‐B trong chống đơng heparin để thu nhận tế bào bạch cầu và cố định tế bào trên tiêu bản. Tiêu bản có thể sử dụng ngay hoặc lưu trữ trong 6 tháng. Đoạn dò được sử dụng để lai hóa là LSI MLL dual color, break apart rearrangement probe (Vysis, Hoa Kỳ) có cấu trúc như Hình 1. Tiêu bản tế bào và đoạn dò được biến tính bằng máy ThermoBrite (Abbott, Hoa Kỳ) ở 75oC trong 5 phút, sau đó ủ ở 37oC qua đêm (khoảng từ 18 đến 20 tiếng đồng hồ). Sau khi ủ, tiêu bản được rửa để loại bỏ những mẫu dò bắt cặp khơng đặc hiệu bằng dung dịch 0,3% NP‐40 / 0,4 x SSC ở nhiệt độ 75oC trong 2 phút, kế tiếp rửa bằng dung dịch 0,1 % NP‐40 / 2 x SSC ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Tiêu bản được để khơ và phủ bằng 15 μL dung dịch DAPI II counterstain (Vysis) trước khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Chun Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Hình 1: Cấu trúc đoạn dò 11q23 sử dụng trong kỹ thuật FISH. Đoạn dò gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm tại vùng từ exon 6 hướng về tâm trải dài 350kb, đoạn dò gắn chất phát huỳnh quang màu đỏ nằm tại vùng từ exon 6 hướng về vùng đầu tận trải dài 190kb, điểm gãy nằm tại exon 6 của gen MLL. KẾT QUẢ Trong nghiên cứu này, 76 BN BCCDL‐B được khảo sát bất thường NST 11q23. Kết quả được xác định khi phân tích 200 tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang. BN có bất thường NST 11q23 khi kết quả thể hiện có một tín hiệu vàng (của NST 11 bình thường), một tín hiệu A xanh và một tín hiệu đỏ (của NST 11 bị gãy tại vị trí 11q23) theo như Hình 2A. BN khơng có bất thường NST 11q23 khi kết quả thể hiện có hai tín hiệu màu vàng (Hình 2B). Tỷ lệ bất thường NST 11q23 được nhận diện dựa vào số lượng tế bào có tín hiệu một xanh, một đỏ và một vàng trên 200 tế bào. B Hình 2: Kết quả FISH khảo sát bất thường NST 11q23 trên BN BCCDL‐B. Có tái sắp xếp NST 11q23 (2A) và NST 11q23 bình thường (2B). Trong đó, tín hiệu vàng là của NST 11q23 bình thường, tín hiệu xanh và đỏ là của NST 11q23 bị gãy. Huyết Học 239 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Trong 76 BN BCCDL‐B được khảo sát, có 6 BN có TSX NST 11q23, chiếm tỷ lệ 7,89%. Trong 6 trường hợp có TSX NST 11q23 thì 5 BN có tỷ lệ bất thường cao, trên 90% tế bào được khảo sát và 1 BN có tỷ lệ bất thường NST 11q23 thấp hơn (43,5%) (Bảng 1). Bảng 1: Kết quả FISH, RT‐PCR và NST đồ của BN BCCDL‐B có bất thường NST 11q23 STT MÃ NGHIÊN CỨU 11q23-F01 11q23-F11 11q23-F36 11q23-F46 11q23-F64 11q23-F76 NĂM SINH NAM NỮ 1946 2001 2012 1976 2011 1995 Kết FISH Kết RT-PCR 11q23 pos 96% 11q23 pos 97,5% 11q23 pos 97% 11q23 pos 43,5% 11q23 pos 96,5% 11q23 pos 93% (+) MLL/AF4 (+) MLL/AF4 (+) MLL/AF4 (+) MLL/AF4 (-) MLL/AF4 (+) MLL/AF4 BÀN LUẬN Trong 6 BN có TSX NST 11q23 được phát hiện bằng kỹ thuật FISH thì có 2 BN được chỉ định làm xét nghiệm NST đồ và kết quả cho thấy 2 BN này có chuyển vị t(4;11)(q21;q23) (Hình 3B). Điều này cho thấy sự tương đồng giữa kết quả FISH và NST đồ trong khảo sát bất thường NST 11q23. Đồng thời, khi chúng tôi đối A Kết NST 46,XY,t(4;11)(q21;q23)/46XY 46,XX,t(4;11)(q21;q23/46XX chiếu kết quả FISH của 6 BN có biểu hiện TSX NST 11q23 với kết quả RT‐PCR thì có 5 BN biểu hiện tổ hợp gen MLL/AF4 và một bệnh nhân khơng biểu hiện MLL/AF4. Như vậy, trong số 6 BN phát hiện có TSX NST 11q23 thì có 5 trường hợp (6,58%) là có chuyển vị t(4;11)(q21;q23) và một trường hợp là chuyển vị NST 11q23 với NST khác, có thể là t(11;19), t(9;11), B C Hình 3: Kết quả FISH, NST đồ và RT‐PCR khảo sát bất thường NST 11q23 trên BN mã số 11q23‐F76. Kết quả FISH có 3 tín hiệu, gồm một tín hiệu vàng là của NST 11 bình thường, 1 tín hiệu xanh và 1 tín hiệu đỏ của NST 11 bị gãy tại vị trí 11q23 (3A); chuyển vị t(4;11)(q21;q23) trên NST đồ (3B.); kết quả RT‐PCR thì cho thấy có sự biểu hiện của tổ hợp gen MLL/AF4, do chuyển vị t(4;11)(q21;q23) tạo ra (3C). Trong nghiên cứu này, tỷ lệ BN BCCDL‐B có TSX NST 11q23 là 7,89%. Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu của một số tác giả khác, như trong nghiên cứu của Soszynska K và cộng sự cho thấy tỷ lệ bất thường NST 11q23 trên BCCDL Ba Lan là 7,14% (8). Theo kết quả của Bảng 1, có đến 5/6 BN TSX 11q23 là chuyển vị t(4;11) và kết quả này nhận diện được dựa vào kết quả khảo sát tổ hợp gen MLL/AF4 với kỹ thuật RT‐PCR giúp chúng ta biết chính xác 240 chuyển vị NST. BN BCCDL‐B có TSX 11q23 và đặc biệt chuyển vị NST thường gặp là t(4;11) được chứng minh là yếu tố tiên lượng xấu nên việc xác định TSX 11q23 có giá trị quan trọng trong việc xếp nhóm điều trị cho BN. KẾT LUẬN BV.TMHH đã xây dựng thành cơng kỹ thuật FISH sử dụng các đoạn dò đặc hiệu giúp xác định các bất thường NST, trong đó có bất Chun Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 thường NST 11q23 một cách nhanh chóng, chính xác, trên một lượng mẫu nhỏ giúp ích cho việc phân nhóm tiên lượng và lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân. TÀI LIỆU THAM KHẢO Harrison CJ, Cuneo A, Clark R, et al (1998). Ten novel 11q23 chromosomal partner sites. European 11q23 Workshop participants. Leukemia, 12 (5), 811‐22. Kaushansky K, Beutler E, Seligsohn U, et al (2010). Neoplastic Lymphoid Diseases. Chapter 93: Acute Lymphoblastic Leukemia.Williams Hematology. Negrin R, Storb R, Forman S (1998). Bone marrow tranplantation in malignant disease Hematology, 342‐357. Nguyễn Bích Trân, Huỳnh Thị Bích Huyền, Huỳnh Nghĩa (2007). Nghiên cứu ứng dụng điều trị tấn cơng bệnh bạch cầu cấp lympho cho trẻ em bằng phác đồ FRALLE 2000. Đề tài cấp cơ sở. BV Truyền máu Huyết học TP.HCM. Pui CH, Robison LL, Look AT (2008). Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 371 (9617), 1030‐43. Huyết Học Nghiên cứu Y học Rubnitz JE, Pui CH (1997). Childhood acute lymphoblastic leukemia. The Oncologist; 2, 374‐380. Secker‐Walker LM, Moorman AV, Bain BJ, et al (1998). Secondary acute leukemia and myelodysplastic syndrome with 11q23 abnormalities. EU Concerted Action 11q23 Workshop. Leukemia, 12 (5), 840‐4. Soszynska K, Mucha B, Debski R, et al (2008). The application of conventional cytogenetics, FISH, and RT‐PCR to detect genetic changes in 70 children with ALL. Ann Hematol: 991‐1002. Võ Thị Thanh Trúc (2010). Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ở trẻ em bằng phác đồ FRALLE‐2000. Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú, Đại học Y Dược Tp. HCM. 10 Young DB (2002). Molecular cytogenetics of leukemia. Leukemia. 7th edition. In: Henderson SE, Lister AT, Greaves FM(Eds). Sauders, USA, 69‐84. Ngày nhận bài báo: Ngày phản biện nhận xét bài báo: Ngày bài báo được đăng: 18/11/2013 30/11/2013 05/01/2014 241 ... 11q23 được nhận diện dựa vào số lượng tế b o có tín hiệu một xanh, một đỏ và một vàng trên 200 tế b o. B Hình 2: Kết quả FISH khảo sát b t thường NST 11q23 trên BN BCCDL B. Có tái sắp xếp NST 11q23 (2A) và NST 11q23 b nh thường ( 2B) . Trong đó, tín hiệu vàng là của NST 11q23 b nh thường, tín hiệu xanh và đỏ là của NST 11q23 b ... khác nhau, được tìm thấy trên b nh BCCDL precursor B, b ch cầu cấp dòng tủy, hội chứng loạn sinh tủy, vài trường hợp BCCDL‐T, và trong b nh ung thư máu thứ phát(1,7). Chuyển ... Trong 76 BN BCCDL B được khảo sát, có 6 BN có TSX NST 11q23, chiếm tỷ lệ 7,89%. Trong 6 trường hợp có TSX NST 11q23 thì 5 BN có tỷ lệ b t thường cao, trên 90% tế b o được khảo sát