Đang tải... (xem toàn văn)
Nội dung của bài viết trình bày về phân loại nhóm nguy cơ cao u nguyên bào thần kinh kết hợp đặc điểm lâm sàng và quy trình PCR định lượng xác định khuếch đại MYCN, góp phần định hướng liệu trị can thiệp cá thể dựa vào phân loại nhóm nguy cơ để tác động hiệu quả hơn trong liệu trị ung thư.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN LOẠI NHĨM NGUY CƠ CỦA U NGUYÊN BÀO THẦN KINH KHUYẾCH ĐẠI MYCN Trương Đinh Kiều Diễm*, Nguyễn Nhật Quỳnh Như*, Võ Văn Thành Niệm*, Nguyễn Thị Hà Giang*, Bùi Thị Thanh Huyền**, Tô Thùy Nhi**, Vũ Trường Nhân**, Nguyễn Đình Văn**, Hồ Trần Bản*, Trương Đình Khải*, Carol J.Thiele***, Bùi Chí Bảo* TĨM TẮT Mục tiêu: Phân loại nhóm nguy cao UNBTK kết hợp đặc điểm lâm sàng quy trình PCR định lượng xác định khuyếchđại MYCN Phương pháp nghiên cứu: Có 60 khối UNBTK phân thành nhóm: (1) nhóm mơ tách chiết DNA để phân tích với dấu ấn di truyền như: MYCN kĩ thuật PCR định lượng (qPCR) kiểm tra với tế bào dòng có khơng khuếch đại MYCN Kết phân tích tương quan với đặc tính sinh học với đặc trưng lâm sàng Kết quả: Nghiên cứu thu nhận 60 hệ DNA từ mô sinh thiết nuôi cấy thành công 5/60 khối tế bào sơ cấp thu từ sinh thiết UNBTK thuộc nhóm nguy cao Nhóm khuyếch đại MYCN chiếm 11/60 (khoảng 18,3%) có tương quan với dòng tế bào khuyếch đại MYCN Nghiên cứu góp phần định hướng liệu trị can thiệp cá thể dựa vào phân loại nhóm nguy để tác động hiệu liệu trị ung thư Kết luận: Chúng xây dựng thành công quy trình định lượng khuếch đại MYCN phương pháp qPCR Từ góp phần hỗ trợ cho việc tiên lượng điều trị nguy UNBTK Đề tài hỗ trợ quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia Nafosted, mã số 106-YS.06-2014.48 Từ khóa: U nguyên bào thần kinh, phân nhóm nguy cơ, MYCN, FISH, qPCR ABSTRACT MYCN STRATIFICATION OF RISK IN NEUROBLASTOMA BY BY Q-PCR Truong Dinh Kieu Diem, Nguyen Nhat Quynh Nhu, Vo Van Thanh Niem, Nguyen Thi Ha Giang, Bui Thi Thanh Huyen, To Thuy Nhi, Vu Truong Nhan, Nguyen Dinh Van, Ho Tran Ban, Truong Dinh Khai, Carol J.Thiele, Bui Chi Bao * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No - 2015: - Objective: Since MYCN amplification is closely associated to high-stage neuroblastomas and an inverse correlation with clinical neuroblastoma stages, the aims are to study amplified MYCN classified the risk groups by quantitative PCR Methods: A total of 60 NBs will be assigned into groups: (1) tissue genomic DNA was extracted for MYCN amplification by quantitative PCR (qPCR) and confirmed with control cell lines (with or without MYCN amplification) Results: The study has collected DNA from 60 tissue biopsy system and successfully cultured primary cells 5/60 blocks from biopsies obtained NB high risk group MYCN amplification Group occupies 11/60 (approximately 18.3%) and correlated with MYCN amplified cell lines * Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh ** Bệnh viện Nhi Đồng ***Pediatric Oncology Branch, Center for Cancer Research Tác giả liên lạc: TS.BS Bùi Chí Bảo, ĐT: 0909708225, Email: bcbao@ump.edu.vn Chuyên Đề Ngoại Nhi Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Conclusion: This study contributes highly to the molecular control of MYCN based marker to stratify the NB risks and further help clinicians to work more effectively in cancer treatment Key words: Neuroblastoma, risk stratification, MYCN, FISH, qPCR lượng bệnh u nguyên bào thần kinh như: ĐẶT VẤN ĐỀ đoạn cánh ngắn nhiễm sắc thể số (1p) (gặp U nguyên bào thần kinh (UNBTK) khối u khoảng 35% trường hợp u nguyên bào thần đặc nằm hộp sọ phổ biến nguyên kinh) đoạn cánh dài NST số 11 (11q) nhân gây 15% ca tổng số ca tử vong có (gặp 43% trường hợp u nguyên bào thần kinh), liên quan đến ung thư trẻ em (5) Mặc dù có thêm đoạn cánh dài NST số 17 (17q) (gặp khoảng nhiều kết hợp phương pháp điều trị đa mô 50% trường hợp)(2) Những biến đổi di truyền phương thức đại, bao gồm hóa trị, giải có tiên lượng xấu, tiên lượng tái phẫu, xạ trị, cấy tế bào gốc, tác động biệt hóa phát việc điều trị u nguyên bào Retinoic acid kể liệu pháp miễn dịch, thần kinh đa số bệnh nhân UNBTK giai đoạn trễ (giai Như có nhu cầu cho thị sinh học giúp đoạn IV) có tỉ lệ sống sót năm bệnh việc chẩn đoán theo dõi điều trị nhân thấp 40% (5,6) Nhu cầu thị sinh bệnh nhân UNBTK cần thiết Ngoài ra, việc học cải thiện phương pháp phân tầng sàng lọc tế bào gốc ung thư mục tiêu cho thuốc nguy bệnh lý phát triển ngăn chặn tình trạng tái phát diễn chiến thuật trị liệu có hiệu nhằm cải góp phần hỗ trợ cho chiến lược điều trị đa mô thiện kết điều trị cần thiết, nhiên thức ung thư chưa xây dựng phát triển Một vài Mục tiêu nghiên cứu thị di truyền phân tử nhằm tiên lượng kết điều trị tốt Calreticulin gene mục tiêu Nghiên cứu phân loại nhóm nguy cao TrkA, GRP75, B4GALNT3 tiên lượng UNBTK kết hợp đặc điểm lâm sàng quy trình xấu MYCN, ALK, ATRX bất thường PCR định lượng xác định khuyếch đại MYCN cấu trúc NST -1p, -11q, +17q, nghiên cứu(8,10) MYCN - gen tiền ung thư nằm cánh ngắn NST số (2p24)(10,4) Sự khuyếch đại MYCN thường gặp giai đoạn muộn (III, IV) u nguyên bào thần kinh tiên phát bệnh nhân chưa điều trị, phát u nguyên bào thần kinh có độ ác tính cao, với tỷ lệ gặp khoảng 20-25%(3) Đối với u nguyên bào thần kinh có khuyếch đại gen MYCN dù lứa tuổi hay giai đoạn bệnh nào, có tiên lượng xấu, tỷ lệ sống năm năm bệnh nhân khoảng 30%(4,1) Ngồi ra, có số biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể khác, tồn độc lập có mối liên quan chặt chẽ với khuyếch đại gen MYCN có ý nghĩa quan trọng tiên ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu mô UNBTK thu nhận từ bệnh viện Nhi Đồng Thu nhận mẫu Mẫu mô thu nhận bệnh viện Nhi đồng Mẫu mô sau trình phẫu thuật giữ mơi trường DMEM, 10% huyết bào thai bê (Fetal bovine serum - FBS), 1% penicillin streptomycin chuyển đến phòng thí nghiệm Trung tâm Y Sinh học phân tử 24 Phân lập nuôi cấy tế bào SH-SY5Y dòng tế bào neuroblastoma khơng khuyếch đại MYCN IMR-32 khuyếch đại MYCN ni trì mơ tả trước (NCI, Carol Thiele Lab) Cấy chuyền thực Chuyên Đề Ngoại Nhi Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 thao tác tách tế bào cách sử dụng 0,25% trypsin / EDTA 1% Trong nghiên cứu tế bào ung thư sơ cấp thu nhận từ sinh thiết từ khối mô nuôi môi trường DMEM bổ sung 10% huyết thai bò (FBS), 1% penicillin streptomycin, 370C, 5% CO2 Thu nhận mẫu Mẫu mô thu nhận bệnh viện Nhi đồng II Mẫu mô sau q trình phẫu thuật giữ mơi trường DMEM, 10% huyết bào thai bê (Fetal bovine serum - FBS), 1% penicillin streptomycin chuyển đến phòng thí nghiệm Trung tâm Y Sinh học phân tử 24 Nghiên cứu Y học phản ứng (khơng có tượng hai mồi bắt cặp với (dimer primers) sản phẩm không đặc hiệu khác) Phân tích liệu Phương pháp so sánh Ct để tính số DNA MYCN (2p24) UNBTK Chu kỳ ngưỡng sử dụng để xác định giá trị Ct cho mẫu Ct định nghĩa phân đoạn chu kỳ PCR mà tín hiệu huỳnh quang đạt giá trị ngưỡng Công thức ΔCt để chuyển đổi giá trị Ct thành số với hiệu chuẩn (mẫu đối chứng DNA bình thường) số thiết lập sau: Q = E∆Ct(1) Tách chiết DNA Q = E(Ct gen kiểm soát nội - Ct gen MYCN) (2) DNA tách chiết từ khối u Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) Trong đó: Khối u cắt thành miếng nhỏ đồng dung dịch PBS Dịch mô ủ với Nuclei Lysis Solution 65ºC làm lạnh đến nhiệt độ phòng Bổ sung Protein Precipitation Solution vào hỗn hợp ly giải, ủ đá phút ly tâm hỗn hợp tốc độ cao 15 phút 4ºC Thu dịch chứa DNA Thêm isopropanol với tỷ lệ 1: trộn dung dịch xuất sợi trắng DNA Ly tâm tốc độ cao 10 phút 4ºC Loại bỏ dịch nổi, rửa mẫu Ethanol 70% để khô tự nhiên Hòa tan DNA dung dịch DNA Rehydration 65ºC máy ủ lắc DNA lưu trữ 20ºC để sử dụng sau Phương pháp PCR định lượng (qPCR) Mẫu DNA sau tách chiết tiến hành chạy Realtime-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen NMyc gen POLR2D (gen kiểm soát nội bộ) SYBR Green I Takara Kit, theo chu trình nhiệt 950C phút, 950C 15 giây, 600C phút, 40 chu kỳ Đối với phản ứng qPCR cần thiết lập phân tích đường cong nóng chảy → phân tích điểm chảy (melting curve) để đảm bảo tính đặc hiệu ống Chuyên Đề Ngoại Nhi - Q giá trị biểu diễn khác biệt gen bệnh so với gen chứng nội - E hiệu suất phản ứng QPCR (khi hiệu suất đạt 100% E = 2) (De Preter, Speleman et al 2002, Ryan S McCulloch et al 2012) Sử dụng cơng thức định lượng để tính ∆ Ct, ∆ Ct ≥ kết luận MYCN khuếch đại, ngược lại ∆ Ct < kết luận MYCN khơng khuếch đại Lai huỳnh quang chỗ NST với tế bào thu từ khối u NB Mẫu mô bảo quản mơi trường DMEM vận chuyển phòng thí nghiệm Cắt nhỏ mô ủ trypsin 1X 30 phút Lọc ly tâm thu tế bào, cố định dung dịch Carnoy (3 methanol: acid acetic) sau nhỏ dung dịch tế bào lên lam kính đánh dấu vùng tế bào, để khơ Để probe nhiệt độ phòng đến khị tự rã đơng hồn tồn Nhỏ probe lên vùng tế bào đánh dấu sau đậy miếng kính mỏng dán keo Đặt vào tủ lai với chương trình sau: 750C phút, 370C 18 Sau lai, rửa lam kính dung dịch rửa 2X SSC phút 720C, để khô tự nhiên, Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 nhuộm nhân với DAPI Quan sát hình ảnh probe, Các tế bào bình thường có tính hiệu đỏ (gen MYCN) tính hiệu xanh cho gen chứng nội (LAF) Các tế bào khuếch đại N-myc có nhiều hai tín hiệu đỏ Slides lưu trữ -200C xuất (Hình 2) Lai FISH cho thấy số tế bào ung thư tách chiết từ khối mơ có xuất khuếch đại MYCN (Hình 3) Phân tích thống kê So sánh nhóm thực cách sử dụng phần mềm GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA) gói số liệu thống kê R (R, phiên 2.15.1; http://www.r-project.org/) Giá trị P xác định việc sử dụng t-test (twotailed unpaired t-test) lơ tạo R KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hình 2: Giải phẫu bệnh khối u nhúng paraffin phân tích với Haemotoxylin Eosin Sự xâm lấm bất thường tế bào vào vùng giáp ranh () vào stroma (*) u ác tính có xâm lấn Phân lập ni cấy tế bào ung thư sơ cấp Mẫu khối UNBTK tách tế bào đơn biện pháp học nuôi cấy môi trường DMEM bổ sung 10% FBS Sự tăng sinh tế bào ghi nhận 12 ngày (Hình 1) B A Hình 3: Kết FISH mẫu u nguyên bào thần kinh A Không khuếch đại MYCN, B: Khuếch đại MYCN Hình 1: Kết nuôi cấy sơ cấp tế bào đơn thu nhận từ mẫu khối UNBTK (x20) Kết nhuộm Hematoxiline – Eosin cho mô nhúng paraffin FISH Đầu tiên chúng tơi thu thập kiểm tra hình thái giải phẫu bệnh (Hình 2) lai huỳnh quang chỗ (Hình 3) mơ UNBTK Trong phiến, nhóm tế bào ung thư đặc trung UNBTK nhìn thấy rõ nhuộm HE Bên cạnh tế bào stroma hệ mạch Kết kiểm tra độ nhạy mẫu DNA bệnh nhân Tiến hành kiểm tra độ nhạy mẫu DNA bệnh nhân với tỉ lệ phần trăm DNA khối u khác tương ứng 20%, 40% 60% Nghĩa lấy 20% mẫu DNA từ khối u chẩn đoán UNBTK kết hợp với 80% mẫu DNA bình thường Đối với tỉ lệ phần trăm DNA khối u 40% 60% làm tương tự trên.Gen POLR2D sử dụng gen chứng nội phản ứng qPCR Sau thực phản ứng qPCR, kết giá trị Ct có bảng số Chuyên Đề Ngoại Nhi Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Bảng 1: Kiểm tra độ nhạy mẫu DNA bệnh nhân Lượng DNA (%) DNA DNA mẫu Ct MYCN Ct POLR2D ∆Ct u nguyên bào bình thần kinh thường 80 60 40 20 40 60 20,83 21,01 21,29 21,43 21,70 22,66 0,6 0,69 1,37 Nhận xét: Từ kết qPCR cho thấy: với tỉ lệ 20% mẫu DNA chẩn đoán UNBTK đủ lớn để phát tín hiệu huỳnh quang có giá trị ΔCt = 0,6, với tỉ lệ 40% mẫu DNA chẩn đốn UNBTK giá trị ΔCt cao so với 20% (ΔCt = 0,69) Tương tự, với tỉ lệ 60% mẫu DNA chẩn đoán UNBTK giá trị ΔCt cao so với 40% (ΔCt = 0,77) Kết luận: Với tỉ lệ % mẫu DNA chẩn đốn UNBTK cao cho kết qPCR chuẩn xác, nhạy hiệu phản ứng cao Tỉ lệ % tối ưu chọn 20% Điều chứng tỏ qPCR có độ nhạy cao, cần lượng nhỏ DNA phát Kết tối ưu hóa nồng độ DNA Bảng 2: Tối ưu hóa nồng độ DNA ban đầu Lượng DNA Ct MYCN Ct POLR2D 0,1 ng 32,07 ng 29,10 10 ng 25 ng 25,68 24,81 33,16 32,21 ∆Ct Giá trị không ý nghĩa Giá trị không ý nghĩa 7,48 7,4 Nghiên cứu Y học Nhận xét: Tiến hành kiểm tra lượng DNA ban đầu để xác định nồng độ tối thiểu DNA cần cho phản ứng QPCR cách thử nghiệm với lượng DNA ban đầu khác 0,1 ng, ng, 10 ng, 25 ng Biết nồng độ tối thiểu từ sử dụng lượng DNA thích hợp cho phản ứng QPCR sau cho hiệu phản ứng cao, đồng thời tiết kiệm thời gian vật liệu phản ứng Kết cho thấy, với nồng độ DNA 0,1 ng ng lượng DNA khơng đủ lớn để phát tín hiệu huỳnh quang Bắt đầu từ nồng độ 10 ng lượng DNA ban đầu đủ lớn để phát tín hiệu huỳnh quang Điều cho thấy, nồng độ DNA tối ưu 10 ng Kết luận: Lượng DNA ban đầu nhiều tín hiệu huỳnh quang xuất sớm (xem hình 2) phản ứng đạt hiệu cao Kết MYCN (2p24) khuếch đại mẫu u nguyên bào thần kinh Tiến hành 10 mẫu mơ (n = 10) chuẩn đốn UNBTK phân tích qPCR Chi tiết kết trình bày bảng Các mẫu xem có MYCN khuếch đại số lượng MYCN lớn 10 Bảng 3: Danh sách bệnh nhân, chẩn đoán lâm sàng kết số gen MYCN mẫu UNBTK.Ghi chú: X khuếch đại, O không khuếch đại Trường hợp Tuổi Giai đoạn Nồng độ DNA (ng/µl) Ct MYCN Ct POLR2D ∆Ct Số (2x2∆Ct) 20 tháng 535 23,41 23,77 0,36 O tuổi 22,69 23,16 0,47 O tuổi Không xác định 419 24,97 25,75 0,78 O tuổi Không xác định 989 23,33 23,72 0,39 O tháng tuổi 779 22,84 24,33 1,49 tuổi Không xác định 130 26,14 29,05 2,91 15 X Không xác định 20 15,25 22,68 7,43 344 X tuổi Không xác định 1539 28,25 33,84 5,59 96 X tuổi -19 26,49 28,04 1,55 10 11 tháng tuổi Không xác định 46 23,82 30,48 6,66 202 Chuyên Đề Ngoại Nhi Khuếch đại Không khuếch (+) đại (-) O O X Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nhận xét: Kết qPCR với 10 mẫu mơ chẩn đốn UNBTK, có mẫu MYCN khuếch đại (40%) mẫu không khuếch đại (60%) Theo kết thống kê từ bảng, MYCN khuếch đại có trường hợp với số tương ứng 15, 344, 96 202 Từ kết cho thấy hầu hết trường hợp có gen MYCN khuếch đại DNA tách chiết từ mẫu khối u bệnh nhân UNBTK chẩn đoán giai đoạn Những trường hợp lại, có thay đổi số lượng MYCN không đủ để kết luận có khuếch đại MYCN Tóm lại, số gen MYCN phụ thuộc vào độ tuổi, giai đoạn lâm sàng UNBTK BÀN LUẬN Mục tiêu nghiên cứu phát triển đánh giá khuếch đại MYCN phương pháp qPCR để phát nguy cao UNBTK Các kết nghiên cứu không mở rộng việc nghiên cứu phát triển phương pháp chẩn đoán chẩn đoán sớm UNBTK việc giúp bác sĩ dự đoán nguy ung thư cao thấp Việt Nam mà cung cấp thơng tin độ tuổi, giai đoạn lâm sàng, nồng độ tối ưu phản ứng qPCR, cho lĩnh vực nghiên cứu ung thư tồn giới, góp phần vào phát triển phương pháp chẩn đoán điều trị phòng ngừa bệnh ung thư mà cải thiện chất lượng sống cho người qPCR cho phép phân tích với lượng DNA nhỏ, cung cấp phạm vi hoạt động định lượng rộng xác giá trị MYCN khuếch đại (2p24) Ngoài ra, xác định khuếch đại MYCN thành phần quan trọng lâm sàng phân tầng nguy bệnh định điều trị dựa kết xét nghiệm Nghiên cứu tảng cho việc triển khai nghiên cứu sâu khơng có giá trị chẩn đốn mà phân tầng nguy bệnh nhân UNBTK Độ nhạy phản ứng qPCR để phát MYCN khuếch đại xác định thí nghiệm pha lỗng với MNA tế bào bình thường Kết qPCR cho thấy, với tỉ lệ 20% DNA tế bào khối u chẩn đốn UNBTK phát MYCN khuếch đại Điều chứng tỏ rằng, qPCR phương pháp có độ nhạy cao, phát MYCN khuếch đại với lượng nhỏ DNA Lượng DNA ban đầu thành phần quan trọng phản ứng qPCR Nếu lượng DNA ban đầu nhiều cần chu kỳ nhiệt để đạt đến số lượng đủ để phản ứng cho tín hiệu huỳnh quang, lượng DNA ban đầu cần nhiều chu kỳ nhiệt Theo nghiên cứu số báo quy trình Kit Takara, lượng DNA ban đầu dao động từ 10 ng đến 100 ng Trong nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa nồng độ DNA ban đầu, tất kết thu dựa phản ứng qPCR thực với lượng DNA ban đầu 25 ng Trong tháng, 10 mẫu mô UNBTK thu thập phân tích biểu khuếch đại MYCN qPCR Trong 10 mẫu khối u, có trường hợp xác định khuếch đại MYCN trường hợp khơng có biểu khuếch đại MYCN, có nghĩa tỷ lệ phần trăm khuếch đại MYCN chiếm 40% tổng số bệnh nhân UNBTK Tỷ lệ tương đối giống so với báo cáo khác (10) Các kết không khuếch đại trường hợp lại, có thay đổi số lượng MYCN không đủ để kết luận có khuếch đại MYCN Mặc dù trường hợp bác sĩ chuẩn đoán giai đoạn IV khơng có biểu khuếch đại trường hợp 6, 7, 8, 10 số lý Thứ nhất, tỷ lệ khuếch đại MYCN giai đoạn III IV chiếm khoảng 30 - 40% so với giai đoạn khác Thứ hai, giai đoạn UNBTK khuếch đại khơng có tương quan, nghĩa giai đoạn UNBTK không ảnh hưởng đến việc liệu khuếch đại Vì vậy, Chuyên Đề Ngoại Nhi Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 trường hợp áp đảo thuộc thành nhóm nguy trung bình thấp, trường hợp phân loại nhóm có nguy cao Cuối cùng, dựa kết thu được, kết luận thành công việc khuếch đại đoạn gen MYCN (2p24) kỹ thuật qPCR bệnh UNBTK kết phù hợp với báo cáo nghiên cứu trước KẾT LUẬN Chúng xây dựng thành công quy trình định lượng khuếch đại MYCN phương pháp qPCR Từ góp phần hỗ trợ cho việc tiên lượng điều trị nguy UNBTK Đề tài hỗ trợ quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia Nafosted, mã số 106-YS.062014.48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ambros PF, et al (2009) International consensus for neuroblastoma molecular diagnostics: report from the International Neuroblastoma Risk Group (INRG) Biology Committee Br J Cancer, 100(9): p 1471-82 Baker DL, et al (2010) Outcome after reduced chemotherapy for intermediate-risk neuroblastoma New England Journal of Medicine, 363(14): p 1313-1323 Chuyên Đề Ngoại Nhi 10 Nghiên cứu Y học Cohn SL, et al (2009) The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system: an INRG Task Force report J Clin Oncol, 27(2): p 289-97 Kaneko M, et al (2002) Intensified chemotherapy increases the survival rates in patients with stage neuroblastoma with MYCN amplification J Pediatr Hematol Oncol, 24(8): p 613-21 Maris JM (2010) Recent advances in neuroblastoma N Engl J Med,362(23): p 2202-11 Matthay KK, et al (2009) Long-term results for children with high-risk neuroblastoma treated on a randomized trial of myeloablative therapy followed by 13-cis-retinoic acid: A children's oncology group study Journal of Clinical Oncology, 27(7): p 1007-1013 Mestdagh P, Van Vlierberghe P, De Weer A, Muth D (2009) Novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization, Genome Biology, 10 (6), art No, R64 Mosse YP, et al (2008) Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene Nature, 455(7215): p 930-5 Ora I, A Eggert (2011) Progress in treatment and risk stratification of neuroblastoma: impact on future clinical and basic research Semin Cancer Biol, 21(4): p 217-28 Tomioka N, et al (2008) Novel risk stratification of patients with neuroblastoma by genomic signature, which is independent of molecular signature Oncogene, 27(4): p 441-9 Ngày nhận báo: 21/08/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 22/08/2015 Ngày báo đăng: 01/10/2015 ... hi u cao Kết MYCN (2p24) khuếch đại m u u nguy n bào thần kinh Tiến hành 10 m u mô (n = 10) chuẩn đốn UNBTK phân tích qPCR Chi tiết kết trình bày bảng Các m u xem có MYCN khuếch đại số lượng MYCN. .. B A Hình 3: Kết FISH m u u nguy n bào thần kinh A Không khuếch đại MYCN, B: Khuếch đại MYCN Hình 1: Kết ni cấy sơ cấp tế bào đơn thu nhận từ m u khối UNBTK (x20) Kết nhuộm Hematoxiline – Eosin... ban đ u 25 ng Trong tháng, 10 m u mơ UNBTK thu thập phân tích bi u khuếch đại MYCN qPCR Trong 10 m u khối u, có trường hợp xác định khuếch đại MYCN trường hợp khơng có bi u khuếch đại MYCN, có