Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định tỷ lệ biểu hiện tích tụ quá mức protein p53 trong carcinôm tuyến đại trực tràng bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Nghiên cứu tiến hành trên 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng được chẩn đoán và nhuộm hóa mô miễn dịch với p53 tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại học Y dược Tp. HCM từ tháng 10/2008 đến tháng 4/2009.
BIỂU HIỆN TÍCH TỤ Q MỨC PROTEIN P53 TRONG CARCINƠM TUYẾN ĐẠI TRỰC TRÀNG Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Thành Nam** TÓMTẮT Mục tiêu: Xác định tỷ lệ biểu tích tụ q mức protein p53 carcinơm tuyến đại trực tràng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch (HMMD) Phương pháp: Mô tả cắt ngang Đối tượng nghiên cứu gồm 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng chẩn đoán nhuộm HMMD với p53 Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại học Y dược Tp HCM từ tháng 10/2008 đến tháng 4/2009 Kết quả: Có 49 bệnh nhân nam (chiếm 46,2%) 57 bệnh nhân nữ (chiếm 53,8%) Giới nữ mắc bệnh nhiều giới nam khoảng 16% (tỷ lệ nam/nữ = 1/1,16) Tuổi mắc bệnh trung bình 58,08, bệnh nhân sau 40 tuổi chiếm 91,5% Vị trí u: U đại tràng phải có 31 trường hợp (29,5%), u đại tràng trái có 74 trường hợp (70,5%) Dạng đại thể: Dạng loét thường gặp chiếm 47,2%; thứ hai dạng chồi sùi chiếm 40,6%; dạng vòng siết, xâm nhiễm dạng phối hợp gặp hơn, với tỷ lệ 4,7%, 5,7% 1,9% Loại mô học: Carcinôm tuyến không chế nhầy chiếm 86,8%, carcinôm tuyến chế nhầy chiếm 13,2% Tỷ lệ biểu tích tụ mức protein p53 HMMD 50% Liên quan khơng có ý nghĩa thống kê biểu tích tụ protein p53 UTĐTT với giới (p = 0,33), tuổi (p = 0,29), vị trí u (p = 0,56), dạng đại thể (p = 0,26) Liên quan có ý nghĩa thống kê biểu tích tụ protein p53 với loại mơ học (p=0,022) Kết luận: p53 biểu mức 50% carcinơm tuyến đại trực tràng liên có ý nghĩa thống kê với lọai mơ học Từ khóa: carcinơm tuyến đại trực tràng, protein p53 ABSTRACT OVEREXPRESSION OF PROTEIN P53 IN COLORECTAL ADENOCARCINOMA Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Thanh Nam * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 14 - No – 2010: 143 - 147 Objective: To determine the rate of protein p53 overexpression in colorectal adenocarcinoma by using immunohistological technique Methods: A cross- sectional study included 106 cases of colorectal adenocarcinoma The specimens were examined by H&E and stained immunohistochemiscal stain with antibody anti p53 at Pathological department – Medicine and Pharmacy University at HCMC from October/2008 to April 2009 Results: In our study, female occurred slighly more than male (female/male : 57/49); mean age was 58.08, the majority was over 40yo (91.5%) Left colon cancer was predominant (74 cases, 70.5%) On macroscopic examination, ulcerative adenocarcinoma was the most common finding (47.2%), then, 40.6% exophytic, 4.7% annular, 5.7% infiltrative, and 1.9%mixture Histological findings included 86.8% non-mucinous , and 13.2% mucinous adenocarcinoma Protein p53 overexpressed in half of cases In multiple variate analysis, no correlation was found between the overexpression of protein p53 with age, gender, tumor sites and macroscopic findings Correlation between overexpression of protein p53 and histological types was statistic significant (p = 0.022) Conclusion: Overexpression of protein p53 in colorectal adenocarcinoma occupied 50% and correlated significantly with * Bộ môn Giải phẫu bệnh - Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh * Trung Tâm Pháp Y Tỉnh Kiên Giang Địa liên hệ: PGS TS Hứa Thị Ngọc Hà, ĐT: 0908152705 Email: histological types Keywords: colorectal adenocarcinoma, overexpression protein p53 ĐẶTVẤNĐỀ xảy trình hình thành phát triển UTĐTT Ngày với tiến vượt bậc Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) bệnh lý công nghệ phân tử giải đáp rõ ràng chế phức tạp mặt di truyền học Có nhiều đột biến gen sinh ung thư Feason Vogelstein mô tả chuỗi 143 đột biến gen UTĐTT bắt đầu với đột biến gen APC nhánh dài NST số gây biến đổi từ biểu mơ bình thường thành biểu mô tăng sản Một tế bào tăng sản phát triển thành u tuyến nhỏ có gen methyl hóa mức thấp Đột biến liên quan đến tăng hoạt gen sinh ung K-ras nhánh ngắn NST số 12 tạo nên u tuyến trung gian Tiếp theo, gen DCC nhánh dài NST số 18 bị bất hoạt dẫn tới phát triển u tuyến muộn với nghịch sản Đột biến gen cuối tìm thấy UTĐTT đột biến gen đè nén u p53 nhánh ngắn NST số 17(6) Gen p53 gen đè nén u hay bị đột biến ung thư người Gen p53 bình thường hoạt động cách làm tạm dừng chu kỳ tế bào để tiến hành việc sửa chữa sai lệch q trình nhân đơi DNA, làm cho tế bào tự chết theo chương trình Vì gen xem “người bảo vệ” gen Nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 75% UTĐTT thể ngẫu nhiên có biểu bất hoạt gen p53 Sự xác định đột biến gen p53 UTĐTT có ý nghĩa tiên lượng Bệnh nhân có biểu đột biến gen p53 có tiên lượng xấu, thời gian sống thêm ngắn bệnh nhân khơng có biểu đột biến gen p53(6) Trong nước có cơng trình nghiên cứu phía Bắc biểu kháng nguyên p53 UTĐTT hóa mơ miễn dịch (HMMD)(17) Ở phía Nam có cơng trình nghiên cứu biểu p53 ung thư vú HMMD(13) cơng trình nghiên cứu đột biến gen p53 ung thư miệng phương pháp PCR(14), chưa có cơng trình nghiên cứu p53 UTĐTT Vì chúng tơi thực đề tài với mục tiêu xác định tỷ lệ biểu tích tụ q mức protein p53 carcinơm tuyến đại trực tràng phương pháp nhuộm HMMD nhằm làm phong phú thêm nghiên cứu sâu ung thư đại – trực tràng ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Dối tượng nghiên cứu 106 trường hợp carcinơm tuyến đại trực tràng chẩn đốn điều trị Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại học Y dược Tp HCM từ tháng 10/2008 đến tháng 4/2009 Phương pháp nghiên cứu Mô tả cắt ngang Các bước tiến hành Ghi nhận đặc điểm lâm sàng từ phiếu trả lời kết giải phẫu bệnh, gồm: Tuổi, giới, vị trí u, hình ảnh đại thể (dạng loét, chồi sùi, vòng siết, xâm nhiễm dạng phối hợp) Đọc lại tiêu kính hiển vi quang học, khảo sát đặc điểm giải phẫu bệnh theo tiêu chí: + Loại mơ học: Carcinơm tuyến loại không chế nhầy, carcinôm tuyến loại chế nhầy (gồm carcinôm nhầy carcinôm tế bào nhẫn) theo tiêu chuẩn phân loại WHO, 2000 + Độ mô học: Gồm biệt hóa rõ, vừa, khơng biệt hóa (theo phân độ WHO, 2000) Sau tiến hành nhuộm HMMD block paraffin để khảo sát đặc điểm tích tụ q mức protein p53 Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch thực Sửa soạn tiêu - Cắt mỏng mẫu mơ - 5µm, đặt vào lam có tráng silan; - Ủ tiêu nhiệt độ 56oC 1-2 trước nhuộm; - Khử nến xylen sau cho qua cồn tuyệt đối - Khử peroxidase nội sinh dung dịch H2O2 0,5% methanol 10 phút; - Rửa tiêu vòi nước chảy, sau ngâm vào dung dịch TBS (Tris buffer solution) Kháng thể sử dụng Bộc lộ kháng ngun lò vi sóng, sử dụng kháng thể kháng p53, clone DO-7 nhà sản xuất DakoCytomation, với độ pha loãng 1/25 Kỹ thuật phức hợp Avidin-biotin với kháng thể đơn dòng - Cho tiêu vào TBS, sau rửa lượng TBS dư; - Ủ với kháng thể đơn dòng pha lỗng 30-40 phút, rửa tiêu TBS; - Ủ với kháng thể thứ hai có gắn biotin 30 phút, rửa tiêu TBS; - Ủ với phức hợp Avidin-biotin 20 phút, rửa tiêu TBS; - Ủ với dung dịch DAB 5-10 phút; - Rửa tiêu vòi nước chảy, nhuộm màu tương phản với hematoxylin, khử nước dán lamen canada balsam 144 Đánh giá biểu tích tụ mức protein p53 Biểu đồ Sự biểu tích tụ mức protein p53 Dựa vào tỉ lệ % nhân tế bào bắt màu : Tỷ lệ p53 dương tính 50% Trong dương tính 3(+) chiếm tỷ lệ cao với 26 trường hợp (chiếm 24,5%), kế 2(+) với 14 trường hợp (chiếm 13,2%), sau 1(+) với 13 trường hợp (chiếm 12,3%) (18) Âm tính: < 5% bắt màu; Dương tính: > 5% bắt màu 1(+): bắt màu yếu 2(+): bắt màu trung bình 3(+): > bắt màu mạnh Xử lý số liệu Số liệu bảng thu thập tổng hợp, phân tích xử lý phần mềm SPSS 17.0 với phép kiểm chi bình phương Tiêu chuẩn chọn mẫu Tất trường hợp ung thư đại trực tràng chẩn đốn giải phẫu bệnh carcinơm tuyến Tiêu chuẩn loại trừ Các trường hợp thiếu thông tin phiếu trả lời kết giải phẫu bệnh thất lạc block KẾTQUẢNGHIÊNCỨU Trong 106 trường hợp khảo sát, có 49 nam 57 nữ, tỷ lệ nam/nữ = 1:1,16 Độ tuổi thường gặp từ 40 đến 79 tuổi Thấp 20 tuổi, cao 80 tuổi, trung bình 58,08 (± 13,6) Bệnh nhân có độ tuổi sau 40 chiếm 91,5% U đại tràng phải (gồm manh tràng, đại tràng lên, đại tràng góc gan đại tràng ngang) có 31 trường hợp, chiếm 29,5% U đại tràng trái (gồm đại tràng góc lách, đại tràng xuống, đại tràng sigma trực tràng) có 74 trường hợp, chiếm 70,5% Có trường hợp khơng xác định vị trí u Về đại thể, dạng loét thường gặp chiếm 47,2%, dạng chồi sùi chiếm 40,6% Các dạng vòng siết, xâm nhiễm dạng phối hợp gặp hơn, với tỷ lệ 4,7%, 5,7% 1,9% Loại mô học carcinôm tuyến khơng chế nhầy có 92 trường hợp, chiếm 86,8% Loại chế nhầy (gồm carcinôm nhầy carcinôm tế bào nhẫn) có 14 trường hợp, chiếm 13,2% Biểu tích tụ mức protein p53 3(+) 24.5% 2(+) 13.2% 12.3% 1(+) Âm tính 50% Tỷ lệ % 20 40 60 Liên quan biểu p53 với giới, tuổi, vị trí u, hình ảnh đại thể loại mơ học Đặc ñiểm p53 (+) p53 (-) P Nam 22 27 (44,89%) (55,11%) Giới 0,33 Nữ 31 26 (54,38%) (45,62%) 40 47 (48,5%) 50 (51,5%) Đại tràng 14 17 phải (45,16%) (54,84%) Vị trí 0,56 Đại tràng trái 38 36 (51,35%) (48,65%) Loét 28 (56%) 22 (44%) Chồi sùi 21 (49%) 22 (51%) Dạng đại Vòng siết (40%) (60%) 0,26 thể Xâm nhiễm (33,3%) (66,7%) Phối hợp (0%) (100%) Không chế 50 (54,3%) 42 (45,7%) Loại mô nhầy 0,022 học Chế nhầy (21,4%) 11 (78,6%) Bảng cho thấy biểu tích tụ protein p53 khơng khác biệt theo giới, tuổi, vị trí u dạng đại thể Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê biểu tích tụ protein p53 loại mơ học Carcinơm tuyến chế nhầy có tỷ lệ p53 dương tính thấp (21,4%) so với nhóm carcinơm tuyến không chế nhầy BÀNLUẬN Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ p53 dương tính 50% Kết phù hợp với nghiên cứu trước đây, tỷ lệ p53 dương tính phương pháp nhuộm HMMD khoảng từ 30 đến 76%(4,5,8,12,13,15,17) Theo kết nghiên cứu này, bệnh nhân nữ có tỷ lệ p53 dương tính cao bệnh nhân nam (54,38% so với 44,89%) Tuy nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,33) Kết phù hợp với nghiên cứu trước(3,9,11,18) Nghiên cứu cho thấy, nhóm bệnh nhân hay 40 tuổi có tỷ lệ p53(+) cao nhóm bệnh nhân 40 tuổi (66,7% so với 48,5%), nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,29) Kết tương tự với nhiều báo cáo khác 145 khơng có liên quan biểu p53 với tuổi(3,11,18) So sánh biểu tích tụ protein p53 với vị trí u, nghiên cứu cho thấy p53 dương tính đại tràng trái nhiều đại tràng phải (51,35% so với 45,16%) khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,56) Một số nghiên cứu trước cho liên quan có ý nghĩa thống kê biểu p53 vị trí u(9,11) Nhưng số tác giả khác báo cáo ung thư đại tràng trái biểu tích tụ protein p53 nhiều đại tràng phải(4,16) Như biểu tích tụ protein p53 ung thư đại tràng trái có khuynh hướng cao đại tràng phải, gợi ý ung thư đại tràng trái liên quan đến đường đột biến gen p53 củng cố quan điểm cho có khác biệt lâm sàng giải phẫu bệnh đại tràng trái đại tràng phải Theo nghiên cứu chúng tơi, nhóm có hình ảnh đại thể dạng lt cho tỷ lệ p53 dương tính cao nhất, kế nhóm dạng chồi sùi thấp nhóm khác, với tỷ lệ 56%, 49% 31% Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,26) Kết phù hợp với nghiên cứu Trịnh Tuấn Dũng(17), p53(+) u dạng loét nhiều dạng chồi sùi (73,07% so với 40,91%, p < 0,05) Nghiên cứu cho thấy, nhóm carcinơm tuyến chế nhầy cho tỷ lệ p53 dương tính thấp (21,4%) so với nhóm carcinơm tuyến khơng chế nhầy (54,3%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Tác giả Georgescu(5) nghiên cứu 41 trường hợp UTĐTT thấy tỷ lệ p53 dương tính HMMD 58,53% Trong nhóm carcinơm tuyến khơng chế nhầy có 65,71% p53(+), nhóm carcinơm tuyến chế nhầy có 16,66% p53(+), khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05 Theo báo cáo Ince(8), đột biến gen p53, phát giải trình tự gen, nhóm carcinơm tuyến chế nhầy thấy nhóm carcinơm tuyến khơng chế nhầy, p < 0,02 Diéz(2) nghiên cứu 174 trường hợp UTĐTT thấy tỷ lệ p53(+) HMMD 47%, liên quan có ý nghĩa thống kê biểu tích tụ protein p53 loại mơ học định tích tụ q mức protein p53 khơng đo lường xác chức gen p53(9) Sự phù hợp xác định tích tụ mức protein p53 HMMD phân tích gen từ 60-85%(5,7,10) Kết nhuộm HMMD p53 âm tính khơng phải ln ln chứng tỏ khơng có đột biến gen p53 Các đột biến tạo protein bị đoạn, cắt cụt khơng tạo protein khơng thể phát HMMD mà biết phương pháp phân tử(15) Theo Crapez(1), độ tương hợp p53 (+) có đột biến gen p53 71,8%, nhuộm p53 HMMD có độ nhạy 75% giá trị tiên đoán dương cho đột biến gen p53 63% KẾTLUẬN Qua nghiên cứu 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng, nhận thấy tỷ lệ biểu tích tụ mức protein p53 HMMD 50% Liên quan khơng có ý nghĩa thống kê biểu tích tụ protein p53 UTĐTT với giới, tuổi, vị trí u, hình ảnh đại thể Liên quan có ý nghĩa thống kê biểu tích tụ protein p53 với loại mô học TÀILIỆUTHAMKHẢO Ngược lại, số nghiên cứu khác cho thấy khơng có liên quan ý nghĩa tích tụ protein p53 loại mô học(3,11) Đột biến gen p53 tạo protein có thời gian bán hủy dài cho phép phát HMMD(10) Tuy nhiên HMMD cho thấy có tới 30-35% kết trái ngược với phương pháp phân tích gen Vì xác Crapez EL, Bibeau F, The1zenas S, et al (2005), “p53 status and response to radiotherapy in rectal cancer: a prospective multilevel analysis”, British Journal of Cancer, 92, 2114-2121 Diéz M, Pollán M, Mguerza JM, et al (2000), Time-dependency of the prognostic effect of carcinoembryonic antigen and p53 protein in colorectal adenocarcinoma”, Cancer, 88, 35-41 Galizia G, Lieto E, Ferraraccio F, et al (2004), “Determination of molecular marker expression can predict clinical outcome in colon carcinomas”, Clinical Cancer Research, 10, 34903499 Garrity MM, Burgart LJ, et al (2004), “Prognostic value of proliferation, apoptosis, defective DNA mismatch repair, and p53 overexpression in patients with resected Dukes’ B2 or C colon cancer: A North central cancer treatment group study”, J Clin Oncol, 22(9), 1572-1582 Georgescu CV, Săftoiu A, Georgescu CC, et al (2007), “Correlations of proliferation markers, p53 expression and histological findings in colorectal carcinoma”, J Gastrointestin Liver Dis, 16(2), 133-139 Gordon PH (2007), “Malignant neoplasms of the colon”, Neoplasms of the colon, rectum and anus, Informa Healthcare USA Inc, 51-206 146 10 11 12 13 Graziano F, Cascinu S (2003), “Prognostic molecular markers for planning adjuvant chemotherapy trials in Dukes’ B colorectal cancer patients: how much evidence is enough?”, Annals of Oncology, 14, 1026-1038 Ince WL, Jubb AM, Holden SN, et al (2005), “Association of k-ras, b-raf, and p53 status with the treatment effect of Bevacizumab”, Journal of the National Cancer Institute, 97(13), 981-989 Kahlenberg MS, Stoler DL, Bigas MA, et al (2000), “p53 tumor suppressor gene mutations predict decreased survival of patients with sporadic colorectal carcinoma”, Cancer, 88, 18141819 McLeod HL, Murray GI (1999), “Tumour markers of prognosis in colorectal cancer”, British Journal of Cancer, 79(2), 191-203 Morrin M, Kelly M, et al (1994) “Mutations of Kiras and p53 genes in colorectal cancer and their prognostic significance”, Gut, 35, 1627-1631 Nasif WA, El-Emshaty HM, Tabll A, et al (2004), “Immunoreactivity evaluation of mutant p53 gene product with DNA ploidy pattern in colorectal carcinoma”, Hepatogastroenterology, 51 (58), 1001-1006 Nguyễn Sào Trung, Đoàn Thị Phương Thảo, Lê Quốc Sử (2004), “Nghiên cứu biểu 14 15 16 17 18 gen đè nén u p53 ung thư vú kỹ thuật hóa mơ miễn dịch”, Y học Tp Hồ Chí Minh, tập (1), tr.1-7 Nguyễn Thị Hồng, Phạm Hùng Vân, Sakamoto K (2002), “Đột biến gen p53 ung thư miệng: phát qua kỹ thuật PCR-SSCP”, Y học Tp Hồ Chí Minh, chuyên đề ung bướu, tập 6, phụ số 4, tr.52-57 Rambau PF, Odida M, Wabinga H (2008), “p53 expression in colorectal carcinoma in relation to histopathological features in Ugandan patients”, African Health Sciences, 8(4), 234-238 Sinicrope FA, Hart J, Michelassi F, Lee JJ (1995), “Prognostic value of bcl-2 oncoprotein expression in stage II colon carcinoma”, Clinical Cancer Research, 1, 1103-1110 Trịnh Tuấn Dũng (2007), “Nghiên cứu biểu kháng nguyên p53, Ki-67 Her2/Neu ung thư đại trực tràng hóa mơ miễn dịch”, Y học Tp Hồ Chí Minh, chuyên đề Giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học Tập 11, phụ số 3, tr.89-94 Zhao D, Ding X, Peng J, Zheng Y, and Zhang S (2005): Prognostic significance of bcl-2 and p53 expression in colorectal carcinoma J Zhejiang Univ Sci B December; 6(12): 1163–1169 147 148 ... U đại tràng phải (gồm manh tràng, đại tràng lên, đại tràng góc gan đại tràng ngang) có 31 trường hợp, chiếm 29,5% U đại tràng trái (gồm đại tràng góc lách, đại tràng xuống, đại tràng sigma trực. .. nghĩa thống kê biểu p53 vị trí u(9,11) Nhưng số tác giả khác báo cáo ung thư đại tràng trái biểu tích tụ protein p53 nhiều đại tràng phải(4,16) Như biểu tích tụ protein p53 ung thư đại tràng trái... ý nghĩa thống kê biểu tích tụ protein p53 loại mơ học định tích tụ q mức protein p53 khơng đo lường xác chức gen p53( 9) Sự phù hợp xác định tích tụ mức protein p53 HMMD phân tích gen từ 60-85%(5,7,10)