Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu thực hiện xét nghiệm giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA trên vùng 5’-NC của HCV, phân tích các kết quả và rút ra các kinh nghiệm chủ yếu. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ Số * 2009 Nghiên cứu Y học ÁP DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẦM PCR THU NHẬN ĐƯỢC TỪ THỬ NGHIỆM RT REAL-TIME PCR VÙNG 5’-NC ĐỂ LÀM XÉT NGHIỆM ĐỊNH KIỂU GEN HCV Nguyễn Thanh Bảo*, Phạm Hùng Vân* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Xét nghiệm HCV genotype xét nghiệm mà bác sĩ lâm sàng cần xác định trước bắt đầu điều trị bệnh nhân nhiễm HCV để định thời gian điều trị Có nhiều phương pháp để xác định genotype HCV, nhiên tiêu chuẩn hữu dụng lâm sàng giải trình tự vùng 5’NC Mục tiêu nghiên cứu: Thực xét nghiệm giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA vùng 5’-NC HCV, phân tích kết rút kinh nghiệm chủ yếu Vật liệu phương pháp: Các mẫu huyết sau thu thập tách chiết RNA với RNA chứng nội cho vào mẫu tổng hợp thành cDNA từ dịch ly trích Thực phản ứng real-time PCR dùng mồi đoạn dò Taqman đặc hiệu định lượng HCV có mẫu ban đầu Tiến hành giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại này, so sánh với ngân hàng gene để định subtype HCV Phân tích kết rút kinh nghiệm chủ yếu Kết quả: Từ tháng 1/2007 đến tháng 5/2008, tác giả áp dụng kỹ thuật để định kiểu gene HCV cho 2000 trường hợp với kết ghi nhận được: 58% thuộc subtype 1b, 8% thuộc subtype 1a, 5% thuộc subtype 1c, 10% thuộc subtype 2a, 0,4% thuộc subtype 2b 17% thuộc subtype 6a Kết luận: Từ kết nhận thấy bệnh nhân nhiễm HCV Việt Nam hầu hết tập trung vào subtype 1b 6a Trong nghiên cứu này, tác giả đưa kỹ thuật tốt để vừa định lượng, vừa định type sản phẩm khuếch đại có chứa hỗn hợp DNA đích DNA chứng nội tại, đồng thời chứa hệ thống chống ngoại nhiễm mà không làm ảnh hưởng đến kết cuối xét nghiệm Một ưu điểm phương pháp giải trình tự cho kết phân biệt loại subtype phương pháp khác có tỉ lệ khơng cho subtype hay chí khơng phân biệt subtype ABSTRACT APPLY THE DIRECT SEQUENCING OF THE QPCR PRODUCTS TO DO THE HCV GENOTYPING Nguyen Thanh Bao, Pham Hung Van * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 13 - Supplement of No - 2009: 243 - 248 Background: HCV genotyping is one of the testing that the physicians need to indicate before dicide the specific treatment on the HCV infected patients There are many methods for HCV genotyping, however, the most effective and sensitive is the direct sequencing of the PCR product specific the 5’-NC of the virus Objective: Set up the techniques for genotyping of HCV by direct sequencing the qPCR product specific to 5’-NC of viral genome, and carry out the analysis of the results and the outcome experiences Materials and methods: The collected patients sera were added with the RNA-internal control and then were extracted the total RNA which were carried out the cDNA synthesis The qPCR using specific * Bộ môn Vi Sinh, Đại Học Y Dược TP HCM 242 Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ Số * 2009 Nghiên cứu Y học primers and taqman probes were done to quantify the RNA-HCV copies in the samples The qPCR products were sequenced and the collected sequences were aligned to the library of HCV genotype sequences to get the results of HCV genotyping Results: From 1/2007 to 5/2008, authors applied these techniques on 2000 samples and the analysed results revealed that: 58% were belong to subtype 1b, 8% belong to subtype 1a, 5% belong to subtype 1c, 10% belong to subtype 2a, 0.4% belong to subtype 2b and 17% belong to subtype 6a Conclusions: The received results demonstrated that most of the HCV infected patients in Viet Nam are infected with genotype 1b and 6a In this study, the authors have proved that this testing will not only the quantity but also the genotyping of the HCV by direct sequencing of the qPCR products which contain the target sequence DNA Another advantage of this testing is the internal control products and build-in contamination system did not influence to the sequencing results Besides that, sequencing always results the subtype while other methods will give a low ratio or even can not differentiate the subtype of HCV nghiệm TP Hồ Chí Minh gửi đến phòng thí ĐẶT VẤNĐỀ nghiệm NK-Biotek với yêu cầu định lượng Trước định điều trị đặc hiệu, xét định kiểu gene HCV Để phát định nghiệm định lượng định kiểu gene virus lượng HCV-RNA, phòng thí nghiệm sử viêm gan C mà bệnh nhân nhiễm dụng thử nghiệm RT TQ real-time PCR xét nghiệm tối cần thiết mà bác sĩ phải định (reverse transcriptase real-time PCR dùng cho bệnh nhân(8) Phương pháp lai vạch taqman probe) cơng ty Nam Khoa sản xuất dò đặc hiệu genotype C (HCV-InoLIPA)(18) theo thuốc thử qui trình chúng phương pháp giải trình tự với hệ thống giải nêu nghiên cứu trước(12) Thử trình tự kín Trugene(17) hai phương pháp nghiệm real-time PCR thực nhiều nhà lâm sàng chấp nhận để xác máy IQ5 Biorad Sản phẩm real-time PCR định kiểu gene HCV dùng chẩn đoán cho kết real-time PCR (+) làm tinh Tuy nhiên, giá thành cao nên xét để thu nhận sản phẩm PCR với thử nghiệm xác định kiểu gene HCV chưa nghiệm tinh sản phẩm PCR (PCR cleanchỉ định rộng rãi dù Việt Nam tỷ lệ lưu up kit) Promega sản xuất (Cat #A9281) Sản hành HCV cao giới (5 - 8% phẩm PCR sau tinh điện di người bình thường có nhiễm HCV)(16) dĩ định lượng nồng độ DNA máy nhiên nguy dẫn đến tỷ lệ cao bị xơ Gentquant Pharmacia sau gan ung thư gan (4%)(1) Trong nghiên chúng tơi định lượng điện di chíp cứu trước đây, xây dựng thành điện di thiết bị điện di chip bio-analyzer công kỹ thuật xác định kiểu gene HCV Agilent Sau đó, thực phản ứng giải kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR định trình tự sản phẩm PCR tinh kit lượng nhắm vào vùng 5’-NC Nghiên cứu lần thiết bị CEQ8000 Becman Coulter nhắm đến mục đích phân tích kết sau chúng tơi thực thêm kit đúc kết kinh nghiệm việc triển khai xét thiết bị ABI 3130XL Kết giải trình tự nghiệm 2000 mẫu định kiểu gene lên NCBI blast qua internet để so sánh HCV thực vừa qua với gene bank lên local blast phần mềm VẬT LIỆU-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU miễn phí bio-edit để so sánh với thư viện HCV Đây nghiên cứu tiền cứu cắt ngang với genotype mà chúng tơi tự tạo để có kết đối tượng mẫu huyết xác genotype định dương tính HCV qua xét nghiệm HCVRNA (+) Các mẫu nhiều phòng thí Chun Đề Nội Khoa 243 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ Số * 2009 KẾT QUẢ Trong thời gian từ 17/01/07 đến 17/07/08, có tất 2000 mẫu huyết dương tính HCV-RNA làm xét nghiệm RT real-time PCR dùng mồi taqman probe đặc hiệu 5’NC theo qui trình Tất 2000 mẫu HCVRNA dương tính chúng tơi đồng thời xác định genotype HCV giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR qui trình qPCR Kết định lượng tương ứng với kết xác định genotype 234 mẫu 2000 mẫu phân tích trình bày bảng cho thấy 100% mẫu cho kết phát định lượng dương tính HCV-RNA cho kết định genotype HCV dù kết định lượng có thấp đến mức tối thiểu (là 445 copies/ml huyết nghiên cứu này) Kết cho phép nhận định phương pháp định genotype HCV giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR phản ứng real-time PCR dùng taqman probe mà áp dụng đạt độ nhạy phát tương đương độ nhạy phát RT TQ real-time PCR Bảng 1: Kết định genotype so với kết định lượng Kết định Số lượng copies/ml mẫu * 100 – 999 Genotype(số mẫu) 1b(1) 1a(1), 1b(10), 2a(1), 2a/2c(1), 1.000 – 9.999 14 6a(1) 1(3), 1a(3), 1b(28), 1a/1b(1), 2(4), 10.000 – 99.999 57 2a(4), 2c(2), 2a/2c(1), 6a(11) 100.000 – 1(1), 1a(8), 1b(63), 1a/1b(1), 123 999.999 2(12), 2a(7), 2b(1), 6a(30) 1.000.000 – 37 1a(1), 1b(27), 2(5), 6a(4) 9.999.999 10.000.000 – ** 1(1), 1b(1) 99.999.999 1(5), 1a(13), 1b(130), 1a/1b(2), Tổng cộng 234 2(21), 2a(12), 2b(1), 2c(2), 2a/2c(2), 6a(46) * Mẫu có kết định lượng thấp 445copies/ml huyết **mẫu cao có kết định lượng 13.792.596 copies/ml Biểu đồ trình bày tỷ lệ phần trăm genotype HCV 2000 mẫu huyết 244 Chuyên Đề Nội Khoa Nghiên cứu Y học thử nghiệm Kết cho thấy có đến 1.156 (57,8%) mẫu thuộc genotype 1b, 348 (17,4%) thuộc genotype 6a, 198 (9,9%) genotype 2a, 156 (7,8%) genotype 1a, 108 (5,4%) genotype 1c, 24 (1,2%) genotype 6b, (0,4%) genotype 2b Trong kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, kết tốt có sản phẩm PCR nhất, không bị sản phẩm phụ Các kết điện di sản phẩm PCR sau tinh rõ nét, dù nồng độ HCV số mẫu thấp Điều chứng tỏ qui trình RT real-time PCR phát định lượng HCV-RNA mà áp dụng tối ưu hồn chỉnh Đa số trường hợp trình tự giải có chiều dài phù hợp với chiều dài mà chúng tơi dự đốn, từ 190bp đến < 200bp BÀNLUẬN Định genotype HCV kỹ thuật giải trình tự Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai vạch Bayer dựa đoạn nucleotide đặc hiệu vùng 5’-NC Đây hai phương pháp FDA y học chấp nhận để dùng phòng thí nghiệm lâm sàng Phương pháp InoLIPA phương pháp giải trình có nhiều trường hợp phân biệt subtype, InoLIPA có lợi điểm khơng cần thiết phải có thiết bị giải trình tự vốn xem đắt tiền tương đối khó mặt kỹ thuật, InoLIPA triển khai thực phòng thí Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ Số * 2009 nghiệm lâm sàng có trang bị phương tiện cho kỹ thuật PCR Tuy nhiên, InoLIPA phải thực sản phẩm PCR kết phản ứng nested PCR nên khả bị ngoại nhiễm cao lí giải thích có nhiều trường hợp InoLIPA có kết khơng thể xác định genotype(9,13) Để khắc phục nhược điểm này, chúng tơi nghiên cứu thành cơng qui trình thực RT-PCR với PCR mix nhạy cảm cần dùng mồi vòng HCV-InoLIPA có thêm khả chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại nhờ có chứa dUTP UNG; nhờ cải tiến quan trọng, HCV-InoLIPA có khả áp dụng rộng rãi Việt Nam(13) Tuy khả triển khai sử dụng HCV-InoLIPA Việt Nam xa vời giá thành cao (#100USD/mẫu) so với điều kiện kinh tế nhiều bệnh nhân khả tài bệnh viện Về phương pháp giải trình tự Trugene, nhà sản xuất khuyến cáo nên thực sản phẩm PCR Roche Amplicor, trở ngại lớn giá thành Roche Amplicor dành cho HCV đắt (trên 120 USD/mẫu thử) Ngoài giá thành Roche Amplicor, vật liệu tiêu hao khác kèm với thử nghiệm giải trình tự phải đến 60 USD nữa, giá nghiệm genotype HCV giải trình tự Trugene Việt Nam khó thấp 180 USD Trong thời gian qua, nghiên cứu thành công thử nghiệm RT-PCR với PCR mix dùng cặp mồi hồn tồn tương thích với hệ thống Trugene nhờ mà phòng thí nghiệm không thiết phải sử dụng Roche Amplicor làm RT-PCR(13,6) Chính nhờ áp dụng thành cơng mà giá xét nghiệm HCV genotype trung tâm Medic khơng qua 120 USD/một mẫu thử Tuy vậy, giá thành cao để định rộng rãi cho bệnh nhân Ngoài ra, Trugene hệ thống hoàn toàn Chuyên Đề Nội Khoa Nghiên cứu Y học kín, dùng để đáp ứng yêu cầu định genotype HCV lâm sàng kết hiển thị hình in giấy, nhà nghiên cứu khơng thể có kết tập tin vi tính để làm blast search hay nghiên cứu phylogenetic Thư viện HCV thư viện xây dựng sẵn người dùng cập nhật thêm kết (thực máy giải trình tự Trugene) vào thư viện này, lấy thư viện bên ngồi khơng thể đăng nhập trình tự có từ máy giải trình tự khác để search thư viện Đây bất tiện đặc biệt cho nhà nghiên cứu muốn nghiên cứu sâu thêm HCV genotype kết có từ nguồn khác Phương pháp giải trình tự để định genotype HCV chúng tơi phát triển trình bày cơng trình nghiên cứu thực trình tự dài không 200bp sản phẩm PCR dài khoảng 240250bp, kết từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi taqman probe đặc hiệu đoạn đích tương tự Trugene InoLIPA vùng 5’-NC Chính điều đảm bảo tính xác kết định genotype HCV phát triển không khác kết định genotype kỹ thuật giải trình tự Trugene đoạn trình tự đích phương pháp chúng tơi đoạn trình tự đích phương pháp Trugen gần phù hợp hoàn tồn Sở dĩ chúng tơi nghiên cứu thành cơng cơng trình nhờ chúng tơi có thành công nghiên cứu thiết kế mồi để chế tạo thử nghiệm RT-PCR phát HCV tương thích cho thử nghiệm định genotype HCV kỹ thuật giải trình tự Trugene(6,12,13) Ngồi ra, việc nghiên cứu thành công thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi taqman probe để phát định lượng HCV-RNA đoạn đích đến 240-250bp mà chúng tơi nghiên cứu áp 245 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ Số * 2009 dụng nhiều phòng thí nghiệm Việt Nam(10) bước đột phá (phá qui luật real-time PCR dùng taqman probe cho kết tối ưu sản phẩm khuếch đại không 150bp, chứng minh qua kết trình bày biểu đồ 2-A) nhờ góp nên yếu tố quan trọng để giảm giá thành xét nghiệm định genotype kỹ thuật giải trình khơng cần thiết phải thực RT-PCR để có sản phẩm PCR dành riêng cho giải trình tự Giá thành định genotype HCV bao gồm định lượng HCV-RNA có khả khơng q 50 USD/mẫu Kết cơng trình nghiên cứu cho thấy đa số mẫu huyết gửi đến xét nghiệm định lượng HCV-RNA thuộc genotype 1b (55%) 6a (20%), 25% lại phân phối vào genotype khác genotype (9%), genotype 1a (6%), genotype 2a (5%), genotype (2%), genotype 1a/1b (1%), genotype 2a/2c (1%), genotype 2b (