Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin trong chế phẩm và trong môi trường thử độ hòa tan, góp phần ứng dụng xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm nghiên cứu của công ty cổ phần Dược phẩm Boston Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Lâm Hoàng Lệ Vân*, Phan Thanh Dũng* TÓM TẮT Mở đầu: Chế phẩm phối hợp piracetam v| cinnarizin có t{c động hưng trí v| cải thiện tuần hoàn não sử dụng phổ biến c{c trường hợp suy giảm trí nhớ người già, sa sút trí tuệ sau đột quỵ, suy mạch máu não mạn tính hay rối loạn tiền đình BP 2014, EP 8.0 v| DĐVN có chuyên luận định lượng riêng lẻ Tham khảo vài báo giới cơng bố quy trình định lượng phức tạp v| c{c điều kiện sắc ký chưa tốt; Việt Nam chưa có cơng bố khoa học định lượng đồng thời hai hoạt chất Mục tiêu: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời piracetam cinnarizin chế phẩm v| mơi trường thử độ hòa tan, góp phần ứng dụng xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm nghiên cứu công ty cổ phần Dược phẩm Boston Việt Nam phương ph{p sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu piracetam cinnarizin chế phẩm BosPhezam công ty cổ phần Dược phẩm Boston Việt Nam Phương ph{p nghiên cứu: Định lượng đồng thời piracetam cinnarizin chế phẩm môi trường thử độ hòa tan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA Kết bàn luận: Điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời piracetam cinnarizin là: Cột Eclipse XDB C18 (250 ì 4,6 mm; àm), u dũ PDA (bc sóng phát 227 nm) Pha động: Acetonitril - đệm phosphat 50 mM pH 4,5 (60:40), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl, nhiệt độ cột 45 oC Kết cho thấy rõ phân tách tốt cải thiện tốt hình dạng pic: piracetam (tR=2,6 phút), cinnarizin (tR=7,5 phút) Quy trình định lượng v| định lượng mơi trường thử độ hòa tan thẩm định đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ xác (tính thích hợp hệ thống, độ lặp lại v| độ x{c trung gian), độ thơ Ứng dụng quy trình để định lượng đồng thời piracetam cinnarizin chế phẩm BosPhezam lô sàn xuất, h|m lượng piracetam v| cinnarizin thu nằm khoảng 95,0-105,0% 90,0-110,0% so với h|m lượng nhãn; kết thử độ hòa tan viên nang cho thấy khơng 70% piracetam v| cinnarizin hòa tan 45 phút Kết luận: Đã x}y dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam cinnarizin chế phẩm v| mơi trường thử độ hòa tan phương ph{p HPLC cách hợp lý, nhanh chóng kinh tế Góp phần xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm BosPhezam công ty CPDP Boston Việt Nam Từ khóa: Piracetam; Cinnarizin; HPLC *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Phan Thanh Dũng ĐT: 0943957158 182 Email: dungphan@ump.edu.vn Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học ABSTRACT SIMULTANEOUS DETERMINATION OF PIRACETAM AND CINNARIZINE IN PHARMACEUTICALS BY HIGH PERFORMANCE LIQID CHROMATOGRAPHY Lam Hoang Le Van, Phan Thanh Dung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 182 - 188 Introduction: Binary mixture containing piracetam and cinnarizine, has neuroprotective properties and improves neuroplasticity, is used widely to treat memory loss in the elderly, dementia after stroke, chronic cerebrovascular disease, vestibular disorders< In British Pharmacopoeia 2014, European Pharmacopoeia 8.0 and Vietnamese Pharmacopoeia IV, quantitation of these compounds were often conducted separately, and complex in some articles published on international journals In Viet Nam, there have none publication which simultaneous assay piracetam and cinnarizine until now Objectives: This study aims to simultaneous assay these compounds in pharmaceuticals and in solvent of its dissolution test by high performance liquid chromatography After that, the method was applied to conduct the In-house specification for preparation of Boston Vietnam Pharmaceutical JSC Materials and methods: Piracetam and cinnarizine in sample: BosPhezam of Boston Vietnam Pharmaceutical JSC Each tablet contains 400 mg piracetam and 25 mg cinnarizine Methods: simultaneous quantitation piracetam and cinnarizine in pharmaceuticals and in solvent of its dissolution test by high performance liquid chromatography Results and discussion: The chromatography condition of simultaneous quantitation of piracetam and cinnarizine: Eclipse XDB C18 column (250 × 4.6 mm, µm), UV detection was 227 nm Mobile phase contains acetonitrile and phosphate buffer pH 4.5 (60:40, v/v), flow rate was adjusted to 0.8 ml/min and column oven temperature was kept at 45 oC, injection volume was 20 µl and 30 µl in quantitation in solvent of dissolution test The results have shown good separation of two components: piracetam (tR= 2.6 min), cinnarizine (tR=7.5 min) The method was validated for specificity, linearity – range, precision, accuracy and robustness Apply this study to quantitation components in BosPhezam in three production batches, the content of piracetam and cinnarizine, respectively in the range 95.0-105.0% and 90.0-110.0% of the label amount, quantitation of these compounds dissolved in 45 minute was not under 70% of the label amount Conclusion: The method was developed effectively for simultaneous determination of piracetam and cinnarizine in pharmaceuticals and in solvent of its dissolution test and applied to conduct the pharmaceutical standard of preparation of Boston Vietnam Pharmaceutical JSC Key words: Piracetam; Cinnarizin, HPLC ĐẶT VẤN ĐỀ Những bệnh lý liên quan đến suy giảm trí nhớ ngƣời già, rối loạn tuần hoàn não, suy mạch máu não mạn tính, xơ vữa động mạch, sa sút trí tuệ sau đột quỵ, tổn thƣơng hệ tiền đình (hội chứng Ménière), chứng đau nửa đầu (Migraine) l| bệnh lý kh{ phổ Chuyên Đề Dƣợc biến giới nhƣ Việt Nam(1,9).Sự phối hợp piracetam cinnarizin có t{c động hƣng trí v| cải thiện tuần hồn não đƣợc sử dụng phổ biến c{c trƣờng hợp này(3) BP 2014, EP 8.0 DĐVN có chuyên luận định lƣợng riêng lẻ(2,4,8) Tham khảo vài báo giới 183 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 công bố quy trình định lƣợng phức tạp v| c{c điều kiện sắc ký chƣa tốt(5-7); Việt Nam chƣa có cơng bố khoa học định lƣợng đồng thời hai hoạt chất Vì vậy, mục tiêu đề tài xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời piracetam cinnarizin chế phẩm v| môi trƣờng thử độ hòa tan, góp phần ứng dụng xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm nghiên cứu công ty cổ phần Dƣợc phẩm Boston Việt Nam phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tƣợng nghiên cứu Piracetam cinnarizin chế phẩm BosPhezam với h|m lƣợng: Piracetam 400 mg v| cinnarizin 25 mg Nơi sản xuất: Công ty cổ phần Dƣợc phẩm Boston Việt Nam Chất chuẩn đối chiếu Bảng 1: Danh mục chất chuẩn đối chiếu Số kiểm Hàm ượng tính Nguồn gốc sốt nguyên trạng (%) PIR Chuẩn làm Piracetam 99,48 0040417 việc Viện kiểm QT nghiệm Cinnarizin 99,70 082060916 thuốc Tp.HCM Hoạt chất Dung mơi hóa chất Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng (Merck); acid hydrocloric acid phosphoric đậm đặc đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck), triethylamin, kali dihydrophosphat khan đạt tiêu chuẩn phân tích (Scharlau) Trang thiết bị Máy sắc ký lỏng hiệu caoHPLC Shimadzu CBM 20 Alite với đầu dò PDA SPDM20A (Nhật); cân phân tích AX-200, độ xác 0,1 mg (Nhật) cân Sartorius CPA225D, độ xác 0,01 mg (Đức); m{y đo pHScott lab 850 (Mỹ); máy siêu âmVWR (Mỹ); M{y Độ hòa tan Lanbindia DS 14000 (Ấn Độ); dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu xác dùng phân tích 184 Phƣơng pháp nghiên cứu Dựa vào cấu trúc tính chất hóa học hai chất cần phân tích piracetam có độ phân cực cao cinnarizin có độ phân cực thấp, đồng thời tham khảo chuyên luận BP 2014, EP 8.0, DĐVN IV v| c{c t|i liệu khác kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo với hệ dung môi phân cực đƣợc lựa chọn cho quy trình định lƣợng đồng thời piracetam (Pir.) cinnarizin (Cin.) chế phẩm phối hợp hai thành phần Hệ dung môi đƣợc lựa chọn gồm acetonitril, dung dịch đệm phosphat 50 mM pH 4,5 với tỉ lệ (60:40) Đầu dò PDA với bƣớc sóng ph{t 227 nm, ứng với bƣớc sóng hấp thu cực đại cinnarizin l| th|nh phần có h|m lƣợng thấp công thức Dung môi pha mẫu l| hỗn hợp acetonitril – nƣớc tỉ lệ 50:50.Tiến h|nh khảo s{t lựa chọn điều kiện sắc ký cho pic Pir Cin.có thời gian lƣu hợp lý, pic tách hồn tồn có tính đối xứng tốt (hệ số bất đối nằm khoảng 0,8-1,2) Sau tìm đƣợc điều kiện sắc ký thích hợp tiến hành thẩm định quy trình phân tích ứng dụng quy trình đƣợc thẩm định vào việc định lƣợng v| định lƣợng mơi trƣờng thử độ hòa tan chế phẩm BosPhezam công ty cổ phần dƣợc phẩm Boston Việt Nam Chuẩn bị mẫu - Dung môi pha mẫu (DMPM): Hỗn hợp acetonitril– nƣớc (50:50) - Chuẩn Cin gốc: cân xác khoảng 23,5 mg chuẩn Cin v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 20 ml DMPM, lắc đều, siêu âm đuổi khí, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc Dung dịch có nồng độ 470 µg/ml - Chuẩn hỗn hợp gốc: cân xác khoảng 75 mg chuẩn Pir cho v|o bình định mức 100 ml, hút xác 10 ml dung dịch chuẩn Cin gốc vào bình thêm khoảng 70 ml DMPM, lắc siêu }m đuổi khí, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc Dung dịch Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 chứa nồng độ Pir v| Cin tƣơng ứng 750 µg/ml 47,0 µg/ml - Chuẩn hỗn hợp: Hút xác 10 ml chuẩn hỗn hợp gốc v|o bình định mức 25 ml, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm, siêu }m đuổi khí Hỗn hợp có nồng độ Pir 300 µg/ml Cin 18,75 µg/ml - Mẫu thử: C}n 20 nang, x{c định khối lƣợng trung bình bột thuốc nang, nghiền thành bột mịn Cân xác khoảng lƣợng thuốc bột tƣơng đƣơng với 75 mg Pir v|o bình định mức 100 ml Thêm khoảng 70 ml DMPM, lắc siêu âm khoảng 15 phút, đề nguội, thêm DMPM vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 20 ml dịch lọc Nghiên cứu Y học đầu, hút xác 10 ml pha loãng thành 25 ml với DMPM Lọc qua màng lọc 0,45 µm, siêu }m đuổi khí KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện sắc ký cho quy trình phân tích Trong q trình thực nghiệm, yếu tố ảnh hƣởng đến khả t{ch nhƣ tính chất đối xứng c{c pic đƣợc khảo sát nhƣ: Th|nh phần dung môi hữu pha động, pH dung dịch đệm, có mặt triethylamin Chúng tơi tìm đƣợc điều kiện sắc ký thích hợp để tách hoàn toàn piracetam cinnarizin với thời gian phân tích hợp lý v| c{c pic đối xứng (a) (b) (c) (d) Hình 1: Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp (a) mẫu thử (b), mẫu trắng (c) mẫu placebo (d) trƣờng hòa tan: 900 ml dung dịch HCl 0,1 N Tốc Điều kiện sắc ký: Cột: Eclipse XDB C18 độ quay: 100 vòng/phút Thời gian: 45 phút (250 4,6 mm; µm) Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút Bƣớc sóng phát hiện: 227 nm Thể tích tiêm: 20 µl Nhiệt độ cột: 45 C Pha động: Acetonitril - đệm phosphat50 mM pH 4,5 (60: 40) o Điều kiện hòa tan: Thiết bị: Giỏ quay Môi Chuyên Đề Dƣợc Điều kiện sắc ký: Cột: Eclipse XDB C18 (250 4,6 mm; µm) Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút Bƣớc sóng phát hiện: 227 nm Thể tích tiêm: 30 µl Nhiệt độ cột: 45oC Pha động: Acetonitril - đệm phosphat50 mM pH 4,5 (60:40) 185 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học (a) (b) (c) (d) Hình 2: Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp (a) mẫu thử (b), mẫu trắng (c) mẫu placebo (d) môi trường thử độ hòa tan Thẩm định quy trình phân tích Quy trình đƣợc thẩm định theo hƣớng dẫn Asean thẩm định quy trình phân tích với tiêu: Tính tƣơng thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyết tính, độ đúng, độ x{c v| độ thơ Kết thẩm định đƣợc trình bày bảng Kết thống kê cho thấy quy trình định lƣợng đồng thời Pir Và Cin đạt tất tiêu thẩm định cho phép áp dụng vào việc định lƣợng chế phẩm viên nén chứa hai hoạt chất Bảng 2: Kết thẩm định quy trình định lượng đồng thời Pir Cin STT 186 Chỉ tiêu Yêu cầu Kết Pir.: RSD= 0,15-1,20%, T= 1,01, N= 25671 Tính tương thích hệ RSD thông số 2%; 0,8 ≤ T ≤ 1,2; N 2000; Rs ≥ Cin.: RSD= 0,04-0,75%, T= 0,84, N= 73030, RS= thống 21,23 - Dung môi tá dược không ảnh hưởng đến pic hoạt chất cần phân tích, Sắc k đồ củ mẫu thử cho Tính đặc hiệu pic có thời gi n lưu tương ứng với pic củ chất Đạt phân tích sắc k đồ củ mẫu chuẩn, pic phải tách nh u hoàn toàn phải tinh khiết Pir.:ŷ = 2924,3x (r)Pir = 0,9997 Khoảng tuyến tính Hệ số tương qu n (r) ≥ 0,999 Cin.: ŷ = 64559,5x (r)Cin.= 1,0000 Pir.: R= 99,03- 100,77%, RSD= 0,87% Độ phục hồi (R) khoảng 98 – 102% Độ Cin.: R= 98,92 RSD 2% - 99,90%, RSD= 0,49% - Độ lặp lại: RSDPir.=0,34% Độ xác RSD (%) 2,0% RSDCin.=0,54% - Độ lặp lại RSD ≤ 2,0% độ sai khác kết định lượng hai - Độ xác trung gian: - Độ xác trung kiểm nghiệm viên ≤ 2,0% gian RSDPir.=0,72% RSDCin.=0,54% Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 STT Chỉ tiêu Yêu cầu Nghiên cứu Y học Kết Độ sai khác kết định lượng trung bình h i người phân tích: 0,35% Độ thơ - Tăng/ giảm 10% tốc Tất thơng số có RSD ≤ 2,0%, hệ số độ dòng, thành phần Các kết thu từ sắc kí đồ mẫu chuẩn mẫu bất đối 0,8 ≤ T ≤ 1,2; số đĩ l thuyết N 2000; thử phải đạt tính tương thích hệ thống dung mơi hữu tối đ RS ≥ 10%, 0,25 giá trị pH dung dịch đệm Được đánh giá dựa tương qu n khoảng - Pir.: 240 – 360 μg/ml Khoảng xác định tuyến tính, giá trị độ xác độ củ phương - Cin.: 15 – 22,5 μg/ml pháp Ứng dụng quy trình lơ sản xuất Bảng 3: Kết định lượng lô sản xuất (Viên nang BosPhezam) Hàm ượng trung bình Pir.(%) Hàm ượng trung bình Cin.(%) Lơ 99,05 101,91 Lơ Lơ 101,11 99,40 98,44 99,69 Bảng 4: Kết định lượng môi trường TĐHT lô sản xuất (Viên nang BosPhezam) Lô Lô Lô Hàm ượng trung bình Pir (%) 99,41 97,58 98,41 Hàm ượng trung bình Cin (%) 96,57 95,12 93,83 H|m lƣợng Pir Cin ba lô sản xuất nằm khoảng tƣơng ứng 95,0105,0% 90,0-110,0% so với h|m lƣợng ghi nhãn; không dƣới 70% h|m lƣợng piracetam cinnarizin so với lƣợng ghi nhãn đƣợc hòa tan sau 45 phút BÀNLUẬN Để có đƣợc kết phân tách tốt việc lựa chọn điều kiện sắc ký (bao gồm: chất pha tĩnh, th|nh phần tỷ lệ pha động, pH pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, chất chất ph}n tích,