Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày kết quả khảo sát một số phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân và đồng nhất hóa liposome AmB. Đây là giai đoạn có vai trò quan trọng và có ý nghĩa quyết định đến quá trình nghiên cứu tiếp theo nhằm bào chế thuốc tiêm có chứa liposome AmB.
TạP CHí Y - DƯợc học quân số chuyên ®Ị d−ỵc-2016 KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP GIẢM KÍCH THƯỚC TIỂU PHÂN LIPOSOME AMPHOTERICIN B Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Văn Lâm** Nguyễn Thái Sơn***; Phạm Thị Minh Huệ** TÓM TẮT Mục tiêu: khảo sát số phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân (KTTP) liposome amphotericin B (AmB) Phương pháp: liposome AmB bào chế theo phương pháp hydrat hóa film giảm KTTP phương pháp đùn tay qua màng, siêu âm đồng hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng Kết quả: liposome AmB giảm KTTP phương pháp đùn tay với thiết bị mini extruder có độ đồng cao (PDI < 0,2) KTTP > 200 nm; phương pháp dùng que siêu âm sau phút có KTTP < 200 nm phân bố KTTP đồng (PDI < 0,2); phương pháp dùng bể siêu âm cho liposome AmB có KTTP lớn (> 500 nm) phân bố KTTP không đồng (PDI > 0,5); phương pháp đồng hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng với điều kiện áp suất đồng hóa 5000 psi, số chu kỳ đồng hóa 2, màng polycarbonat 400 nm, số lần đùn cho liposome AmB có hình cầu, đa số có lớp, KTTP < 200 nm phân bố KTTP tương đối đồng (PDI < 0,3) Kết luận: khảo sát số phương pháp làm giảm KTTP liposome AmB Trong đó, phương pháp đồng hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng cho kết tốt Đây sở để nghiên cứu giai đoạn bào chế thuốc tiêm liposome AmB * Từ khoá: Liposome; Amphotericin B; Kích thước tiểu phân; Giảm kích thước Evaluating Methods of Particle Size Reduction of Liposome Amphotericin B Summary Objectives: To evaluate several methods for particle size reduction of liposome AmB Materials and methods: Liposome AmB was prepared by using film hydration and its particle size was reduced by manual trans-membrane extrusion method, ultrasonification and combination of high pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion method Results: Liposome AmB particle size reduction using manual trans-membrane extrusion method with miniextruder device resulted in high uniformity (PDI < 0.2) but the particle size was still greater than 200 nm; using ultrasonification probe method in minutes enabled particle size to be smaller with less than 200 nm and particle size distributed evenly (PDI < 0.2); using ultrasonic method made particle size larger (above 500 nm) and particle size distributed unevenly (PDI > 0.5); * Học viện Quân y ** Đại học Dược Hà Nội *** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com) Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 18/08/2016 Ngày báo đăng: 14/09/2016 39 T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dợc-2016 combination of high-pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion method, repeated twice at 5,000 psi, 400 nm sized polycarbonate membranes, resulted in spherical liposome Am B particle size of less than 200 nm, mostly layer and particle size distributed relatively evenly (PDI < 0.3) Conclusion: Several methods of particle size reduction of liposome amphotericin have been evaluated and combination of high-pressure homogenization method with manual transmembrane extrusion method gave the best result This is the basement for further studies in preparing liposome AmB injection * Key words: Liposome; Amphotericin B; Particle size; Reduction ĐẶT VẤN ĐỀ Liposome hệ mang thuốc có nhiều ưu điểm bật kiểm sốt giải phóng khả đưa thuốc tới quan đích [2] Để bào chế liposome, có nhiều phương pháp khác nhau, phương pháp hydrat hóa film thường sử dụng có ưu điểm như: kỹ thuật bào chế tương đối đơn giản, dễ thực hiện, áp dụng cho tất loại phospholipid, hiệu suất liposome hóa với dược chất tan lipid cao Tuy nhiên, hạn chế phương pháp liposome thu thường có kích thước lớn, nhiều lớp không đồng (khoảng 50 - 1.000 nm) [2, 4] Vì thế, muốn đưa liposome vào dạng bào chế thuốc tiêm, cần tiếp tục xử lý để thu liposome có kích thước nhỏ đồng hơn, nhằm giúp q trình lọc vơ khuẩn thuận lợi, tăng cường đưa thuốc tới đích, Liposome AmB nghiên cứu bào chế theo phương pháp hydrat hóa film [1] Nghiên cứu nhằm: Trình bày kết khảo sát số phương pháp làm giảm KTTP đồng hóa liposome AmB Đây giai đoạn có vai trò quan trọng có ý nghĩa định đến trình nghiên cứu nhằm bào chế thuốc tiêm có chứa liposome AmB 40 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Nguyên liệu: AmB, phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC), distearoyl phosphatidylglycerol (DSPG), cholesterol (Chol) hóa chất khác đạt tiêu chuẩn USP, tiêu chuẩn nhà sản xuất tinh khiết hóa học - Thiết bị: hệ thống cất quay Rovapor R-210 (Buchi, Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 2.000 ml (Buchi, Đức); thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific, Mỹ); thiết bị đùn cao áp EmulsiFlex-C5 (Avestin, Canada); bể siêu âm Wiseclean 40 kHz (Hàn Quốc); máy siêu âm que UP200Ht (Hielscher, Đức); hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Anh); kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản) thiết bị, dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp bào chế liposome AmB: Liposome AmB bào chế theo phương pháp hydrat hóa film với thành phần gồm AmB, HSPC, DSPG, Chol [1] T¹P CHÝ Y - DƯợc học quân số chuyên đề dợc-2016 * Phng pháp giảm KTTP đồng hóa liposome AmB: - Phương pháp đùn ép qua màng polycarbonat thiết bị mini extruder [2, 3] - Phương pháp siêu âm: bể siêu âm que siêu âm [2] - Phương pháp đồng hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng [2] * Phương pháp đánh giá đặc tính liposome AmB: - KTTP độ đồng nhất: sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động với thiết bị Zetasizer ZS90 - Hình thái cấu trúc tiểu phân: phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tiến hành bào chế mẫu liposome AmB theo phương pháp hydrat hóa film thu kết có KTTP khoảng 738 1.026 nm, phân bố KTTP khoảng 0,451 0,868 Các mẫu liposome AmB dùng để khảo sát biện pháp làm giảm KTTP đồng hóa Kết khảo sát phương pháp đùn qua màng thiết bị mini extruder Liposome AmB sau bào chế đùn ép qua màng polycarbonat kích thước 1.000 - 400 - 200 nm thiết bị đùn tay mini extruder Mỗi mẫu đùn 29 lần giữ nhiệt độ 60oC suốt trình đùn bể điều nhiệt Bảng 1: KTTP phân bố KTTP mẫu liposome AmB trước sau đùn tay Trước đùn Sau đùn KTTP (d.nm) PDI KTTP (d.nm) PDI 738,8 0,495 207,5 0,122 750,0 0,566 211,6 0,111 761,6 0,686 233,5 0,227 Các mẫu liposome AmB sau đùn có số PDI thấp (từ 0,111 - 0,227) cho thấy phân bố KTTP đồng Tuy nhiên, KTTP lớn (> 200 nm), thể tích lần đùn tay ml nên khó áp dụng quy mơ lớn Kết khảo sát phương pháp siêu âm * Phương pháp sử dụng que siêu âm: Liposome AmB sau bào chế cho vào cốc có mỏ Sau đó, siêu âm máy siêu âm que UP200Ht Sau thời gian 1, 2, 3… đến 10 phút, lấy mẫu đo KTTP phân bố KTTP Bảng 2: KTTP phân bố KTTP mẫu liposome AmB sử dụng que siêu âm (n = 3) Thời gian siêu âm (phút) KTTP (d.nm) PDI Ban đầu 566,0 ± 11,5 0,607 ± 0,019 256,7 ± 5,3 0,453 ± 0,031 202,9 ± 4,3 0,411 ± 0,031 175,4 ± 4,5 0,303 ± 0,008 148,1 ± 0,1 0,255 ± 0,008 146,6 ± 1,3 0,212 ± 0,025 139,1 ± 0,1 0,220 ± 0,028 139,4 ± 0,1 0,227 ± 0,001 140,6 ± 0,4 0,248 ± 0,004 141,3 ± 4,7 0,253 ± 0,001 10 145,9 ± 1,0 0,272 ± 0,007 41 T¹p chí y - dợc học quân số chuyên đề d−ỵc-2016 Với phương pháp sử dụng que siêu âm, sau phút, mẫu cho kết có KTTP < 200 nm, phân bố KTTP tương đối đồng (PDI < 0,3) Hạn chế phương pháp thường đưa tạp chất vào chế phẩm [2] áp dụng quy mô nhỏ * Phương pháp sử dụng bể siêu âm: Liposome AmB sau bào chế cho vào cốc có mỏ tiến hành siêu âm bể Wiseclean (40 kHz) với quy trình siêu âm ngắt quãng: siêu âm 30 giây, nghỉ 30 giây (mẫu A1); siêu âm phút, nghỉ phút (mẫu A2); siêu âm phút, nghỉ phút (mẫu A3) (trong trình siêu âm sử dụng nước đá để tránh tăng nhiệt cục hỗn dịch liposome) Sau 20 phút, lấy mẫu đo KTTP phân bố KTTP Bảng 3: KTTP phân bố KTTP mẫu liposome AmB sử dụng bể siêu âm (n = 3) Liposome AmB sau bào chế tiến hành đồng hóa đùn qua màng máy Emulsiflex-C5 áp lực bình khí N2 lỏng, áp suất 5.000 psi (350 bar) Khảo sát số lần đùn khác để tìm điều kiện phù hợp Sau đó, kết hợp đùn qua màng 400 nm áp suất 500 psi (35 bar) * Ảnh hưởng số chu kỳ đồng hóa: Bảng 4: KTTP phân bố KTTP mẫu liposome AmB theo số chu kỳ đống hóa Số chu kỳ KTTP (d.nm) PDI 882,6 0,508 174,0 0,408 149,2 0,364 141,9 0,376 Mẫu KTTP (d.nm) PDI 135,1 0,382 A1 522,13 ± 26,05 0,727 ± 0,075 130,5 0,371 A2 507,97 ± 33,62 0,713 ± 0,104 121,1 0,376 A3 662,30 ± 59,01 0,542 ± 0,051 112,5 0,306 110,0 0,294 Sau 20 phút, quy trình siêu âm cho liposome AmB có KTTP lớn (> 500 nm) phân bố KTTP không đồng (PDI > 0,5) Điều cho thấy, hiệu việc giảm KTTP liposome AmB bể siêu âm cho kết thấp Chỉ ứng dụng để sơ giảm KTTP liposome trước áp dụng phương pháp khác 42 Kết khảo sát phương pháp đồng hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng Sau chu kỳ thứ nhất, KTTP liposome AmB giảm xuống 200 nm Tuy nhiên, phân bố KTTP chưa đồng (PDI > 0,4) Từ chu kỳ thứ trở đi, KTTP liposome AmB có xu hướng giảm dần PDI trì khoảng 0,3 Vì vậy, cần kết hợp mẫu giảm KTTP với đùn qua màng để tăng độ đồng T¹P CHÝ Y - DƯợc học quân số chuyên đề dợc-2016 * Kết khảo sát ảnh hưởng số lần đùn qua màng: Các mẫu liposome AmB sau đồng hóa, tiến hành đùn qua màng polycarbonat 400 nm áp suất 500 psi Bảng 5: KTTP phân bố KTTP mẫu liposome AmB theo số lần đùn qua màng Số lần KTTP (d.nm) PDI 149,2 0,364 134,3 0,337 134,9 0,281 131,8 0,274 131,6 0,275 Sau đùn qua màng 400 nm, chu kỳ thứ 2, PDI giảm xuống < 0,3, mẫu đồng Sự khác biệt KTTP phân bố KTTP mẫu chu kỳ thứ chu kỳ khơng rõ rệt Hình ảnh chụp TEM mẫu sau đồng áp suất cao đùn qua màng cho thấy tiểu phân có cấu trúc hình cầu, đa số có lớp, KTTP nhỏ đồng (hình 1) (a) Ban đầu (b) Sau giảm KTTP Hình 1: Hình ảnh chụp TEM mẫu ban đầu (a) sau làm giảm KTTP phương pháp đồng hóa áp suất cao kết hợp với đùn qua màng (b) 43 T¹p chí y - dợc học quân số chuyên đề d−ỵc-2016 KẾT LUẬN Đã tiến hành khảo sát phương pháp giảm KTTP liposome AmB, cụ thể: - Với phương pháp đùn tay thiết bị mini extruder, liposome AmB có độ đồng cao (PDI < 0,2) KTTP lớn 200 nm - Với phương pháp siêu âm dùng que siêu âm, sau phút cho liposome AmB có KTTP nhỏ 200 nm phân bố KTTP đồng (PDI < 0,2) - Với phương pháp siêu âm dùng bể siêu âm, quy trình siêu âm khác cho liposome AmB có KTTP lớn (> 500 nm) phân bố KTTP không đồng (PDI > 0,5) - Với phương pháp đồng hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng, áp suất đồng hóa 5.000 psi, số chu kỳ đồng hóa 2, màng polycarbonat 400 nm, số lần đùn cho liposome AmB có hình cầu, đa số có lớp, KTTP < 200 nm 44 phân bố KTTP tương đối đồng (PDI < 0,3) Kết khảo sát sở để tiến hành giai đoạn trình nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome AmB TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Thị Minh Huệ, Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn Tuấn Quang Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin AmB phương pháp hydrat hóa film Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2014, số 23, tr.61-64 Võ Xuân Minh, Phạm Thị Minh Huệ Kỹ thuật nano liposome ứng dụng dược phẩm, mỹ phẩm NXB Y học 2013, tr.60-73 Hope M J, Nayar R, Mayer L D, Cullis P R Reduction of liposome size and preparation of unilamellar vesicles by extrusion techniques Liposome Technology 1993, 1, pp.123-139 Wagner A et al Liposomes technology for industrial purposes J Drug Del 2011, 4, pp.1-9 ... 1.026 nm, phân b KTTP khoảng 0,451 0,868 Các mẫu liposome AmB dùng để khảo sát biện pháp làm giảm KTTP đồng hóa Kết khảo sát phương pháp đùn qua màng thiết b mini extruder Liposome AmB sau b o chế... (Nhật B n) thiết b , dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp b o chế liposome AmB: Liposome AmB b o chế theo phương pháp hydrat hóa film với thành phần gồm AmB,... DƯợc học quân số chuyên ®Ị d−ỵc-2016 * Phương pháp giảm KTTP đồng hóa liposome AmB: - Phương pháp đùn ép qua màng polycarbonat thiết b mini extruder [2, 3] - Phương pháp siêu âm: b siêu âm que