Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt từ 1 tế bào bạch cầu, tách từ máu ngoại vi của các gia đình bệnh nhân, là cơ sở trong chẩn đoán tiền làm tổ bệnh teo cơ tủy.
Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 Nghiên cứu hồn thiện quy trình xác định đột biến gen smnt gây bệnh teo tủy từ tế bào phương pháp nested-pcr enzym giới hạn Nguyễn Thị Thanh Nga*; Nguyễn Đình Tảo* Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*; Vũ Chí Dũng** Tóm tắt Mục tiêu: hồn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt từ tế bào (TB), sở chẩn đoán tiền làm tổ bệnh teo tủy Đối tượng phương pháp: gia đình sinh bị bệnh teo tủy đồng hợp tử exon 7, gen SMNt Lấy máu tĩnh mạch bố, mẹ, gia đình, sau tách lấy TB bạch cầu, ly giải TB, tiến hành phản ứng nested-PCR nhân exon 7, gen SMNt, ủ sản phẩm PCR với enzym DraI DdeI Điện di sản phẩm cắt gen agarose 3% phân tích kết Kết quả: bệnh nhân (BN) đồng hợp exon 7, gen SMNt, kết phù hợp với chẩn đốn gen từ mẫu máu tồn phần Kết luận: xây dựng quy trình xác định đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy từ TB * Từ khóa: Teo tủy; Gen SMN, SMA; Nested-PCR; tế bào Completing Assays for Detecting SMNt Gene Mutation in Single Cell using Nested-PCR and Restriction Enzyme Method Summary Objective: Seting up a molecular diagnostic protocol for detecting spinal muscular atrophy (SMNt) mutation in single cell is basic to preimplantation gentic diagnosis Subjects and methods: This study was carried out on patients and their parent Lymphocytes of patients and their parent were isolated from fresh blood by ficoll Taking a lymphocyte by stereoscopic microscope, lysised the cell, amplifying exon and exon of SMNt gene by using a nested polymerase chain reaction, followed by DraI and DdeI restriction digest enzyme of the PCR enabling the important SMNt gene to be distinguished from the centromic SMNc gene which has no clinical phenotype to detect mutation Electrophoresis PCR products after digesting by restriction enzyme and analysis Result: patients showed deletion in exon and exon SMNt gene This result is similar with the gene diagnosed from fresh blood Conclusion: We have successfully applied the technique of nested-PCR for the gene diagnosis of spinal muscular atrophy from single cell * Key words: Spinal muscular atrophy; SMN gene; Nested-PCR; Single cell * Học viện Quân y ** Bệnh viện Nhi Trung ương Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Thanh Nga (thanhngabongbong81@gmail.com) Ngày nhận bài: 13/10/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 25/11/2014 Ngày báo đăng: 27/01/2015 96 Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 Đặt vấn đề Bệnh teo tủy (Spinal Muscular Atrophy - SMA) bệnh thần kinh đặc trưng TB sừng trước tuỷ sống thoái hoá tuần tiến, dẫn đến yếu đối xứng gốc chi, trương lực phản xạ gân xương bị giảm Tỷ lệ bệnh SMA chung toàn giới 1/10.000 trẻ đẻ sống tỷ lệ người mang gen bệnh dao động từ 1/40 - 1/60 [4, 5, 7] Nguyên nhân gây bệnh SMA đột biến gen SMNt (survival monitor neurone) nhiễm sắc thể số Gen SMN bao gồm exon mã hoá cho phân tử protein SMN dài 294 axít amin Gen SMN có hai giống gen SMNt (SMN1) gen SMNc (SMN2) Trong đó, gen SMNt bị đột biến gây bệnh SMA Hai gen khác cặp base: cặp intron 6, cặp exon 7, hai cặp intron cặp exon 8, nên nhân gen SMNt nhân gen SMNc Vì vậy, khác exon exon sử dụng để phân biệt gen SMNt với SMNc chẩn đoán SMA [10] Khoảng 95% BN SMA bị đột biến đồng hợp exon 7, gen SMNt, 5% BN SMA bị đột biến điểm gen SMNt Vì vậy, để chẩn đốn gen bệnh SMA, thường phân tích có mặt hay khơng có mặt exon 7, gen SMNt [1, 5, 6, 8, 10] Mỗi trẻ em mắc bệnh SMA đời gánh nặng cho gia đình tâm lý tài chính, đồng thời gánh nặng cho toàn xã hội Do đó, việc chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi (preimplantation genetic diagnosis - PGD) bệnh SMA với gia đình tiền sử có người mắc bệnh SMA nhằm chọn phôi lành để cấy chuyển vào tử cung mẹ, từ sinh em bé khỏe mạnh cần thiết có ý nghĩa quan trọng [2, 3] 98 Chúng tơi tiến hành đề tài nhằm: Hồn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy từ TB bạch cầu, tách từ máu ngoại vi gia đình BN Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Chọn gia đình có độ tuổi từ - 18 đến khám điều trị Bệnh viện Nhi Trung ương, chẩn đoán bị bệnh teo tủy đồng hợp tử exon gen SMNt Phương pháp nghiên cứu * Tách hút bạch cầu từ mẫu máu ngoại vi: - Tách TB bạch cầu từ máu toàn phần theo protocol Ficoll - paque Sau đó, tiến hành hút TB bạch cầu từ mẫu bạch cầu tách theo bước sau: + Bước 1: hút giọt dung dịch PBS1X (20 μl) đặt lên lam kính rửa sạch, đánh số thứ tự - + Bước 2: dùng pipet 10 μl hút μl dung dịch bạch cầu tách trộn vào giọt PBS1X 1, vừa trộn vừa quan sát kính hiển vi + Bước 3: hút μl dung dịch giọt PBS1X kính cho hút TB, trộn vào giọt PBS1X + Bước 4: tiếp tục tới giọt Ở giọt ta mật độ lympho thưa (2 - TB bạch cầu/vi trường vật kính 32X) + Bước 5: hút μl dịch có chứa TB nhỏ vào ống 0,2 ml để chuẩn bị thực bước ly giải TB bảo quản -200C - Ly giải TB: Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 Tiến hành ly giải TB vừa hút μl KOH 0,2 M, ủ 65o 10 phút, trung hòa KOH μl tricine 0,2 M Tiến hành phản ứng PCR nhân exon 7, exon gen SMNt trực tiếp từ mẫu TB bị ly giải - Phản ứng PCR: Khuếch đại exon 7, exon gen SMNt kỹ thuật nested-PCR dùng hai cặp mồi đặc hiệu exon 7, exon gen SMNt (mồi thiết kế theo Lefebvre CS, 1995 van der Steege CS, 1995): + Trình tự mồi exon gen SMN vòng 1: F1 5’-AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA-3’ R15’-CTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTTT-3’ + Trình tự mồi exon gen SMN vòng 1: F 15’-GTAATAACCAAATGCAATGTGAA-3’ R1 5’-CTACAACACCCTTCTCACAG-3’ + Thành phần phản ứng PCR vòng chung cho exon 8: Master mix: 12,5 µl; primers (10 pmol/µl): 0,5 µl; nước loại ion: µl; mẫu: µl Tổng thể tích phản ứng 25 µl + Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 960C phút, [940C phút, 560C phút, 720C phút] x 25 chu kỳ, 720C 10 phút - Lấy sản phẩm PCR vòng làm mẫu cho phản ứng PCR vòng 2: + Trình tự mồi exon gen SMN vòng 2: F1 5’-AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA-3’ R2 5’-CTTCTTTTTGATTTTGTTT-3’ + Trình tự mồi exon gen SMN vòng 2: F2 5’-AACCAAATGCAATGTGAAATA-3’ R1 5’-CTACAACACCCTTCTCACAG-3’ + Thành phần phản ứng PCR vòng chung cho exon 7, gen SMNt Master mix: 12,5 µl; primers (10 pmol/µl): 0,5 µl; nước loại ion: µl; mẫu: µl Tổng thể tích phản ứng 25 µl 99 + Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 960C phút, [940C phút, 540C 30 giây, 720C phút] x 35 chu kỳ, 720C 10 phút + Kích thước sản phẩm PCR: Sau nhân qua vòng PCR, sản phẩm PCR mồi exon gen SMNt (nhân exon SMNt exon SMNc) có kích thước 188 bp, sản phẩm PCR mồi exon gen SMNt (nhân exon SMNt exon SMNc) có kích thước 190 bp - Ủ enzym cắt giới hạn: Sau nhân gen xong, tiến hành ủ enzym giới hạn Trong nghiên cứu, dùng loại enzym cắt giới hạn DraI DdeI (Hãng Thermo Sciencetific) để phân biệt exon gen SMNt với exon gen SMNc, phân biệt exon gen SMNt với exon gen SMNc: + Enzym DraI có vị trí cắt: 5’…TTT AAA…3’ 3’…AAA TTT…5’ + Enzym Dde I có vị trí cắt: 5’…C TNAG…3’ 3’…GANT C…5’ - Sản phẩm PCR ủ với enzym giới hạn DraI DdeI từ - Điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 3% - Sản phẩm PCR sau ủ với enzym DraI: exon gen SMNt không bị enzym cắt nên ngun với kích thước 188 bp, exon gen SMNc bị enzym DraI cắt thành băng có kích thước tương ứng 164 bp 24 bp - Sản phẩm PCR sau ủ với enzym DdeI: exon gen SMNt khơng bị enzym Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 cắt nên ngun kích thước 190 bp, exon gen SMNc bị enzym cắt thành băng có kích thước tương ứng 120 bp 70 bp có khoảng - TB bạch cầu tiến hành hút TB bạch cầu Kết nghiên cứu bàn luận Kết bước tách hút bạch cầu - Kết tách bạch cầu: Sau tách bạch cầu phương pháp Ficoll-Paque, tiến hành hút bạch cầu Để đánh giá hiệu tách hút bạch cầu, nhỏ trực tiếp xanh methylen vào giọt dịch chứa TB bạch cầu soi kính hiển vi Hình 1: Giọt dịch sau tách bạch cầu từ mẫu máu ngoại vi vật kính 10X Trên hình cho thấy, vi trường vật kính 10X có nhiều TB bạch cầu, nên khẳng định chúng tơi tách bạch cầu phương pháp Ficoll-paque - Hút TB bạch cầu: Pha loãng giọt dịch chứa bạch cầu gốc theo bước nêu, đến giọt PBS1X thứ 5, kiểm tra kính hiển vi 32X thấy 100 Hình 2: Giọt dịch bạch cầu pha lỗng với PBS1X giọt vi trường 32X Đồng thời, để đánh giá hiệu hút TB bạch cầu, tiến hành theo bước nhỏ lên lam kính làm 100 tiêu bản, sau nhuộm giemsa 16% Hình 3: Tiêu nhuộm giemsa để đánh giá kỹ thuật hút TB bạch cầu Bảng 1: Bảng kết hút TB bch cu Loại TB Số l-ợng tiêu Tỷ lƯ Tiêu có TB 75 75% Tiêu có - TB 20 20% Tiêu khơng có TB 5% 100 100% Tổng Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 Kết hút bạch cầu cao, đủ đảm bảo để hoàn thiện quy trình phát đột biến gen gây bệnh teo tủy TB bạch cầu Kết nhân exon 7, gen SMN từ TB bạch cầu Mỗi mẫu máu, chúng tơi hút nhóm TB bạch cầu cho vào ống 0,2 ml khác nhau, sau tiến hành ly giải TB nhân exon 7, gen SMNt Hình 4: Kết điện di gel agarose 3% sản phẩm PCR sau ủ với enzym giới hạn gia đình BN C3 B3 M3 có băng tương ứng 188 bp 164 bp, nghĩa B3 M3 có exon SMNt (khơng bị cắt nên ngun kích thước 188 bp), exon SMNc bị cắt thành mảnh (164 bp 24 bp) Trong đó, C3 có băng tương ứng 164 bp, nghĩa C3 bị đồng hợp exon SMNt, có exon SMNc nên bị enzym giới hạn cắt thành băng (164 bp, 24 bp) Như vậy, BN C3 đồng hợp exon gen SMNt Kết phù hợp với kết luận chẩn đoán gen Bệnh viện Nhi Trung ương Chúng thành công việc nhân exon 7, gen SMNt từ TB bạch cầu bước ủ enzym giới hạn Hình 5: Kết điện di gel agarose 3% sản phẩm PCR sau ủ với enzym giới hạn gia đình BN C7 Cả bố B7 mẹ M7 BN C7 có exon gen SMNt nên ủ sản phẩm PCR với enzym giới hạn DraI có băng (188 bp exon SMNt 164 bp exon SMNc), tương tự exon gen SMNt Như vậy, BN C7 đồng hợp exon exon gen SMNt phù hợp với kết chẩn đoán gen Bệnh viện Nhi Trung ương Tiến hành nghiên cứu gia đình BN khác, chúng tơi thu kết quả: Bảng 2: Kết phát đột biến gen SMNt TB bạch cầu gia đình có mắc bệnh SMA TT 101 BN Gen SMNt Bè bn Gen SMNt mẹ bn Gen SMNt Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 Exon Exon Exon Exon Exon Exon SMAC1 - - SMAB1 + + SMAM1 + + SMAC2 - - SMAB2 + + SMAM2 + + SMAC3 - - SMAB3 + + SMAM3 + + SMAC7 - - SMAB7 + + SMAM7 + + Cả BN teo tủy nghiên cứu đồng hợp exon SMNt, đặc điểm phù hợp với kết chẩn đoán gen SMNt từ mẫu máu toàn phần Bệnh viện Nhi Trung ương nhiều tác giả khác [6, 7, 8] Đồng thời, tất bố, mẹ BN có mặt exon 7, SMNt thực tế, cặp bố mẹ người không biểu bệnh teo tủy Nghĩa là, cần có nhiễm sắc thể cặp tương đồng số có gen SMNt bình thường (dạng dị hợp) dịch mã đủ lượng protein SMN cho TB thần kinh vận động hoạt động bình thường Kết luận kiến nghị Từ kết trên, khẳng định bước đầu thành cụng việc hoàn thiện quy trỡnh xỏc định đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy từ TB Tài liệu tham khảo Burglen L, Lefebvre S, Clermont O et al Structure and organization of the human survival motor neurone (SMN) gene Genomics 1996, 32, pp.497-482 Dreesen JC, Bras M, Die- Smulders C et al Preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy Mol Hum Reprod 1998, (9), pp.881-885 Graeme Daniels, Rachel Pettigrew, Alan Thornhill et al Six unaffected livebirths following preimplatation diagnosis for spinal muscular atrophy Mol Hum Reprod 2001, (10), pp.995-1000 Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S et al Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene Cell 102 1995, 80, pp.155-165 Meiki J, Abdelhak S, Sheth P et al Gene for chronic proximal spinal muscular atrophies maps to chromosome 5q Nature 1990, 344, pp.767-768 Meiki J, Abdelhak S, Sheth P et al De Novo and inherited deletions of the 5q13 region in spinal muscular atrophies Science 1994, 264, pp.1474-1477 Pearn J Classification of spinal muscular atrophies Lancet 1980, 1, pp.919-922 Rodrigues NR, Owen N, Talbot K, Ignatius J, Dubowitz V, Davies KE Deletions in the survival motor neurone gene on 5q13 in autosomal recessive spinal muscular atrophy Hum Mol Genet 1995, 4, pp.631-634 Taylor JE, Thomas NH, Lewis CM et al Correlation of SMNt and SMNc gene copy number with age of onset and survival in spinal muscular atrophy Eur J Hum Genet 1998, 6, pp.467-474 10 Wirth B An update of the mutation spectrum of the survival motor neurone gene (SMN1) in autosomal recessive spinal muscular atrophy (SMA) Hum Mutat 2000, 15, pp.228-237 Tạp chí y - dược học quân số 2-2015 102 ... Hồn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy từ TB bạch cầu, tách từ máu ngoại vi gia đình BN Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Chọn gia đình có độ tuổi từ. .. hoạt động bình thường Kết luận kiến nghị Từ kết trên, khẳng định bước đầu thành cụng việc hoàn thiện quy trỡnh xỏc định đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy từ TB Tài liệu tham khảo Burglen L, Lefebvre... cao, đủ đảm bảo để hoàn thiện quy trình phát đột biến gen gây bệnh teo tủy TB bạch cầu Kết nhân exon 7, gen SMN từ TB bạch cầu Mỗi mẫu máu, chúng tơi hút nhóm TB bạch cầu cho vào ống 0,2 ml khác