ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỊ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA MAI THỊ HỒNG DIỄM NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ, THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI TẠO ETHANOL TỪ THÂN CHUỐI BẰNG NẤM MEN KLUYVEROMYCES MARXIANVS CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Mã số: 60 54 01 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ Tp.Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2017 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG TP.HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TS Tôn Nữ Minh Nguyệt Cán chấm nhận xét 1: PGS.TS Hoàng Kim Anh Cán chấm nhận xét 2: TS Huỳnh Tiến Phong Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG TPHCM ngày 12 tháng 01 năm 2017 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: GS.TS Lê Văn Việt Mẩn - Chủ tịch PGS.TS Hoàng Kim Anh - Phản biện TS Huỳnh Tiến Phong - Phản biện PGS TS Ngô Đại Nghiệp - ủy viên TS Võ Đình Lệ Tâm - ủy viên, thư ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên:Mai Thị Hồng Diễm MSHV: 7141008 Ngày, tháng, năm sinh: 09 - 01 - 1990 Nơi sinh: Tây Ninh Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Mã số: 60540101 I Tên đề tài: Nghiên cứu trình tiền xử lý, thủy phân lên men đồng thời tạo ethanol từ thân chuối nấm men Kluyveromyces marxỉanus cố định gel alginate II Nhiệm vụ nội dung: Nhiệm vụ • Tiền xử lý bột thân chuối phương pháp hóa học • Cố định nấm men Kluyveromyces marxỉanus gel alginate • Khảo sát ảnh hưởng enzyme Viscozyme Cassava c trình thủy phân lên men đồng thời bột thân chuối tiền xử lý Nội dung • Tìm điều kiện tiền xử lý thích hợp cho bột thân chuối sử dụng dung dịch H2SO4 • dung dịch NaOH Xác định điều kiện cố định nấm men Kluyveromyces marxianus ttong gel alginate phù hợp với trình thủy phân lên men đồng thời bột thân chuối qua tiền xử lý • Khảo sát trình thủy phân lên men đồng thời bột thân chuối qua tiền xử lý sử dụng nấm men Kluyveromyces marxianus cố định gel alginate III Ngày giao nhiệm vụ: 04 - 07 - 2016 IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 04 - 12 - 2016 V Cán hướng dẫn: TS Tôn Nữ Minh Nguyệt Tp HCM, ngày 02 tháng 01 năm 2017 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA LỜI CẢM ƠN Trong khoảng thời gian thực luận văn, tơi gặp phải khó khăn định với quan tâm, giúp đỡ thầy bạn bè tơi hồn thành luận văn Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô TS Tôn Nữ Minh Nguyệt Cô tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Kế đến, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình động viên, ủng hộ tơi, giúp tơi chinh phục thử thách hồn thành ước mơ Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô môn Cơng Nghệ Thực Phẩm nói riêng khoa Kỹ Thuật Hóa Học nói chung giảng dạy, hỗ trợ kiến thức giúp tơi vừa hồn thành luận văn Tôi không quên gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Vương Thanh Thão, bạn Nguyễn Thị Yến, bạn Trần Minh Sanh anh chị, ban bè lớp CH2014 -2 đồng hành, giúp đỡ học tập thực luận văn Tp HCM, tháng 01 năm 2017 Mai Thị Hồng Diễm TĨM TẤT LUẬN VĂN Với mục đích sử dụng thân chuối làm chất cho trình thủy phân, lên men đồng thời tạo ethanol sử dụng nấm men Kluyveromyces marxianus cố định gel alginate, nội dung nghiên cứu luận văn gồm phần: Phần 1: nghiên cứu trình tiền xử lý thân chuối với dung dịch NaOH, dung dịch H2SO4 Khảo sát yếu tố nồng độ dung dịch, nhiệt độ thời gian tiền xử lý Thân chuối tiền xử lý tiến hành thủy phân với enzyme Viscozyme Cassava c nhằm đánh giá hiệu tiền xử lý, chọn điều kiện tiền xử lý cho hiệu cao Phần 2: khảo sát điều kiện cố định nấm men Kluyveromyces marxỉanus gel alginate bao gồm nồng độ dung dịch alginte, nồng độ dung dịch CaCl2 Nấm men sau cố định lên men môi trường chứa glucose để đánh giá hiệu lên men, mật độ nấm men tự thoát Sau chọn điều kiện cố định nấm men tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme Viscozyme Cassava c trình thủy phân, lên men đồng thời sử dụng thân chuối sau tiền xử lý làm chất Kết nghiên cứu cho thấy dung dịch NaOH tiền xử lý bột thân chuối hiệu dung dịch H2SO4 Qua trình thủy phân, bột thân chuối tiền xử lý với dung dịch NaOH nồng độ 3,0%, nhiệt độ ỐO°C, thời gian ố sau đạt hàm lượng đường khử tăng 386,27% so với bột thân thân chuối không tiền xử lý Điều kiện cố định nấm men phù hợp dung dịch alginate 1,0%, dung dịch CaCl2 1,0% Sau trình thủy phân lên men đồng thời với nồng độ enzyme Viscozyme Cassava c 15 FPU/g thu ethanol cao 13,22 g/L Qua thấy thân chuối thích hợp làm nguyên liệu cho trình thủy phân, lên men đồng thời tạo ethanol ABSTRACT The objective of tills research was to use banana pseudostem as substrate for simultaneous saccharification and fermentation for the production of ethanol using Kluyveromyces marxianus immobilized yeast in alginate gel, the experimentation consisted of two sections: Section 1: the research of banana pseudostem pretreatment with NaOH, H 2SO4 solution Investigation of factors such as the concentration of solution, temperature and time Pretreated banana pseudostem will be hydrolyzed with enzyme Viscozyme Cassava c to evaluate the effectiveness of pretreatment, select the pretreatment conditions for the highest efficiency Section 2: investigation the immobilized conditions of the Kluyveromyces marxianus yeast in alginate gels including the concentration of alginte and CaCl2 solution Immobilized yeast will be fermented with the medium containing glucose to assess the effect of fermentation, free yeast density After selecting immobilized conditions, the effect on the concentration of enzyme Viscozyme Cassava c in simultaneous saccharification and fermentation will surveyed, in wgich pretreated banana pseudostem is used as substrates The experimental results showed that NaOH solution pretreated banana pseudostem is more efficient than H2SO4 solution After hydrolyzing, banana pseudostem powder preheated with NaOH solution at a concenhation of 3.0%, temperature of 60 °C, time whithin hours reached a increased reducing sugar content by 386.27% over the non preheated banana pseudostem powder The suitable immobilized conditions were concentration of alginate 1.0% and CaCl2 1.0% solution After simultaneous saccharification and fermentation which enzyme Viscozyme Cassava c 15 FPU/g, the highest ethanol is 13.22 g/L was obtained In sumary, banana pseudostem is suitable material for simultaneous saccharification and fermentation for the production of ethanol LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu tác giả Các kết nghiên cứu kết luận luận văn trung thực không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG GIỚI THIỆU CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Lignocellulose 2.1.1 Cấu tạo lignocellulose 2.1.1.1 Cellulose 2.1.1.2 Hemicellulose 2.1.1.3 Lignin 2.1.1.4 Chất trích ly tro 2.1.2 Nguyên liệu giàu lignocellulose - thân chuối 2.1.2.1 Đặc điểm tự nhiên 2.1.2.2 Thành phần hóa học thân chuối 2.1.2.3 Hiện trạng sử dụng tiềm thân chuối 10 2.2 Quá trình tiền xử lý lignocellulose 11 2.2.1 Quá trình tiền xử lý lignocellulose acid 12 2.2.2 Quá trình tiền xử lý lignocellulose kiềm 14 2.3 Quá trình thủy phân lên men đồng thời 16 2.3.1 Quá trình thủy phân 16 2.3.1.1 Enzyme cellulase 17 2.3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình thủy phân cellulose enzyme cellulase 18 2.3.2 Quá trình lên men thu nhận ethanol từ lignocellulose 19 2.3.2.1 Quá trình thủy phân lên men đồng thời 20 2.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân lên men đồng thời 21 ii 2.3.2.3 Nam men Kluyveromyces marxianus 22 2.3.2.4 Nấm men cố định 23 2.4 Tính luận văn 24 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 26 3.1.1 Nguyên liệu 26 3.1.2 Hóa chất 28 3.1.3 Thiết bị 28 3.2 Phương pháp nghiên cứu 30 3.2.1 Nội dung nghiên cứu 30 3.2.2 Các quy trình sử dụng nghiên cứu 31 3.2.2.1 Quy trình tiền xử lý bột thân chuối 31 3.2.2.2 Quy trình cố định nấm men Kluyveromyces marxỉanus gel alginate 33 3.2.2.3 Quy trình thủy phân lên men đồng thời bột thân chuối tiền xử lý sử dụng nấm men Kluyveromyces marxỉanus cố định gel alginate 35 3.2.3 Thiết kế thí nghiệm 36 3.2.3.1 Khảo sát trình tiền xử lý bột thân chuối phương pháp hóa học 36 3.2.3.2 Khảo sát trình thủy phân lên men đồng thời bột thân chuối tiền xử lý sử dụng nấm men Kluyveromyces marxianus cố định gel alginate 38 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch alginate nồng độ dung dịch CaCl2 đến trình cố định nấm men 38 3.2.4 Phương pháp phân tích 40 3.2.4.1 Phân tích hố lý 40 3.2.4.2 Phân tích vi sinh 41 3.2.5 Cơng thức tính tốn 41 3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 41 39 Nhiệt độ: 40°C Nồng độ enzyme Viscozyme Cassava C: pH: 4,2 -°' ~’ ' _ A r 10 FPU/g, 15 FPU/g, 20 FPU/g, 25 Mật độ nâm men: 10.106 tê FPƯ/g bào/mL 3.2.4 Phương pháp phân tích 3.2.4.I Phân tích hố lý ❖ Xác định hoạt tính enzyme cellulase Hoạt tính enzyme Viscozyme Cassava c kiểm tra theo quy trình Phòng thí nghiệm lượng tái sinh Hoa Kỳ (NREL) [134], Quy trình kiểm tra hoạt tính enzyme xem phụ lục B Xác định hàm lượng đường khử phương pháp DNS Đường khử dung dịch xác định phương pháp dinittosalicylic acid (DNS) Miller (1959) [135] Phương pháp dựa nguyên tắc phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử dinitrosalicylic acid, cường độ màu tạo thành phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định Đo cường độ màu máy đo OD, bước sóng 540 nm Quy trình xác định hàm lượng đường khử xem phụ lục B Xác định hàm lượng ethanol Hàm lượng ethanol xác định sắc ký khí [136] 3.2.4.2 Phân tích vi sinh ♦♦♦ Phương pháp xác định mật độ nấm men Mật độ nấm men xác định phương pháp đếm trực tiếp, sử dụng kính hiển vi buồng đếm Thomas [137], Hỗn hợp sau lên men tách thành hai phần: dịch lên men hạt nấm men cố định Phương pháp đếm tính mật độ nấm men xem phụ lục B 3.2.5 Cơng thức tính tốn Độ tăng hàm lượng đường khử sau thủy phân D = Dx~D° xioo (%) Do Với: Dx: lượng đường khử tạo thành trình thủy phân bột thân chuối 40 tiền xử lý Do: lượng đường khử tạo thành trình thủy phân bột thân chuối ban đầu 3.2.6 Phương pháp xử lý số liệu Tất thí nghiệm thực lặp lại lần Sử dụng phương pháp phân tích phương sai Anova để kiểm tra độ tin cậy với mức ý nghĩa a = 0,05 để đánh giá khác biệt kết thí nghiệm, sử dụng phần mềm thống kê Statgraphics Centurion XV 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Thành phần hóa học bột thân chuối Bảng 1: Thành phần hóa học bột thân chuối (% tính theo khối lượng khơ) Cellulose 40,26 ± 0,71 Hemicellulose 15,60 ± 0,47 Lignin 12,42 ± 0,52 So sánh với Bảng 2.1, thấy hàm lượng cellulose, hemicellulose lignin mẫu bột thân chuối nghiên cứu có sai khác so với kết phân tích thành phần thân chuối tác giả khác Xét riêng hàm lượng cellulose kết phân tích lại thấp so với nghiên cứu Gonẹalves Filho et al (2013), Gabhane et al (2013) tương ứng 44,00%, 44,32 [41], [43], Tuy nhiên, kết lại cao so với nghiên cứu Corderio et al (2003), Oliveira et al (2007), Zhang et al (2013) với hàm lượng cellulose 34,50%; 37,30% 32,36% [34], [42], [40], Kết phân tích hàm lượng hemicellulose bột thân chuối nghiên cứu Bảng 4.1 cao so với kết Zhang et al (2013) thấp so với Corderio et al (2003), Gabhane et al (2013) với hàm lượng hemicellulose 14,60%; 25,60% 22,00% [40], [34], [43], Khi so sánh cách tổng quát, hàm lượng cellulose hemicellulose bột thân chuối nghiên cứu gần giống với nguyên liệu lignocellulose dạng cỏ khác rơm lúa mì (36,00% 26,00%); cỏ kê Mỹ (36,20% 20,10%) [138], [139], Hàm lượng lignin ttong mẫu bột thân chuối nghiên cứu thấp so với hàm lượng 18,36% nghiên cứu Zhang et al (2013), Oliveira et al (2007) cao so với kết Gabhane et al (2013), Cordeiro et al (2003), Gonẹalves Filho et al (2013) với hàm lượng lignin 18,36;13,30%, 9,66%, 12,00%, 8,07%, [40], [42], [43], [34], [41], Hàm lượng lignin bột thân chuối tương tự loại nguyên liệu lignocellulose dạng cỏ khác trấu đại mạch (13,80%), trấu lúa gạo (13,30%) [140], 42 [141], Nhìn chung, hàm lượng thành phần bột thân chuối có sai khác so với kết nghiên cứu tác giả khác khác biệt giống chuối, điều kiện sinh trưởng, tuổi chuối Ngoài phương pháp, cách thức thực sai số thí nghiệm dẫn tới khác biệt Hàm lượng cellulose nguyên liệu cao tạo nhiều glucose trình thuỷ phân Tuy nhiên, cấu trúc lignocellulose cần quan tâm hemicellulose lignin Hai thành phần bao bọc, che phủ làm giảm diện tích tiếp xúc enzyme; đặc biệt lignin, hoàn toàn bị phân huỷ điều kiện lên men ethanol [29], [26], Vì vậy, trình loại bỏ hemicellulose lignin cần thiết để nâng cao hiệu q trình lên men ethanol từ lignocellulose Ngun liệu có hàm lượng cellulose cao, hemicellulose lignin thấp khiến trình tiền xử lý diễn dễ dàng, nhanh chóng dẫn đến hiệu tồn q trình cao [33], Bột thân chuối có hàm lượng cellulose hemicellulose cao chiếm nửa khối lượng khô bột thân chuối hàm lượng lignin thấp giúp cho trình tiền xử lý thân chuối diễn thuận lợi, nâng cao hiệu trình thủy phân lên men đồng thời đạt hiệu cao Do đó, tiềm sản xuất ethanol từ thân chuối lớn 4.2 Khảo sát trình tiền xử lý bột thân chuối phương pháp hóa học Kết thí nghiệm tiền xử lý bột thân chuối phương pháp hóa học đánh giá qua độ tăng hàm lượng đường khử thu từ trình thuỷ phân bột thân chuối tiền xử lý so với bột thân chuối không tiền xử lý 4.2.1 Tiền xử lý bột thân chuối dung dịch II2SO4 4.2.1.1 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch H2SO4 đến trình tiền xử lý bột thân chuối dung dịch H2SO4 Bột thân chuối tiền xử lý 121°c với nồng độ dung dịch H2SO4 thay đổi từ 0,5 - 4,0% 15 phút 43 Các giá trị có ký hiệu khác hình thể khác có ỷ nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% (P