Đang tải... (xem toàn văn)
Luận văn nhằm các mục tiêu: (1) Tối ưu được môi trường lên men thu nhận hoạt chất acarbose từ Actinoplanes sp. KCTC 9161 đạt năng suất cao; (2) Nâng cao khả năng sản xuất hoạt chất acarbose bằng phương pháp gây đột biến; (3) Xây dựng được quy trình tách chiết, tinh sạch acarbose.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ THỊ TÂM TIẾN NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC i Hà Nội 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS. NGUY ỄN QUANG HUY ii Hà Nội 2013 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tun, Phó trưởng phòng Cơng nghệ sinh học enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn và giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện đề tài luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trưởng khoa, Phụ trách Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình học tâp Tơi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian cho tơi thực hiện đề tài Tơi xin cảm ơn tập thể Phòng Cơng nghệ sinh học enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học, tập thể Bộ mơn Sinh lý thực vật và hóa sinh, trường Đại học Khoa học tự nhiên, đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tơi trong q trình thực nghiệm cũng như chia sẻ những kinh nghiệm chun mơn Tơi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Hùng Vương, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Nơng Lâm Ngư, trường Đại học Hùng Vương đã ln quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi đi học và hồn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp iii Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã ln giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tơi trong suốt thời gian học tập Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Học viên Hà Thị Tâm Tiến MỤC LỤC MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC HÌNH VẼ ix BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT xiii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG . 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 .1.1. Khái quát về acarbose 3 .1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose 3 .1.3. Vai trò của acarbose 5 .1.3.1. Vai trò của acarbose đối với bệnh đái tháo đường 5 .1.3.2. Nghiên cứu về các tác dụng khác của acarbose 8 .1.4. Vai trò Actinoplanes trong sinh tổng hợp acarbose 9 .1.4.1. Đại cương về Actinoplanes 9 iv .1.4.2. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 10 .1.4.3. Ứng dụng Actinoplanes trong sản xuất acarbose 12 .1.5. Nghiên cứu hoạt chất acarbose trên thế giới 13 .1.5.1. Nghiên cứu về sản xuất acarbose 13 .1.5.2. Nghiên cứu về ứng dụng đột biến trên vi sinh vật 17 .1.5.3. Các phương pháp tinh sạch và thu nhận acarbose 18 .1.5.4. Nghiên cứu sản xuất acarbose trong nước 21 CHƯƠNG . 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 .2.1. Vật liệu và hóa chất 24 .2.1.1. Chủng giống 24 .2.1.2. Hóa chất 24 .2.1.3. Môi trường 24 .2.1.4. Thiết bị thí nghiệm 25 .2.2. Phương pháp nghiên cứu 26 .2.2.1. Lên men chìm ni cấy vi sinh vật 26 2.2.2. Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 26 .2.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 27 .2.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitrogen khi nuôi cấy 27 .2.2.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc, nhiệt độ và pH khi nuôi cấy 27 .2.3. Gây đột biến bằng NTG 28 v .2.4. Sắc ký lớp mỏng TLC 28 .2.5. Hoạt tính ức chế αglucosidase của hoạt chất acarbose 29 .2.6. Tách chiết và tinh sạch acarbose 30 .2.6.1. Tách chiết và tinh sạch sơ bộ 30 .2.6.2. Tinh sạch acarbose bằng sắc ký cột 30 .2.7. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 32 .2.8. Sắc ký lỏng ghép khối phổ 32 2.9. Xác định cấu trúc phân tử acarbose bằng cộng hưởng từ hạt nhân 33 .2.10. Phương pháp xử lý số liệu 33 CHƯƠNG . 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 .3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy 34 3.2. Tối ưu các thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy 37 .3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian 37 .3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn maltose 38 .3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn glucose 40 .3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn bột ngô 42 .3.2.5. Ảnh hưởng của pH môi trường 43 .3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 44 .3.2.7. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 45 .3.2.8. Môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu 46 vi .3.2.9. Xác định hàm lượng acarbose bằng HPLC 47 .3.3. Gây đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 49 .3.4. Tinh sạch acarbose có hoạt tính ức chế αglucosidase 51 3.4.1. Chọn lựa các phương pháp tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 51 .3.4.1.1. Tinh sạch bằng sắc ký hấp thụ silica gel 51 .3.4.1.2. Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sephadex G100 52 .3.4.1.3. Tinh sạch bằng cột than hoạt tính 1 53 3.4.2. Chọn lựa các phương pháp tinh sạch acarbose từ dịch qua cột than 1 54 3.4.2.1 Tinh sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 54 3.4.2.2 Tinh sắc ký trao đổi anion DEAE sepharose 55 .3.4.3. Tinh sạch và thu nhận acarbose 55 Như vậy chúng tơi đã tinh sạch được hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 với kết quả được trình bày ở bảng 3.1. Từ 500 ml dịch lên men với hàm lượng 10,48 mg/ml acarbose, qua các bước tinh sạch thu được 20 ml dịch acarbose tinh sạch cơ đặc có hàm lượng 191,5 mg/ml acarbose. Như vậy, hiệu suất thu hồi sau q trình tinh sạch đạt 73,1% acarbose. 59 .3.4.4. Hoạt tính ức chế αglucosidase 59 .3.5. Xác định cấu trúc hóa học acarbose 60 vii .3.6. Quy trình tách chiết tinh sạch acarbose 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 Kết luận 65 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 73 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Thành phần mơi trường ni cấy vi sinh vật .24 Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị thí nghiệm được sử dụng 25 Bảng 2.3. Các môi trường khảo sát nghiên cứu .26 Bảng 3.4. Khối lượng chế phẩm qua các bước tinh sạch acarbose 59 viii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của acarbose Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose trong ruột non .4 Hình 1.3. Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 .12 ix Hình 3.4. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong các mơi trường lên men .35 Hình 3.5. Hoạt tính ức chế αglucosidase trong các môi trường lên men 36 Hình 3.6. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian 37 Hình 3.7. Hoạt tính ức chế αglucosidase của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian .38 Hình 3.8. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về ảnh hưởng của nồng độ maltose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 39 Hình 3.9. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về ảnh hưởng của nồng độ glucose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 41 Hình 3.10. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về ảnh hưởng của nồng độ bột ngơ đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 42 Hình 3.11. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 44 Hình 3.12. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về ảnh hưởng của nhiệt độ ni cấy đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 45 x Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 3.6. Quy trình tách chiết tinh sạch acarbose Từ các dữ liệu nghiên cứu trên, chúng tơi xây dựng được quy trình tách chiết, tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 quy mơ phòng thí nghiệm Dịch lên men (8 ngày) (1) Hòa vào than hoạt tính tại pH 3, khuấy 1 giờ, để lạnh sau 12 giờ, rửa 3 đến 5 lần bằng nước cất Hỗn hợp than hoạt tính và dịch lên men (2) Nhồi lên cột Sắc ký cột than hoạt tính 1 (Hệ dung mơi ethanol từ 5% đến 20%) (3) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cơ đặc 90% Sắc ký cột than hoạt tính 2 (Hệ dung mơi ethanol từ 5% đến 15%) (4) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột amberlite XAD 1600T (Hệ dung môi gồm: acetone 10%) (5) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 20% Sắc ký cột amberlite IRA67 (Rửa bằng nước) (6) Dịch acarbose tinh sạch (7) Cô cạn và kết tủa trong methanol acarbose Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 64 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Hình 3.32. Qui trình tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Môi trường điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 gồm thành phần (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngơ, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 trong điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút và thời gian 192 giờ, cho năng suất đạt 9,98 g/l acarbose tăng gấp 3,4 lần so với trước tối ưu 2. Khả năng ức chế αglucosidase của hoạt chất acarbose sinh ra từ Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong mơi trường tối ưu tăng 5,4% so với mơi trường trước tối ưu, đạt 54,2% 3. Đã tạo ra được dòng đột biến N217 từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 có khả năng sinh tổng hợp acarbose cao, cho năng suất 10,94 g/l tăng 0,96 g/l so với chủng tự nhiên và cho hoạt tính ức chế αglucosidase của hoạt chất acarbose đạt 52,8% tăng gấp 1,35 lần đối chứng 4. Xây dựng được quy trình tách chiết, tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 bằng sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính, sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67. Hiệu suất thu hồi acarbose đạt 73,1% 5. Hoạt chất acarbose thu được có một băng đậm ngang chuẩn trên sắc ký đồ TLC (Rf = 0,28), có độ tinh sạch 98%. Hoạt tính ức chế αglucosidase của dịch acarbose tinh sạch đạt 68,7% tăng 1,6 lần so với dịch lên men Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 65 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Kiến nghị 1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 quy mơ pilot 2. Thử nghiệm, đánh giá chất lượng của chế phẩm acarbose tạo ra, định hướng trong sản xuất thuốc điều trị đái tháo đường type 2 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Bộ Y tế (2012), "Dược thư quốc gia Việt Nam 2", Cơng báo số 119, 1, tr. 812 2. Lê Văn Chi (2004), "Tăng đường huyết sau ăn", Tạp chí Thơng tin Tim mạch học, 8, tr. 3742 3. Phạm Hữu Điển (2003), "Một số hợp chất thiên nhiên từ thực vật có tác dụng hạ đường huyết", Tạp chí Dược học, (7), tr 1012 4. Nguyễn Lân Dũng (2006), Phân loại xạ khuẩn, Thư viện Học liệu mở Việt Nam, tr. 111 5. Vũ Ngọc Lộ (2005), "Những dược liệu có tác dụng hạ đường huyết và trị tiểu đường", Tạp chí Dược học, (353), tr. 79 6. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam 7. Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tun, Lê Thanh Hồng, Quyền Đình Thi (2013), "Nghiên cứu thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose ở Actinoplanes sp. KCTC 9161". Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, 1, tr. 403406 8. Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương, Đỗ Anh Vũ (2008), "Tác dụng hạ đường huyết của dây thìa canh Gymnema sylvestre", Tạp chí Dược học, (391), tr 3133 9. Cơng Sơn, Thế Ân (2013), Phòng và trị bệnh ung thư, tiểu đường, NXB Hồng Đức, Hà Nội Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 66 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 10. Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tun, Lê Thị Trang, Lê Thanh Hồng (2012), "Nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ dòng đột biến Actinoplanes VTCC A1779", Tạp chí Hóa học, 50(5A), tr. 113116 11. Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh (2011), "Tuyển chọn các chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp chất ức chế αglucosidase để điều trị bệnh đái tháo đường type 2", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 9, tr. 729735 12 Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2013), "Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. VTCCA1779 và các biến thể", Tạp chí Y học Việt Nam, (2), tr. 7175 13 Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hồng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2011), "Sàng lọc một số chủng Actinoplanes sp. sinh tổng hợp cao chất acarbose có tính ức chế αglucosidase", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 9, tr. 861865 Tài liệu tiếng anh 14 Beenken KE, Hawkins AR, Frost JW, Brown KA (2012), "Impact of extracellular nuclease production on the phenotype of Staphylococcus aureus under in vitro and in vivo conditions", Infect Immun, 80(5), pp. 16341638 15. Bischoff H (1994), "Pharmacology of alphaglucosidase inhibition", Eur J Clin Invest, 24(3), pp. 310 16. Blanch M, Calsamiglia S, Devant M, Bach A (2010), "Effects of acarbose on ruminal fermentation, blood metabolites and microbial profile involved in ruminal acidosis in lactating cows fed a highcarbohydrate ration", J Dairy Res, 77, pp. 123128 17 Bock K, Pedersen H (1984), "The solution conformation of acarbose", Carbohydrate Research, (132), pp. 142149 18. Cavalleri B, Pagani H, Volpe G, Selva E, Parenti F (1884), "A new antibiotic from Actinoplanes: fermentation, isolation and prelimilary physicochemical characteristics", The Journal of Antibiotics, 37(4), pp. 309317 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 67 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 19. Choi BT, Shin CS (2003), "Reduced formation of by product component C in acarbose fermentation by Actinoplanes sp. CKD 48516", Biotechnol Prog, 19, pp. 16771682 20. Cordero BF, Obraztsova I, Couso I, Leon R, Vargas MA, Rodriguez JF (2011), "Enhancement of lutein production in Chlorella sorokiniana by improvement of cuture conditions and random mutagenesis", MarDrugs, 9(9), pp. 1607 1624 21. Couch JN (1950), "Actinoplanes, a new genus of the actinomycetales", Journal of the Elisha Michell Scientific Society, (66). 22 Dehghan P, Gagari BP (2013), "Efects of high performance inulin supplementation on glucemic status and lipid profile in women with type 2 diabetes: A randomized, Placebocontrolled cilinical trial", Health Promotion Perspectives, 3(1), pp. 5563 23. Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidt D (1979), "New enzyme inhibitors from microorganisms", Planta Med, 35(3), pp. 195217 24 Frommer W, Plus W, Schafer D, Schmidet D (1975), "Glycosidehydrolase enzyme inhibitors", United States Patent, US 3876766 25. Hayashim T (2008), "The alphaglucosidase inhibitor acarbose reduces the net electronegative charge of lowdensity lipoprotein in patients with newly diagnosed type 2 diabetes", Clin Chim Acta, 390, pp. 110114 26 Hemker M, Stratmann A, Goeke K, Schroder W, Lenz JG, Piepersberg W, Paper H (2001), "Identification, cloning, expression and charecterization of the extracellular acarbosemodifying glycotransferase, AcbD from Actinoplanes sp. strain SE50", Journal of Bacteriology, 183(15), pp. 4484 4492 27. Hong CL, Kim KH, Choi BT, Choi S, Choi R (2003), "Process for preparing acarbose with high purity", United States Patent, US 6649755B1 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 68 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 28. Hu ZC, Zheng YG (2011), "Enhancement of 1,3dihydroxyacetone production by a UVinduced mutant of Gluconobacter oxydans with DO control strategy", Appl Microbiol Biotechnol, 165(56), pp. 11521160 29. Huh JH, Kim DJ, Zhao XQ, Li M, Jo YY, Yoon TM (2004), "Widespread activation of antibiotics biosynthesis by Sadenosylmethionine in Streptomycetes", FEMS Microbiol Lett, 238, pp. 439447 30. Jung H, Jeya M, Kim S, Kumar SR, Zhang Y, Lee J (2009), "Biosynthesis, biotechnological production, and application of teicoplanin: current state and perspective", Applied Microbiology and Biotechnology, 84(3), pp. 417428 31. Keri V, Deak L (2002), "Method for purification of acarbose", United States Patent, US 20020183262A1 32 Klein A, Selber K, Wehlmann H, Rosen W, Puhler A, Schwientek P, Kalinowski J, Wehmeier UF (2013), "New Actinomycete intergrative and conjugative element from Actinoplanes sp. SE50/110 as plasmid for genetic transformation of related Actinobacteria", International Publication Number, WO 2013/083566 A1 33. Lange PM, Rauenbusch E (1987), "Polymers for the purification of acarbose", United States Patent, US 4666776 34. Lechevalier H, Lechevalier M (1970), "In the Actinomycetales", Veb G Fisher, pp. 393405 35. Lee JS, Hai T, Paper H, Kim TJ, Suh JW (2008), "Three trehalose synthetic pathways in the acarboseproducing Actinoplanes sp. SN223/29 and evidence for the Tre role in biosynthesis of component C", Appl Microbiol Biotechnol, 80(5), pp. 767778 36. Lee S, Saueribrei B, Niggemann J, Egelkraut E (1997), "Biosynthesic studies on the alfaglucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp source of the maltose unit", J Antibiot (Tokyo), 50, pp. 767778 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 69 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 37. Lee SS, Egelkrout E (1998), "Studies on the aglucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp.: glutamate is the primary source of the nitrogen in acarbose", J Antibiot, 51(11), pp. 225227 38. Li KT, Hou J, Wei SJ, Cheng X (2012), "An optimized industrial fermentation processes for acarbose production by Actinoplanes sp A56", Bioresource Technology, 118, pp. 580583 39 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CH (2007), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 7253278 B2 40 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CS (2005), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 20050118686A1 41. Mahmud T (2003), "The C7N aminocyclitol family of natural products", Nat Prod Rep, 20, pp. 137166 42 Mori Y, Shiozaki M, Matsuura K, Tanaka T, Yokoyama J, Utsunomiya K (2011), "Evaluation of efficacy of acarbose on glucose fluctuation and postprandial glucose using continuous glucose monitoring in type 2 diabetes mellitus", Diabetes Technol Ther, 13, pp. 467470 43. Parenti F, Coronelli C (1979), "Member of the genus Actinoplanes and their antibiotics", Annual Review of Microbiology, 33(1), pp. 389341 44. Parenti F, Pagani H, Beretta G (1975), "Lipiarmycin, a new antibiotic from Actinoplanes", The Journal of Antibiotics, 28(4), pp. 247252 45 Rauenbush E (1990), "Highly pure acarbose", United States Patent, US 4904769 46. Rodriguez JF, Antonio DL, Manuel C, Fatima C (2008), "Application of ion exchange to purify acarbose from fermemtation broths", Biochemical Engineering, 40, pp. 130137 47. Schmidet DD, Frommer W, Junge B, Muller L, Wingender W, Truscheit E, Schafer D (1997), "Alphaglucosidase inhibitors new complex Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 70 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên oligosaccharides of microbial origin", Die Naturwissenschaften, 64(10), pp. 535536 48 Schwientek P (2012), "Genomics and Transcriptomics of the industrial Acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110", Bielefeld University, Germany, 155 pages 49. Schwientek P, Szczepanowski R, Ruckert C, Kalinowski J, Klein A, Selber K, Wehmeier UF, Stoye J, Puhler A (2012), "The complete genome sequence of acarbose producer Actinoplanes sp. SE50/110", BMC Genomic, 13(112), pp. 18 pages 50 Shah MM, Cheryan M (1995), "Acetate production by Clostridium thermoaceticum in corn steep liquor media", J Ind Microbiol, 15, pp. 424428 51 Silveira MM, Wisbeck E, Hoch I, Jonas R (2001), "Production of glucose– fructose oxidoreductase and ethanol by Zymomonas mobilis ATCC 29191 in medium containing corn steep liquor as a source of vitamins", Appl Microbiol Biotechnol, 55. 52 Sun LH, Li MG, Wang YS, Zheng YG (2012), "Significantly enhanced production of acarbose in fedbatch fermentation with the addition of S adenosylmethionine", Microbiol Biotechnol, 22, pp. 826831 53. Truscheit E, Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidet D (1981), "Chemistry and biochemistry of microbial aglucosidase inhibitors", Angjewandte Chemie International Edition in English, 20(9), pp. 744761 54 Tsujino D, Nishimura R, Taki K, Morimoto A, Tajima N, Utsunomiya K (2011), "Comparing the efficacy of αglucosidase inhibitors in suppressing postprandial hyperglycemia using continuous glucose monitoring: a pilot studythe major study", Diabetes Technol Ther, 13, pp. 303308 55. Ventura M, Canchaya C, Tauch A, Chandra G, Fitzgerald GF, Chater KF, Van Sinderen D (2007), "Genomics of Actinobacteria: tracing the evolutionary history of an ancient phylum", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(3), pp. 495548 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 71 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 56. Wang Y, Yu L, Zheng YG, Wang YH, Shen YC (2013), "Acarbose isolation with gel type strong acid cation exchange resin: Equilibrium, Kinetic and Thermodynamic studies", ChinJChemEng, 21(10), pp. 11061113 57. Wang YJ, Dong F, Yu L, Zheng YG (2012a), "Study on acarbose adsorption performance of cation exchanger SAC 001x7", ChinJChemEng, (3), pp. 493 498 58. Wang YJ, Liu LL, Feng ZH, Liu ZQ, Zheng YG (2011), "Optimization of media composition and culture conditions for acarbose production by Actinoplanes utahensis ZJB08196", Microbiol Biotechnol, 27, pp. 27592766 59 Wang YJ, Liu LL, Wang YS, Xue YP, Zheng YG, Shen YC (2012b), "Actinoplanes utahensis ZJB08196 fedbatch fermentation at elevated osmolality for enhancing acarbose production", Bioresource Technology, 103, pp. 337342 60 Wehmeier UF (2003), "The biosynthesis and metabolism of acarbose in Actinoplanes sp. SE 50/110", Biocatalysis and biotransformation, 21(45), pp. 279284 61. Wei SJ, Cheng X, Huang L, Li KT (2010), "Medium optimization for acarbose production by Actinoplanes sp. A56 using the response surface methodology", African Journal of Biotechnology, 9, pp. 18491854 62 Whistler RL, Durso DF (1949), "Chromatographic Separation of Sugar on Charcoal", Purdue University, 72, pp. 667679 63 Xue YP, Qin JW, Wang YJ, Wang YS, Zheng YG (2013), "Enhanced production of acarbose and concurrently reduced formation of impurity C by addition of validaminein fermentation of Actinoplanes utahensis ZJB08196", BioMed Research International, 9 pages 64. Yamaki K, Mori Y (2006), "Evaluation of αglucosidase inhibitory activity in colored foods : a trial using slope factors of regression curves", Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 53(4), pp. 229231 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 72 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên PHỤ LỤC Bảng P1. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong 5 mơi trường lựa chọn Mơi trường MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 Lần 1 50,9 42,3 51,0 49,2 Ức chế αglucosidase (%) Lần 2 Lần 3 Trung bình 52,7 53,1 52,2 ± 1,2 47,1 45,8 45,1 ± 2,5 0 43,8 46,0 46,6 ± 4,1 51,0 53,0 51,0 ± 1,9 Bảng P2. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian Thời gian (giờ) 4872 96 Ức chế αglucosidase (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 19,1 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 15,9 73 20,8 18,6 ± 2,5 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 120 144 168 192 216 36,8 51,9 51,8 57,3 56,6 35,9 44,7 47,3 52,5 48,4 41,1 42,0 51,7 55,8 51,7 38,0 ± 2,9 46,2 ± 5,1 50,3 ± 2,6 55,2 ± 2,4 52,2 ± 4,1 Bảng P3. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo nồng độ maltose Nồng độ maltose (g/l) 20 30 40 50 60 Ức chế αglucosidase (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 39,0 50,8 54,7 54,8 50,1 35,2 48,5 47,7 50,4 50,3 35,6 47,7 46,8 50,4 47,2 36,6 ± 2,1 49,0 ± 1,6 49,7 ± 4,3 51,9 ± 2,5 49,2 ± 1,7 Bảng P4. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo nồng độ glucose Nồng độ glucose (g/l) 10 20 30 40 50 Ức chế αglucosidase (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 28,1 29,2 41,0 42,5 43,8 27,7 34,6 42,7 44,1 43,9 32,1 33,8 45,6 44,0 45,5 29,3 ± 2,4 32,6 ± 2,9 43,1 ± 2,3 43,5 ± 0,9 44,4 ± 1,0 Bảng P5. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo nồng độ bột ngơ Nồng độ bột ngơ (g/l) 10 15 20 25 Ức chế αglucosidase (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 24,7 26,1 50,9 55,3 48,2 47,5 24,2 34,1 50,2 56,0 48,4 47,7 26,4 31,4 45,5 52,2 52,7 48,9 25,1 ± 1,1 30,6 ± 4,0 48,9 ± 2,9 54,5 ± 2,0 49,8 ± 2,5 48,0 ± 0,8 Bảng P6. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo giá trị pH môi trường Giá trị pH môi trường 6,0 6,5 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Ức chế αglucosidase (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 39,6 35,6 40,1 38,4 ± 2,4 43,3 46,4 44,8 44,8 ± 1,5 74 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên 7,0 7,5 8,0 8,5 42,9 29,4 31,9 31,9 39,6 35,7 29,2 30,3 40,3 32,4 34,1 30,7 40,9 ± 1,7 32,5 ± 3,2 31,7 ± 2,4 31,0 ± 0,8 Bảng P7. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy (oC) 25 28 30 37 Lần 1 Ức chế αglucosidase (%) Lần 2 Lần 3 Trung bình 48,3 40,3 39,4 41,0 47,2 45,1 47,2 46,1 46,8 43,3 44,4 43,7 47,5 ± 0,7 42,9 ± 2,4 43,7 ± 3,9 43,6 ± 2,6 Bảng P8. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo tốc độ lắc khi ni cấy Tốc độ lắc (vòng/phút) 100 150 200 220 Ức chế αglucosidase (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 42,6 47,8 47,3 46,0 41,0 45,6 47,3 40,1 45,5 48,3 44,5 43,7 43,0 ± 2,3 47,3 ± 1,4 46,4 ± 1,6 43,3 ± 3,0 Bảng P9. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trước và sau tối ưu Mơi trường tơi ưu Trước Sau Ức chế αglucosidase (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 48,5 49,5 48,5 48,8 ± 0,6 53,3 53,7 55,5 54,2 ± 1,2 Bảng P10. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 Mẫu Dịch lên men Cột than 1 Cột amberlite IRA 400 Cột DEAEsepharose Cột than 2 Dịch tinh sạch Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Ức chế αglucosidase (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 39,3 46,1 43,2 42,9 ± 3,4 16,7 17,5 15,2 16,5 ± 1,2 22,1 18,4 20,5 20,3 ± 1,9 33,7 28,9 28,3 30,3 ± 3,0 57,1 57,9 59,1 58,0 ± 1,0 68,0 67,9 70,2 68,7 ± 1,3 75 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Bảng P11. Hoạt tính ức chế αglucosidase của mẫu acarbose từ dịch lên men các dòng đột biến từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 Dòng đột biến Ký hiệu ĐC 10 11 12 13 14 15 TN N211 N212 N213 N214 N215 N216 N217 N111 N112 N121 N122 N123 N124 N125 N311 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Ức chế αglucosidase (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 39,8 38,9 39,0 39,2 ± 0,5 40,1 42,4 40,2 40,9 ± 1,3 36,5 37,8 37,9 37,4 ± 0,8 50,9 50,9 50,2 50,7 ± 0,4 49,4 49,7 50,0 49,7 ± 0,3 46,4 48,8 47,6 47,6 ± 1,2 47,9 48,6 51,7 49,4 ± 2,0 52,0 53,3 53,0 52,8 ± 0,7 49,7 49,7 48,8 49,4 ± 0,5 50,4 53,4 47,7 50,5 ± 2,9 51,4 51,0 48,9 50,4 ± 1,3 40,1 41,4 41,6 41,1 ± 0,9 40,8 37,9 35,2 38,0 ± 2,8 39,8 37,8 43,0 40,2 ± 2,6 42,7 41,4 39,7 41,3 ± 1,5 49,4 52,2 50,4 50,7 ± 1,4 76 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Hình P1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân COSY mẫu acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 Hình P2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13CPD và DEPT mẫu acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 77 Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Hình P3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HMBC và HSQC mẫu acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 78 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC... Hình 3.30. Phổ proton 1HNMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ d ịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 .62 Hình 3.31. Cấu trúc phân tử acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. .. dụng nguồn nguyên liệu dễ kiếm. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tơi thực hiện đề tài: Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong khn khổ đề