Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết tìm hiểu vai trò sinh lý của Enzym PDH45 trong quá trình sinh trưởng phát triển của thực vật, nghiên cứu chuyển gien PDH45 theo cả hai hướng có nghĩa và đối nghĩa sử dụng cây thuốc là làm mô hình thử nghiệm.
25(3): 83-92 9-2003 T¹p chÝ Sinh häc Chun gien m hóa enzym mở xoắn ADn (PDH45) vào thuốc (Nicotiana tabacum L cv Xanthi) qua Agrobacterium Và PHÂN TíCH CáC đợc CHUYểN GiEN phạm xuân hội, trần q ViƯn Di trun n«ng nghiƯp phan tn nghÜa Tr−êng đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN Narendra Tuteja Trung tâm Kỹ thuật gien Công nghệ sinh học quốc tế Với chức xúc tác việc mở xoắn ADN sợi đôi để tạo hai sợi đơn, ADN helicaza đóng vai trò quan trọng tất hoạt ®éng trao ®èi chÊt ADN RÊt nhiỊu ADN helicaza cđa thể khác nh vi khuẩn, thực khuẩn thể, nấm men, động vật có vú ngời đ đợc phát hiện, nghiên cứu đặc tính xác định chức chúng Gần đây, gien mă hóa cho ADN helicaza (PDH45) đậu Hà Lan, gien helicaza giới thực vật, đ đợc phân lập nghiên cứu đặc tính Các nghiên cứu hoạt tính enzym đ chứng minh PDH45 protein quan trọng với nhiều chức nh tham gia vào trình sinh tổng hợp protein, trì hoạt động tế bào kích thích họat động topoisomeraza I [11] Trong công trình này, với mục đích sâu tìm hiểu vai trò sinh lý enzym PDH45 trình sinh trởng phát triển thực vật, đ tiến hành nghiên cứu chuyển gien pdh45 theo hai hớng có nghĩa (sense) đối nghĩa (antisense) sử dụng thuốc làm mô hình thử nghiệm I phơng pháp nghiên cứu Vật liệu Giống thuốc Nicotiana tabacum cv xanthi Trung tâm Kỹ thuật gien Công nghƯ sinh häc qc tÕ (TTKTG&CNSHQT) cung cÊp Chđng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA-4404 đặt mua từ h ng Novagen Vect¬ chun gien thùc vËt pBI121 cđa h ng Clonetech Các chất kháng sinh hóa chất sử dụng c¸c thÝ nghiƯm cđa h ng Promega, Sigma, Serva, USB Thí nghiệm đợc tiến hành TTKTG&CNSHQT, Niu Đeli Phơng pháp a) Cấu trúc vectơ tái tổ hợp mang gien pdh45 theo hớng có nghĩa đối nghĩa Vectơ pBI121 đợc sử dụng cho việc chuyển gien pdh45 vào thuốc theo hai hớng có nghĩa đối nghĩa Phần trình tự ADN m hóa gien pdh45 đợc nhân lên PCR sử dụng mồi đầu 5' mang ba khởi đầu trình tự nhận mặt NdeI mồi đầu 3' mang ba kết thúc trình tự nhận mặt XbaI Sản phẩm phản ứng PCR đợc gắn vào vectơ pGEM-T Easy, sau chuyển vào tế bào khả biến E coli DH5 để nhân lên plasmit tái tổ hợp Plasmit tái tổ hợp đợc cắt EcoR I sau phần m hóa gien pdh45 đợc gắn vào vectơ pBluescript đ đợc cắt EcoR I Phần m hóa gien pdh45 vectơ pBluescript lại đợc tách cách cắt vectơ với XbaI sau lại gắn vào vectơ pBI121 đợc cắt enzym Sản phẩm gắn đợc chuyển vào tế bào khả biến E coli DH5 nuôi môi trờng LB chứa 50àg/ml kanamyxin Phần m hóa gien pdh45 gắn vào vectơ pBI121 theo hớng có nghĩa đối nghĩa đợc phân biệt cách cắt plasmit tái tổ hợp (pBI121-PDH45) HindIII phân tích sản phẩm cắt gel agarosa 0,9% 83 b) Chuyển phần trình tự m hóa gien pdh45 vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 Plasmit tái tổ hợp pBI121-PDH45 theo hớng có nghĩa đối nghĩa đợc chuyển vào chủng vi khuẩn LBA 4404 theo phơng pháp làm đông lạnh-làm tan nh mô tả Horsch cs [5] c) Chuẩn bị mẫu thuốc cho việc chuyển gien pdh45 Hạt thuốc đợc khử trùng bề mặt dịch rửa (bleach 1% + tween-20 1%), 20 phút; etanol 70%, 2-3 phút sau đợc rửa lại nhiều lần (9-10 lần) nớc cất Hạt thuốc đ khử trùng đợc rải lên đĩa petri chứa môi trờng MS (3,44 g muèi MS/l, sacaroza 3%, 1x vitamin B5 cña Gamborg, pH 5,8 agar 0,8%) ủ điều kiện ánh sáng, độ ẩm nhiệt độ phòng thí nghiệm Sau hạt thuốc nảy mầm, đợc chuyển vào bình thủy tinh cao thành chứa 50 ml môi trờng MS Cây thuốc lại đợc nhân lên trì bình thủy tinh việc cắt đoạn thân chứa chồi ngủ nuôi bình thủy tinh khác Các thuốc khỏe mạnh với to, phiến phẳng từ thuốc non đợc sử dụng cho mục đích chuyển gien Chọn bánh tẻ, đồng đều, loại bỏ gân viền xung quanh để tăng tiếp xúc với vi khuẩn, sau cắt nhỏ với kích thớc đồng (1-1,5 cm) d) Chuyển phần trình tự m hóa gien pdh45 vào thuốc thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens Một khuẩn lạc dơng tính chủng vi khuẩn LBA 4404 chøa tr×nh tù m hãa gien pdh45 theo h−íng có nghĩa đối nghĩa đợc nuôi cấy lắc 280C 50 ml môi trờng YEM ( dịch chiết nÊm men 0,04%, mannitol 10%, NaCl 0,01%, MgSO4.7H20 0,02% vµ K2HPO4 0,05%) chøa 50 µg/ml kanamyxin Sau 2-3 ngµy, lÊy ml dịch nuôi vi khuẩn b o hòa nuôi 50 ml YEM ë cïng ®iỊu kiƯn cho tíi mật độ tế bào (OD) đạt 0,5 Pha lo ng dịch nuôi tế bào mật độ (OD) 0,5 tới 10 lần, sau cho mẫu thuốc đ đợc chuẩn bị nh 84 vào ngâm từ 5-10 phút Các mẫu thuốc đợc làm khô bëi giÊy thÊm, sau chun sang nu«i ë m«i tr−êng tái sinh (cơ MS, mg/l BAP 0,1 mg/l NAA) không chứa kanamyxin đ) Chọn lọc, tái sinh sinh trởng chuyển gien Sau 2-3 ngày nuôi cấy môi trờng tái sinh không chứa kanamyxin, mẫu thuốc đợc chuyển sang môi trờng chọn lọc (môi trờng tái sinh chứa 300 àg/ml kanamyxin 500 àg/ml cacbenixilin) Sau đến tuần, chồi non đ xác định đợc thân cây, chúng đợc tách nuôi môi trờng rễ (cơ MS chứa 500 àg/ml cacbenixillin 100 mg/ml kanamyxin) Khi đ định hình thân rễ, chúng đợc chuyển sang nuôi bình vermiculit cứng cáp (10-15 ngày), sau đợc chuyển sang bình đất nuôi điều kiện nhà kính e) Các phơng pháp nhận biết gien pdh45 chuyển gien Sự sinh trởng phát triển chuyển gien môi trờng chọn lọc: môi trờng chọn lọc nh trình bày mục Cây thuốc bình thờng gien kháng kanamyxin nên sinh trởng môi trờng chứa 300 àg/ml kanamyxin thuốc chuyển gien chứa gien kháng kanamyxin nên sinh trởng bình thờng môi trờng chứa 300 àg/ml kanamyxin Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR): hệ gien chuyển gien sinh trởng bình thờng môi trờng chọn lọc đợc sử dụng cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đầu 5' 3' gien pdh45 Ngoài ra, chun gien theo h−íng cã nghÜa, ph¶n øng PCR sư dụng mồi đầu 5' chứa trình tự nhận mặt NdeI ba khởi đầu gien pdh45 với mồi gần đầu 5' mồi gần đầu 3' gien GUS Các chuyển gien theo hớng đối nghĩa, phản ứng PCR sử dụng mồi đầu 3' chứa trình tự nhận mặt XbaI ba kết thúc gien pdh45 với mồi gần đầu 5' mồi gần đầu 3' gien GUS Ph©n tÝch GUS: sù biĨu hiƯn cđa gien GUS chuyển gien theo hớng có m hóa gien GUS Hai ba khởi đầu (ATG), cho gien pdh45 cho gien GUS nằm phía bên phải chuỗi khởi động CaMV 35 S biểu hai gien chịu điều khiển chuỗi khởi động CaMV 35 S ChØ cã mét bé ba kÕt thóc(transcription termination) cho gien pdh45 GUS nằm sau gien GUS nên vào thể thực vật, trình phiên m sinh ARN thông tin tái tổ hợp (PDH45 - GUS fusion transcripts) trình dịch m sinh hai protein (PDH45 GUS) trờng hợp cấu trúc có nghĩa có protein gien GUS đợc sinh trờng hợp cấu trúc đối nghĩa nghĩa tối nghĩa đợc xác định theo phơng pháp hóa mô nh mô tả Jefferson (1987) II Kết nghiên cứu Quá trình hình thành cấu trúc có nghĩa (sense construct) đối nghĩa (antisense construct) Biểu đồ trình tạo plasmit tái tổ hợp mang gien pdh45 đợc trình bày hình Cả hai hớng có nghĩa đối nghĩa, trật tự ADN m hóa gien pdh45 đợc gắn vào vectơ chuyển gien pBI121 vị trí XbaI, bên trái chuỗi khởi động CaMV35 S, bên phải trật tự ADN Amp p B S -S K (+ ) T3 T7 P DH E co R I FW D (N d eI ) Xho I R EV (X b a I ) P h ầ n m h o p d h đ ợ c n h ân lê n b ëi P C R sa u g ¾ n v µ o ve c tor p G E M -T E a s y Amp p G E M -T E a s y SP6 T7 P DH Xba I E co R I E co R I P h ầ n m h o p d h 45 lạ i đ ợ c tá c h r a b ë i c ¾ t v í i E c oR I sa u g ¾ n tr ë l¹ i v e c to r p B S - S K ( + ) D ò n g g ắ n xu ô i ( A ) v n g ợ c (B ) đ ợ c p h â n b iƯ t b » n g c ¾ t X b a I A B Amp Amp p B S -S K (+ ) T3 p B S -S K (+ ) T7 P DH Xba I E co R I Xb a I T3 E co R I G en p d h ® − î c t ¸ch r a b ë i c ¾t v í i X b a I s au g ắn v o v e c to r p B I C Ê u tr ó c c ã n g h Ü a v đ ố i n g h ĩa đ ợ c p h â n b i ệ t b » n g v i Ö c c ¾ t p la s m id v í i H in d I I I Kan C a M V3 S Kan P DH Xb a I H indIII T7 P DH Xb a I E co R I Xba I E co R I k b uidA C a M V3 S H indIII pB I1 -P D H S ens e P DH uidA Xb a I Xba I H indIII k b H indIII Xba I pB I1 -P D H a n ti s e n s e Hình Quá trình tạo plasmit tái tổ hợp mang gen pdh45 theo hớng có nghĩa (sense) đối nghĩa (antisense) Để phân biệt cấu trúc có nghĩa cấu trúc đối nghĩa, nh để khẳng định gien pdh45 đ đợc gắn vào vectơ chuyển gien pBI121, đ sử dụng kỹ thuật PCR cắt plasmit tái tổ hợp Hind III Kết đợc trình bày hình Cả cấu trúc có nghĩa đối nghĩa, phản ứng PCR cho sản phẩm 1,2 kb sử dụng cặp mồi đặc hiệu đầu 5' 3' gien pdh45 (hình 2B, cột 1, 2) Các phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu đầu 5' gien pdh45 với mồi đặc hiệu gần đầu 3' 5' gien GUS với cấu trúc có nghĩa cho sản phẩm tơng ứng kb 1,22 kb (hình 2B, cột 8, 9) sản phẩm kích thớc 85 đợc quan sát với cấu trúc đối nghĩa sử dụng cặp mồi đặc hiệu đầu 3' gien pdh45 với mồi đặc hiệu gần đầu 3' 5' cđa gien GUS (h×nh 2B, cét 10, 11) Khi cắt cấu trúc có nghĩa đối nghĩa Xba I, băng khoảng 13 kb tơng ứng với vectơ pBI 121 băng 1,2 kb tơng ứng với trình tự m hóa gien pdh45 đ đợc quan sát (h×nh 2B, cét 4, 5) Cã mét tr×nh tù ADN nhận mặt HindIII vị trí 388 - 393 gien pdh45 nên đặc tính đợc sử dụng cho việc phân biệt cấu trúc có nghĩa đối nghÜa Khi c¾t cÊu tróc cã nghÜa b»ng Hind III cho sản phẩm băng 13 kb 1,2 Kb (hình 2B, cột 6) sản phẩm cắt 12,6 kb 1,6 kb, cắt cấu trúc đối nghĩa Hind III (hình 2B, cột 7) Hình (A), Cấu trúc mạch thẳng plasmit tái tổ hợp mang gien pdh45 theo hai hớng có nghĩa đối nghĩa (B), Chứng minh phần m hóa gien pdh45 đ đợc gắn vào vectơ pBI121 theo hớng có nghĩa đối nghĩa PCR cắt enzym giới hạn Sản phẩm phản ứng PCR cắt enzym giới hạn đợc điện di gel agaroza 0,9%, sau nhm víi ethidium bromit Cét vµ 2: sản phẩm PCR cấu trúc có nghĩa ®èi nghÜa sư dơng cỈp måi ®Ỉc hiƯu cđa pdh45 Cét 3: Thang chuÈn ADN 1kb Cét vµ 5: sản phẩm cắt enzym giới hạn cấu trúc có nghĩa đối nghĩa Xba I Cột 7: sản phẩm cắt enzym giới hạn cấu trúc có nghĩa đối nghĩa Hind III Cột 9: sản phẩm PCR cấu trúc có nghĩa sử dụng mồi đặc hiệu đầu 5' pdh45 với mồi đặc hiệu đầu 5' 3' gien GUS Cột 10 11: sản phẩm PCR cấu trúc đối nghĩa sử dụng mồi đặc hiệu đầu 3' pdh45 với mồi đặc hiệu đầu 5' 3' gien GUS 86 Chun c¸c cÊu tróc cã nghÜa đối nghĩa vào thuốc Các cấu trúc có nghĩa đối nghĩa đợc chuyển vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 phơng pháp làm đông-làm tan Các dòng phân tử tái tổ hợp đợc chọn lọc môi trờng YEM - agar chứa 100 àg/ml kanamyxin 12,5 àg/ml rifampixin Sự có mặt gien pdh45 hớng có nghĩa đối nghĩa chủng vi khuẩn LBA 4404 đợc khẳng định PCR sử dụng mồi đặc hiệu đầu 5' 3' gien pdh45 dịch nuôi vi khuẩn nh sợi khuôn Kết phản ứng PCR cho sản phẩm có kích thớc nh dự đoán Một băng ADN kích thớc 1,2 kb tơng ứng với phần m hóa gien pdh45 đợc phát hớng có nghĩa đối nghĩa (hình 3), chứng tỏ cấu trúc có nghĩa đối nghĩa đ đợc chuyển vào vi khuẩn để tạo Agrobacterium tái tổ hợp 1,2 kb Hình Chứng minh phần m hóa gien pdh45 đ đợc chuyển vào Agrobacterium tumefaciens LBA-4404 theo hớng có nghĩa đối nghĩa PCR Sản phẩm phản ứng PCR đợc điện di gel agaroza 0,9% sau nhm víi ethidium bromit Cét vµ 3: sản phẩm PCR cấu trúc có nghĩa ®èi nghÜa sư dơng cỈp måi ®Ỉc hiƯu cđa pdh45 Cét 2: thang chn ADN kb ViƯc chn bÞ mẫu thuốc trình chuyển Agrobacterium tái tổ hợp vào thuốc nh mô tả phần phơng pháp (c d) Sau giai đoạn đồng nuôi cấy (2-3 ngày), mẫu thuốc đ đợc chuyển gien đợc chuyển sang môi trờng chọn lọc (cơ MS chøa 300 µg/ml kanamyxin vµ 500 µg/ml carbenixillin) Carbenixillin nồng độ 500 àg/ml đủ để giết chết vi khuẩn nồng độ 300 àg/ml kanamyxin thuốc bình thờng phát triển đợc phát triển môi trờng chọn lọc tạm xem đợc chuyển gien có chứa gien kháng kanamyxin 100 chuyển gien từ cấu trúc có nghĩa đối nghĩa đợc chọn lọc cho bớc phân tích Các mẫu thuốc không chuyển gien (dạng hoang dại) đợc sinh trởng điều kiện môi trờng không chứa kanamyxin Hình tốc độ sinh trởng hình thái chuyển gien theo hớng có nghĩa, đối nghĩa không chuyển gien giai đoạn phát triển khác nh: giai đoạn hình thành mô sẹo, sinh trởng môi trờng MS, vermiculit, bình đất giai đoạn chuẩn bị nở hoa Sự phát sinh hình thái chuyển gien Nh kết trình bày hình 4, có thay đổi hình thái với chuyển gien so với không chuyển gien Sự thay đổi đợc quan sát rõ chuyển gien theo hớng đối nghĩa, cụ thể lô này, mức độ hình thành mô sẹo yếu nhng sinh trởng 87 A B C D E Đối nghĩa Có nghĩa Thuốc không chuyển gien Hình Sự sinh trởng đặc điểm hình thái thuốc chuyển gien theo hớng có nghĩa (ở giữa), đối nghĩa (bên phải) không chuyển gien (bên trái) giai đoạn hình thành mô sẹo (A), giai đoạn nuôi ống nghiệm (B), giai đoạn khay đất (C), giai đoạn nhà kính (D) giai đoạn chuẩn bị nở hoa (E) 88 nhanh hơn; mô sẹo có nhiều lông, màu xanh gần đầu 5' 3' gien GUS (hình 5, cột 8, vàng đậm hình thành chồi hơn; chồi 9) Kết thí nghiệm chứng tỏ gien cụm lại với với to, nhiều lông có pdh45 đ đợc gắn vào hệ gien theo màu xanh tối (hình 4A, hình bên phải) Sự khác hớng có nghĩa đối nghĩa biệt hình thái chuyển gien theo hớng đối nghĩa đợc quan sát giai đoạn trình sinh trởng chỗ kb có đốt thân ngắn, xanh hơn, dày hơn, có lông, có hình mũi giáo không phẳng (hình 4: A, B, C, D, E, hình bên phải) 15 số 100 chuyển gien theo 1.22 kb hớng đối nghÜa cã thêi gian sinh tr−ëng sím 1.2 kb h¬n so với không chuyển gien từ 10-25 ngày (hình 4-E, ảnh bên phải) Tuy vậy, không thấy có khác biệt rõ rệt hình thái chuyển gien theo hớng có nghĩa so với không chuyển gien (hình 4: A, B, C, D, E, hình giữa) Khẳng định có mặt gien pdh45 hệ gien (genom) chuyển gien Việc chuyển gien sinh trởng bình thờng môi trờng chứa 300àg/ml kanamyxin chứng tỏ gien pdh45 đ đợc chuyển vào thể Tuy nhiên để khẳng định thêm có mặt gien pdh45 genom chuyển gien, đ tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gien pdh45 gien GUS nh mô tả phần phân tích biểu gien GUS chuyển gien 50 kháng kanamyxin từ hớng có nghĩa đối nghĩa đợc phân tích PCR phân tích biểu gien GUS Tất sản phẩm phản ứng PCR sử dụng hệ gien chuyển gien làm sợi khuôn cho kết nh mong đợi Hình trình bày kết phân tích xt hiƯn cđa gien pdh45 hƯ gien cđa mét số chuyển gien không chuyển gien phản ứng PCR Cả cấu trúc có nghĩa đối nghĩa phản ứng PCR cho sản phẩm 1,2 kb sử dụng cặp mồi đặc hiệu đầu 5' 3' gien pdh45 (hình 5: cột 3, 5, 6), phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu đầu 5' gien pdh45 với mồi đặc hiệu gần đầu 5' 3' gien GUS với cấu trúc có nghĩa cho sản phẩm tơng ứng 1,22 kb kb (hình 5, cột 1, 2) sản phẩm kích thớc đợc quan sát với cấu trúc đối nghĩa sử dụng cặp mồi đặc hiệu đầu 3' gien pdh45 với mồi đặc hiệu 10 H×nh Sù xt hiƯn cđa gien pdh45 hệ gien thuốc Sản phẩm PCR đợc điện di 0,9% agarosa sau nhuộm với ethidium bromit cột 2: sản phẩm PCR chuyển gien hớng có nghĩa sử dụng mồi đặc hiệu đầu 5' gien pdh45 với mồi đặc hiệu đầu 5' vµ 3' cđa gien GUS cét vµ 9: sản phẩm PCR chuyển gien hớng đối nghĩa sử dụng mồi đặc hiệu đầu 3' gien pdh45 với mồi đặc hiệu đầu 5' 3' gien GUS cột 3, 4, 6: sản phẩm PCR chuyển gien hớng có nghĩa đối nghĩa sử dụng cặp mồi đặc hiệu gien pdh45 cột 10: sản phẩm PCR thuốc không chuyển gien sử dụng cặp mồi đặc hiệu gien pdh45 (không có sản phẩm PCR) Cột 7: thang chuẩn ADN kb Cùng đ phân tích PCR đợc sử dụng cho nghiên cứu mức độ biểu cđa gien GUS Trong sè 50 c©y chun gien theo hớng có nghĩa có 12 có biểu gien GUS mức độ khác Trong số 50 chuyển gien theo hớng đối nghĩa có 10 có biểu gien GUS mức độ khác Các gien chuyển vào đợc bố trí cách ngẫu nhiên nhiễm sắc thể khác nên nhiều gien 89 đợc gắn vào hệ gien thực vật Thêm vào chuyển gien, T plasmit chuyển đoạn ADN chứa gien cần chuyển mà không chứa trật tự chuỗi khởi động trật tự chuỗi khởi động bị thiếu Số gien đợc gắn, vị trí gắn trật tự đoạn ADN đợc gắn có ảnh hởng lớn đến biểu gien nên có số gien đợc chuyển biểu nhiều gien nằm hệ gien thực vật dạng trơ Điều giải thích tất C3 C2 A2 chuyển gien đợc phân tích PCR cho kết gien cần chuyển đ gắn vào hệ gien thực vật có 24% chuyển gien theo hớng có nghĩa 20% chuyển gien theo hớng đối nghĩa đợc phân tích phơng pháp hóa mô cho kết có thể gien GUS Hình trình bày kết phân tích biểu gien GUS số chuyển gien không chuyển gien phơng pháp hóa mô A1 B1 KCG §èi nghÜa Cã nghÜa 7C 2E 1F 2C 1E KCG Hình Phân tích biểu gien GUS thuốc chuyển gien phơng pháp hóa mô A1, A2; B1; C2, C3 7C; 2E; 1F; 2C, 1E: chuyển gien hớng đối nghĩa có nghĩa KCG1 KCG2: thuốc không chuyển gien Một mẩu nhỏ từ chyển gien không chuyển gien đợc rửa ®Ưm 50 mM Naphètph¸t pH = 7,0, sau nhm víi mM X-Glue đệm 50 mM Na-phốtphát pH = 7,0 Các mẩu đợc cho vào điều kiện chân không phút sau ủ 37oC qua đêm tối Sau nhuộm, mẫu đợc rửa cồn để loại chlorophyll trớc phân tích III Thảo luận Trong hai thập kỷ qua, việc sử dơng kü tht chun gien thùc vËt viƯc nghiªn cứu chức gien tạo thể chuyển gien với đặc tính nông học quý đ trở thành phơng pháp thiếu đợc giúp nhà khoa học hiểu đợc chất phân tử trình tế bào công tác chọn tạo giống ADN helicaza nhóm enzym tham gia vào hầu hết hoạt động trao đổi chất ADN, đặc biệt trình phân chia tế bào, đóng vai trò quan trọng việc trì điều khiển sinh trởng, phát triển thể sống Cha có công trình công bố kết 90 chuyển nhóm gien vào thực vật, số liệu thu đợc sở để so sánh Tuy nhiên, chuyển gien ARN helicaza/RuazaIII, đ gây đột biến vào Arabidopsis đ gây nên rối loạn phân chia tế bào trình biệt hóa cđa hoa, chøng tá gien ARN helicaza/RuazaIII, cã vai trß việc điều khiển việc phân chia tế bào [6] Gần đây, Wang cs [15] phát thấy r»ng gien m hãa cho mét plastit DEAD-box RNA helicaza chuyển vào thuốc đ làm cho thuốc chuyển gien có màu lốm đốm, rễ hoa có hình dạng không bình thờng Tuy vậy, hiểu biết chế phân tử việc tạo tình trạng rối loạn phân chia tế bào trình biệt hóa hoa công trình nghiên cứu Jacobssen thay đổi hình thái chuyển gien công trình nghiên cứu Wang Khi phân tích biểu gien m hóa eIF-4A8 thuốc chuyển gien, Op Den Cam Kuhlemerier (1998) đ phát hàm lợng protein thay đổi qua trình photphoryl hóa Sự tăng mức độ photphoryl hóa eIF-4A đ đợc quan sát trình ống phấn nảy mầm, giai đoạn trồng có tốc độ phát triển cao mà hoạt động sinh tổng hợp protein tăng cao Kết đ chứng minh protein có vai trò trình dịch m ARNtt việc làm ổn định cấu trúc bậc hai ARNtt Trong công trình nghiên cứu chúng tôi, thay đổi hình thái chuyển gien theo hớng đối nghĩa đợc phát hiện, nhiên chế chi tiết vấn đề cần đợc tiếp tục nghiên cứu mức độ protein, PDH45 eIF-4A3 (nhân tố khởi đầu trình dịch m ) thuốc có độ đồng 86% [11] Khi gien pdh45 đợc chuyển vào thuốc theo hớng đối nghĩa đ sử dụng máy dịch m thuốc để sinh ARNtt đối nghĩa ARNtt đôi nghĩa liên kết bổ sung với ARNtt có nghĩa nội sinh đợc dịch m từ gien eIF-4A3 thuốc kết trình dịch m không thực đợc, eIF4A3 nội sinh không đợc tạo thành Sự thay đổi hình thái học chuyển gien theo hớng đối nghĩa kết sinh trởng phát triển thuốc vắng mặt eIF-4A3 nội sinh Điều đ chứng minh vai trß quan träng cđa PDH45 viƯc trì hoạt động tế bào nh− sù sinh tr−ëng ph¸t triĨn cđa thùc vËt ë thực vật, tợng nở hoa kết chuyển đổi trình biệt hóa quan sinh dỡng sang biệt hóa quan sinh sản mà trình đòi hỏi hoạt hóa phức hợp tổng thể nhiều gien điều hòa Arabidopsis, số gien đ đợc công bố có vai trò thúc đẩy nhanh trình nở hoa nh−: LEAFY (LFY), STERILE APETALA (SAP), APETATLA 1, (AP 1,2), AGAMOUS (AG) [2, 10, 16] Tuy nhiên, thông tin phơng thức hoạt động tơng tác gien phức hợp tổng thể hạn chế Gần đây, Pena đ công bố biểu thờng trực gien thúc đẩy nhanh trình nở hoa Arabidopsis (LFY) (AP1) cam chanh đ rút ngắn giai đoạn non, làm cho hình thành hoa sớm, dẫn đến hạt đợc hình thành sớm bình thờng [10] công trình nghiên cứu chúng tôi, số 100 chuyển gien theo hớng đối nghĩa có 15 có thời gian sinh trởng sớm so với đối chứng từ 15-25 ngày có thời gian sinh trởng dài đối chứng 5-10 ngày Phát có ý nghĩa cho nhà chọn giống nh đặc tính đợc trì ổn định qua hệ Tuy nhiên, tợng rút ngắn thời gian sinh trởng phản ứng sinh lý có gien lạ xuất Cơ chế phân tử cho trình rút ngắn thời gian sinh trởng chuyển gien vấn đề lý thú cần đợc làm sáng tỏ Ngoài ra, thí nghiệm tập trung phân tích số gien pdh45 đ đợc gắn vào hệ gien chuyển gien, biểu gien pdh45 chuyển gien phân tích ổn định đặc điểm hình thái, đặc tính nông học chuyển gien hệ Tài liệu tham kh¶o Atanassova et al., 1995: Plant J., 8: 465477 Byzova M V et al., 1999: Genes Dev., 13: 1002-10014 Fan J Zheng S., and Wang X., 1997: Plant Cell, 9: 2183-2196 Gray J et al., 1992: Plant Mol Biol., 19: 69-87 Horsch R B et al., 1985: Science, 227: 1229-1231 Jacobsen S E., Running M P and Meyerowitz E M., 1999: Development, 126: 5231-5243 John L et al., 1995 Plant J., 7: 483490 Lagrimmi L M et al., 1997: Plant Physiol., 114: 1187-1196 Paul M J et al., 1995: Plant J., 7: 535542 10 Pena L et al., 2001: Nat Biotechnol., 19: 91 263-267 11 Pham X H et al., 2000: Plant J., 24 (2): 219-229 12 Sheeky R E., Kramer M and Hiatt W R., 1998: Proc Natl Acad Sci USA, 85: 8805-8809 13 Shimada H et al., 1993: Theor Appl Genet., 86: 665-672 14 Tang G Q., Luscber M and Sturm A., 1999: Plant Cell, 11: 179-189 15 Wang Y et al., 2000: Plant Cell, 12: 21292142 16 Weigel D., 1995: Annu Rev Genetics, 29: 19-39 Transfer of gene encoding for DNA unwinding helicase (pdh45) into tobacco plants (Nicotiana tabacum L cv Xanthi) by using Agrobacterium and Analysis of the Transformed plants Pham Xuan Hoi, tran quy, Phan Tuan Nghia, Narendra Tuteja Summary PDH45, a DNA unwinding enzyme, has been determined to be an important multifunctional protein involved in the regulation of the protein synthesis, maintaining the basic activities of the cell and in the up regulation of the topoisomerase I activity (Pham et al., 2000) To understand the functional significance of PDH45 in plants, we introduced the PDH45 cDNA into the plant transformation pBI121 vector in both sense and antisense orientations under the control of the same strong constitutive CaMV 35S promoter The Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 was transformed with the sense and antisense constructs and recombinant colonies were selected on kanamycin plates The presence of recombinant plasmids in the kanamycin resistant colonies was confirmed by PCR and restriction digestion Transgenic plants were obtained by co-cultivation of recombinannt Agrobacterium tumefaciens and a leaf disc of Nicotiana tabacum cv xanthi A total of 100 kanamycin resistant plants for each sense and antisense orientations were selected for further analysis 50 of each sense and antisense plants were analyzed for PCR and GUS assay All PCR reactions led to positive products and twelve with sense and ten with antisense were GUS positive The morphology change in antisense transgenic plants as compared with wild type plant has been observed at T1 generation The altered morphology was observed from the callus generation media where antisense plants formed less and weak callus but faster growing In rooting media, antisense transgenic plants gave rise to increase in greenness and the leaves were thicker, more hairy, and slightly lanceolate of compact appearance, internode distance decreased and unsmooth lamina The change was observed in a large population of antisense transgenic plants and has continued during all plant development In addition, some antisense transgenic plants had flowered earlier and resulted in shortening of the time for the plant growth compared to the sense transgenic plants Ngµy nhËn bµi: 18-4-2002 92 ... biểu gien GUS mức độ khác Các gien chuyển vào đợc bố trí cách ngẫu nhiên nhiễm sắc thể khác nên nhiều gien 89 đợc gắn vào hệ gien thực vật Thêm vào chuyển gien, T plasmit chuyển đoạn ADN chứa gien. .. thí nghiệm tập trung phân tích số gien pdh45 đ đợc gắn vào hệ gien chuyển gien, biểu gien pdh45 chuyển gien phân tích ổn định đặc điểm hình thái, đặc tính nông học chuyển gien hệ Tài liƯu tham... nhiều gien nằm hệ gien thực vật dạng trơ Điều giải thích tất C3 C2 A2 chuyển gien đợc phân tích PCR cho kết gien cần chuyển đ gắn vào hệ gien thực vật có 24% chuyển gien theo hớng có nghĩa 20% chuyển