Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 25 giống lúa ở địa phương ở miền núi phía Bắc Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử RAPD kết hợp với sự đánh giá các tính trạng hình thái, khối lượng của các giống lúa này.
32(1): 67-73 Tạp chí Sinh học 3-2010 PHÂN TíCH Sự ĐA DạNG DI TRUYềN MộT Số GIốNG LúA NƯƠNG (Oryza sativa L.) ĐịA PHƯƠNG MIềN BắC, VIệT NAM NGUYễN THị NGọC LAN, NGUYễN Vũ THANH THANH, CHU HOàNG MậU Đại học Thái Nguyên NGUYễN NHƯ KHANH Trờng đại học S phạm Hà Nội Hiện nay, giống lúa nơng (lúa cạn) địa phơng bị dần đợc thay giống lúa lai cho suất cao Tuy nhiên, số địa phơng sản xuất lúa nơng giống địa phơng có chất lợng gạo cao khả chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi Cây lúa nơng phân bố nhiều địa phơng khác nớc, chủ yếu tỉnh miền núi phía Bắc, vùng Duyên hải Trung Bộ Tây Nguyên Sự đa dạng lúa biểu tính trạng hình thái, đặc điểm phả hệ mà biểu liệu ADN cÊu tróc hƯ gien cđa chóng [5] CÊu tróc ADN hệ gien không giống giống lúa sở tạo khác sản phẩm nhân mồi phản ứng PCR Nghiên cứu Puji Lestari cs (2009) đ xác định đợc 30 thị phân tử ADN từ kết sử dụng kỹ thuật STSs, SNPs, SSRs với 22 gièng lóa thc loµi phơ japonica Trong sè 30 thị phân tử tìm thấy 18 thị liên kết với tính trạng chất lợng gạo, hệ số tơng quan lµ R = 0,99 [7] Williams vµ cs (1990) đ đề xuất phơng pháp phân tích đa hình ADN kỹ thuật PCR với mồi đơn có trình tự nucleotide tùy ý ông đề nghị đa hình gọi thị RAPD (Random Amplified polymorphic DNA) [12] Kỹ thuật RAPD đời với kỹ thuật phân tử khác nh SSR, AFLP, SNP đ đợc ứng dụng rộng r i phân tích tính đa hình hệ gien trồng Khi phân tích đa dạng di truyền 40 giống lúa trång quan hƯ víi gièng lóa hoang d¹i b»ng thị phân tử kết hợp 38 cặp måi SSR vµ 36 måi RAPD Ravi vµ cs (2003) nhận xét rằng, số 38 cặp mồi SSR đợc sử dụng, có locus đơn hình giá trị PIC 0,578; đ thu đợc 499 thị phân tử RAPD với 90% phân đoạn ADN đa hình [8] Rabbani cs (2008) đ sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích tính đa hình di truyền 40 giống lúa Pakistan Nhật Bản với 25 mồi ngẫu nhiên đ tạo 208 phân đoạn ADN đợc nhân bản, có 186 ứng với 89,4% phân đoạn đa hình Các giống lúa xếp thành nhóm: thơm, không thơm Japonica [9] Các kết nghiên cøu cđa John vµ cs (2007) [4], Shaptadvipa vµ cs (2009) [10] đ RAPD phơng pháp đánh giá đợc đa dạng di truyền lúa mức phân tử ADN thiết lập thị phân tử RAPD liên kết với tính trạng liên quan đến chất lợng hạt gạo tính trạng khác lúa Các thông tin tính đa dạng di truyền lúa đợc tạo lập từ phân tích RAPD đợc sử dụng cho chơng trình chọn giống bảo tồn nguồn gien lúa Ngoài ra, kỹ thuật RAPD đợc sử dụng để xác định sai khác hệ gien dòng lúa chọn lọc từ mô sẹo chịu nớc công nghệ tế bào thực vật [11] Trong báo này, trình bày kết phân tích tính đa dạng di truyền 25 giống lúa nơng địa phơng miền núi phía Bắc, Việt Nam dựa thị phân tử RAPD kết hợp với đánh giá tính trạng hình thái, khối lợng hạt giống lúa I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu Sử dụng 25 giống lúa nơng địa phơng làm vật liệu nghiên cứu Tên địa phơng, kí hiệu giống lúa địa điểm thu mẫu đợc thể bảng 67 Phơng pháp Phân loại loài phụ theo Chang (1976) [1], Oka (1958) [6] Đánh giá đặc điểm hình thái hạt đợc thực theo IRRI [3] Tách chiết ADN tổng số theo phơng pháp Gawel Jarret (1991) [2] Phản ứng PCR đợc thực với 20 mồi RAPD (bảng 3) Mỗi phản ứng PCR cã tỉng thĨ tÝch lµ 20 µl bao gåm: µl dung dÞch ADN 10 ng/µl; µl buffer PCR 10X; µl MgCl2 25 mM; 1,2 µl dNTPs 10 mM; 1,6 µl primer 10 pmol/µl; 0,5 µl Taq polymerase u/àl 11,7 àl nớc khử ion Chu trình nhiệt phản ứng chu kỳ 94oC phót; 45 chu kú: 92oC 30 gi©y, 36oC 45 gi©y, 72oC phót; chu kú 72oC 10 phút lu giữ mẫu 4oC Điện di sản phẩm RAPD gel agarose 2% ®Ưm TAE 1X Nhm gel b»ng ethidium bromide vµ chơp ảnh Phân tích số liệu phần mềm NTSYSpc (USA, 1998) Minitab 12 Xác định số đa d¹ng di trun (gentic diversity index) cÊu tróc ADN dựa phân đoạn ADN đợc nhân (HRAPD) theo công thức: HRAPD = 1- fi2 Trong đó: HRAPD số đa dạng di truyền; fi tần suất lặp lại thứ i thị phân tử Bảng Danh sách giống lúa nơng nghiên cøu STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 KÝ hiÖu Bcc Bcs Bct Bic Blt Blx Bsn Gb Kk Kld Klk Km Kn Kp Kpl Kt Kx Ln Lo Ltn Md Mt Nn Nro Ss Tên địa phơng Blào cô Blào chinh sái Blào cong ton Bièo chìm trí Blề tí Ble xenh xi Blµo sa Gi»ng bau KhÈu kén Khẩu lẩy deng Khẩu lẩy khao Khẩu mô Kháu nghé Khẩu pe Khẩu pe lạnh Khẩu thẻn Khẩu xe Lúa nơng Lúa ổi Lúa tẻ nơng Mồ dầm Mộ trắng Nếp nơng Ngọ rí ợ Soam sí II KếT QUả Và THảO LUậN Đánh giá đa dạng giống lúa nơng dựa tính trạng hình thái, 68 Nguồn gốc Sơn La Hoà Bình Hoà Bình Bắc Kạn Lai Châu Sơn La Sơn La Quảng Ninh Cao Bằng Cao Bằng Cao Bằng Sơn La Tuyên Quang Sơn La Sơn La Bắc Kạn Sơn La Hà Giang Hoà Bình Hà Giang Bắc Kạn Lào Cai Hoà Bình Lai Châu Tuyên Quang Loài phụ Japonica Japonica Japonica Indica Japonica Indica Japonica Japonica Indica Indica Indica Indica Japonica Indica Indica Japonica Indica Japonica Japonica Japonica Japonica Indica Japonica Japonica Japonica khối lợng hạt Chúng tiến hành đánh giá đa dạng 25 giống lúa nơng địa ph−¬ng cã nguån gèc tõ tØnh thuéc khu vùc miền núi phía Bắc, Việt Nam Kết phân loại giống lúa nơng cho thấy, giống lúa thuộc loài phụ Japonica chiếm tỷ lệ cao (60%) có 40% giống lúa thuộc loài phụ Indica (bảng 1) Bảng trình bày số tham số thống kê kích thớc khối lợng hạt thóc Các tính trạng kích thớc khối lợng 100 hạt giống lúa nghiên cứu có đa dạng cao thể biến động lớn tính trạng, khối lợng 100 hạt có hệ số biến động cao 24,93%, thấp chiều dài hạt thóc có hệ số biến động 10,80% Các giống lúa nơng địa phơng có chiều dài hạt dài, dao động khoảng từ 7,54 mm đến 10,40 mm Xét hình dạng hạt theo tỷ lệ D/R có hai dạng hạt: trung bình thon, dạng hạt đợc ngời tiêu dùng a chuộng; xét khối lợng 100 hạt gièng lóa cã ba kiĨu h¹t: h¹t nhá, h¹t trung bình hạt to Bảng Tham số thống kê kích thớc khối lợng hạt thóc Dài hạt thóc (mm) Rộng hạt thóc (mm) Tỷ lệ dài/rộng hạt thóc Khối lợng 100 hạt thóc (g) Trung bình 8,81 3,23 2,74 2,58 Dựa biến động 10 tính trạng hạt (chiều dài hạt, chiều rộng hạt, tỷ lệ dài/rộng hạt, khối lợng 100 hạt, râu đầu hạt, màu râu, màu vỏ trấu, màu vỏ lụa, độ bạc bụng hạt gạo, dạng nội nhũ) nhóm loài, phần mềm Minitab12 đ tiến hành phân tích thành phần đặc điểm hạt giống lúa nơng địa phơng Kết cho thấy, thành phần đại diện cho tính trạng theo thứ tự u tiên khối lợng 100 hạt, chiều dài hạt tỷ lệ dài/rộng hạt Thành phần có vai trò định việc phân nhóm §é lÖch chuÈn 0,87 0,23 0,34 0,41 HÖ sè biÕn ®éng (%) 10,80 14,79 21,32 24,93 gièng lóa thµnh hai nhóm; nhóm gồm giống có hạt nhỏ nhóm có dạng hạt lớn (hạt trung bình hạt to) Thành phần đại diện cho chiều rộng hạt thóc để phân biệt nhóm giống Các giống lúa đợc chia thành hai nhóm, nhóm có chiều rộng hạt nhỏ 3,3 mm gồm đa số giống lúa nghiên cứu, chiếm 84%, có giống (Nro, Lo, Md Kt) thuộc nhóm hạt có chiều rộng lớn 3,5 mm Kết hợp kết phân nhóm thành phần thành phần đợc trình bày sơ đồ phân bố giống lúa hình Hình Sơ đồ phân bố giống lúa dựa phân tích thành phần tính trạng hạt nhóm loài 69 Trong 10 tính trạng hạt nhóm loài hai tính trạng có trọng số lớn khối lợng 100 hạt chiều rộng hạt sơ đồ hình cho thấy gièng lóa ph©n bè theo nhãm (I, II, III, IV) khác đặc điểm hạt Nhóm I (Nro) cã h¹t nhá - réng, nhãm II (Bic, Blt, Blx, Kk, Blx, Kld, Klk, Km, Kx, Mt) dạng h¹t nhá - hĐp (36%), nhãm III (Bcc, Bcs, Bct, Bsn, Gb, Kn, Kp, Kpl, Ln, Ltn, Nn, Ss) cã dạng hạt to trung bình - hẹp, chiếm tỷ lƯ lín nhÊt (48%) vµ nhãm IV (Kt, Lo, Md) có dạng hạt to - rộng Bảng Trình tự måi RAPD S TT Måi Tr×nh tù (5’-3’) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M19 M20 TRA4 AACCGACGGG GGGGGTCGTT TACCACCCCG GGCGGACTGT TCGGCGATAG GTGTCTCAGG CAGCACCCAC GGAAGTCGCC CCTCCAGTGT CTATGCCGAC CGGCCCACGT AACGCGTAGA GCCACGGAGA TAGGCGAACG CACGGCTGCG GTATGGGGCT GCGAACCTCG CCTGCTCATC GACAGGAGGT CACCGTAGCG Tæng sè phân đoạn ADN đợc nhân 15 10 12 11 14 8 7 10 Tỷ lệ phân đoạn ADN đa hình (%) 66,67 60,00 50,00 58,33 88,89 100,00 57,14 62,50 88,89 40,00 0,00 0,00 100,00 25,00 40,00 87,50 85,71 85,71 90,00 28,57 Tỷ lệ phân đoạn ADN đơn h×nh (%) 33,33 40,00 50,00 41,67 11,11 0,00 42,86 37,50 11,11 60,00 100,00 0,00 0,00 75,00 60,00 12,50 14,29 14,29 10,00 71,43 Hình Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD víi måi M20 Ghi chó: M-marker; Mt; Klk; Kk; Blt; Ln; Bcc; Km; Ltn; Blx; 10 Kp; 11 Kpl; 12 Kx; 13 Kld; 14 Nn; 15 Nro; 16 Lo; 17 Bct; 18 Bcs; 19 Kt; 20 Bic; 21 Ss; 22 Kn; 23 Md; 24 Bsn; 25 Gb 70 Sù đa dạng di truyền giống lúa nơng mức độ phân tử ADN dựa kết phân tÝch RAPD Sau thùc hiƯn ph¶n øng PCR-RAPD, s¶n phẩm đợc điện di gel agarose để phân tích đa hình ADN giống lúa nghiên cứu Với 25 giống lúa 20 mồi ngẫu nhiên, số phản ứng mà đ thực 500 phản ứng tổng cộng có 2431 phân đoạn ADN đợc nhân Kết thống kê số phân đoạn ADN đơn hình đa hình mồi đợc thĨ hiƯn ë b¶ng B¶ng cho thÊy, 20 mồi RAPD sử dụng phân tích tính đa hình 25 giống lúa mồi M12 phân đoạn ADN đợc nhân bản, mồi lại có số lợng phân đoạn ADN dao động từ đến 15 Mồi M6 M13 có tỷ lệ phân đoạn ADN đa hình cao (100%), mồi M11 không xuất phân đoạn đa hình mồi có số lợng phân đoạn ADN đợc nhân Chỉ số đa dạng di truyền (HRAPD) xác định dựa phân đoạn ADN đợc nhân phản ứng RAPD 158 locus 47,46% Hình Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với måi M7 Ghi chó: M- marker, 1- Mt, 2- Klk, 3- Kk, 4- Blt, 5- Ln, 6- Bcc, 7- Km, 8- Ltn, 9- Blx, 10- Kp, 11- Kpl, 12- Kx, 13- Kld, 14- Nn, 15- Nro, 16- Lo, 17- Bct, 18- Bcs, 19- Kt, 20- Bic, 21- Ss, 22- Kn, 23- Md, 24- Bsn, 25- Gb Dựa kết phân tích đa hình ADN, đ xác định mối quan hệ khoảng cách di truyền giống lúa nghiên cứu (hình 4) Hình cho thấy, giống lúa đợc chia làm hai nhánh với khoảng cách di truyền 21% (79-100%) I II III IV V VI Hình Sơ đồ hình mô t¶ mèi quan hƯ di trun cđa 25 gièng lóa nơng sở xác định hệ số giống 71 Nh¸nh chÝnh thø nhÊt tËp trung c¸c gièng thuéc loµi phơ Indica, chØ cã Blt lµ gièng thc loµi phụ Japonica Nhánh chia làm hai nhóm I II Nhãm I chØ cã mét gièng Mt, nhãm II gåm 10 gièng (Klk, Bic, Km, Blx, Kx, Kld, Kk, Blt, Kp, Kpl), hai nhóm I II có khoảng cách di truyền 20% (80-100%) Nhánh thứ hai gồm 14 giống thuộc loài phụ Japonica Nhánh gåm nh¸nh phơ thø nhÊt cã nhãm: nhãm III gåm hai gièng Ln vµ Bsn, nhãm IV gåm gièng (Bcc, Bct, Ltn, Bcs, Kt, Nro, Lo, Ss, Kn), hai giống lúa Bcc Bct có khoảng c¸ch di trun thÊp nhÊt (8%); nhãm V chØ cã gièng Md Nh¸nh phơ thø hai cã hai gièng Gb Nn, có khoảng cách di truyền với nhánh phụ thứ 18,75% (81,25-100%) Kết nghiên cứu thay đổi cấu trúc hệ gien quần thể lúa dại Oryza rufipogon Trung Quốc Brazil mức độ phân tử ADN kỹ thuật RAPD với 60 mồi ngẫu nhiên, Song cs (1999) cho rằng, giống lúa khu vực có hệ số đa dạng di truyền thờng thấp (khoảng 14,9-23%) so với giống châu lục khác (đạt 61,8%) [8] Các giống lúa nơng mà phân tích có nguồn gốc thuộc địa phơng miền núi phía Bắc Việt Nam, có khoảng cách di truyền từ 8-21% hoàn toàn phù hợp với nhận định Song cs Bảng trình bày thị phân tử RAPD cho số giống lúa nơng Các giống lúa Bcs, Gb, Kn, Ln, Md, Mt, Nn thuộc nhóm chịu hạn tốt Giống Bcs có hai thị phân tử 800 bp M20 550 - M5, gièng Gb cã hai chØ thÞ 900 bp - M3 vµ 1500 bp - M15, gièng Kn cã mét chØ thÞ 400 bp - M6, gièng Ln cã mét chØ thÞ 750 bp - M17, gièng Md cã hai thị 500 bp - M3 1100 bp - M6, gièng Mt cã mét chØ thÞ 1400 bp - M1, gièng Nn cã mét chØ thÞ 350 bp - M20 C¸c gièng Blx, Kk, Km, Kpl, Nro thuéc nhãm chịu hạn Giống Blx có thị 350 bp M16, gièng Kk cã chØ thÞ 1250 bp - M9 vµ 900 bp - M9, gièng Km cã chØ thị 400 bp - M5, 650 bp M5 1300 bp - M5, gièng Kpl cã hai chØ thÞ 900 bp - M13 650 bp - M20 Bảng Các phân đoạn ADN đặc trng giống lúa nơng với mồi Giống Bcs Blx Gb Kk Km Kn Kpl Ln Md Mt Nn Nro M1 1400 - M3 900 500 - Vị trí phân đoạn ADN đặc tr−ng cña tõng måi (bp) M5 M6 M9 M13 M15 M16 550 350 1500 1250; 900 400; 650; 1300 400 900 1100 - Khả chịu hạn lúa tính trạng đa gien thực tế có nhiều gien liên quan đến đặc tính chịu hạn Kết so sánh phân đoạn ADN đặc trng giống lúa hai nhóm chịu hạn tốt chịu hạn sở để nhận dạng giống lúa nơng nghiên cứu III KếT LUậN 72 M17 750 - M20 800 650 450 350 § s−u tập đợc 25 giống lúa nơng từ tỉnh miền núi thuộc miền Bắc, Việt Nam, có 15 gièng lóa thc loµi phơ Japonica vµ 10 gièng lóa thuộc loài phụ Indica Khối lợng 100 hạt có đa dạng số tính trạng nghiên cứu, dao động từ 1,91 g đến 3,44 g hệ số biến động 24,93% Các giống lúa nơng đợc chia thành bốn nhóm (hạt nhỏ - rộng, hạt nhỏ - hẹp, hạt to trung bình - hẹp, hạt to - rộng) dựa hai tính trạng có trọng số lớn khối lợng 100 hạt chiều rộng hạt Đ sàng lọc 20 mồi ngẫu nhiên 500 phản ứng RAPD 25 giống lúa nơng kết có 2431 phân đoạn ADN đợc nhân Chỉ số đa dạng di truyền (HRAPD) 158 locus 47,46% Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền 25 giống lúa nơng, khoảng cách di truyền (hệ số khác nhau) giống lúa nơng 8% đến 21% 19 thị phân tử RAPD cho 12 số 25 giống lúa nơng đ đợc thiết lập TàI LIệU THAM KHảO Chang T T., 1976: Euphytica, 25: 422-441 Gawel N J and Jarret R L., 1991: Plant Molecular Biology Reporter, 9: 262-266 IRRI., 1996: Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gien lóa ViƯn nghiªn cøu lóa qc tÕ, Malina, Philippin John Milton Lima et al., 2007: Crop Protection, 26(9): 1431-1435 Jorge Luis Fuentes et al., 2005: Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization, 3: 353-359 Oka H I., 1958: Indian Journal of Genetic Plant Breed, 18: 79-89 Puji Lestari et al., 2009: J Agric Food chem., 57: 2754-2762 Ravi M Geethanjali S et al., 2003: Euphytica, 133(2): 243-252 Rabbani A M et al., 2008: Electronic Journal of Biotechnology, 11(3) 10 Shaptadvipa B and Sarma R N., 2009: Asian Journal of Plant Sciences, 8(3): 218223 11 NguyÔn Thị Tâm, 2004: Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dòng chịu nóng lúa công nghệ tế bào thực vật Luận án Tiến sỹ Sinh học Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội 12 Williams J G K et al., 1990: Nucleic Acids research, 18(22): 6531-6535 GENETIC DIVERSITY ANALYSIS OF LOCAL UPLAND RICE CULTIVARS (Oryza sativa L.) fROM NORTH PROVINCES OF VIETNAM NGUYEN THI NGOC LAN, NGUYEN VU THANH THANH, CHU HOANG MAU, NGUYEN NHU KHANH SUMMARY Genetic diversity of twenty five local upland rice cultivars (Oryza sativa L.) from provinces of North in Vietnam was investigated at the morphologic grain characters and DNA levels Results on classification of variety group of 25 local upland rice varieties indicated that there are fifteen Japonica subspecies and ten Indica subspecies Analyzing principle components of ten grain characters include grain length, grain width, grain length/width ratio, 100-grain weight, awning, awn color, lemma and palea color, coat seed color, chalkiness of endosperm, endosperm type and variety group showed that the 100-grain weight and grain width were two main characters separated cultivars into four groups: small-large seeds, small-narrow seeds, big narrow seeds, big - large seeds To determine the genetic relationships among rice cultivars, we used the randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method In the total five hundred of the polymerase chain reaction (PCR) with twenty random primers, 2431 DNA fragments were produced and genetic diversity index (HRAPD) was 47.46% The coefficients of dissimilarity among upland rice cultivars were calculated between 821% Ngµy nhËn bµi: 14-11-2009 73 ... Bsn; 25 Gb 70 Sự đa dạng di truyền giống lúa nơng mức độ phân tử ADN dựa kết phân tích RAPD Sau thực phản ứng PCR-RAPD, sản phẩm đợc điện di gel agarose để phân tích đa hình ADN giống lúa nghiên... RAPD 25 giống lúa nơng kết có 2431 phân đoạn ADN đợc nhân Chỉ số đa dạng di truyền (HRAPD) 158 locus 47,46% Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền 25 giống lúa nơng, khoảng cách di truyền (hệ số khác... Chúng tiến hành đánh giá đa dạng 25 giống lúa nơng địa phơng có ngn gèc tõ tØnh thc khu vùc miỊn nói phía Bắc, Việt Nam Kết phân loại giống lúa nơng cho thấy, giống lúa thuộc loài phụ Japonica