Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết nghiên cứu và tinh chế IgG từ huyết thanh người khỏe; xây dựng đồ thị chuẩn IgG, thăm dò nồng độ gắn bản của ConM và độ pha loãng của huyết thanh; bước đầu sử dụng Lectin ConM định lượng kháng thể IgG trong huyết thanh người bình thường.
32(1): 63-66 3-2010 Tạp chí Sinh học Bớc đầu sử dụng lectin đậu dao biển (Canavalia maritima, Aublet) định lợng kháng thể IgG từ huyết ngời Trần Thị Phơng Liên, Trơng Văn Châu Trờng đại học S phạm Hà Nội Đỗ Văn Phúc, Đỗ Ngọc Liên Trờng đại học Khoa học tự Nhiên, ĐHQG Hà Nội Đậu dao biÓn (Canavalia maritima, Aublet) cã nguån gèc tõ Brazil, thờng sống vùng nhiệt đới ven biển đợc liệt kê vào loài đậu ăn hạt vùng Đông Nam [2, 4] Cùng với loài đậu rựa thờng mọc rừng núi (Canavalia ensiformis D C.) đậu gơm (Canavalia gladiata (Jacq) D C.) đ đợc tìm thấy Việt Nam [2], loài chứa loại protein đợc gọi chung lectin có hoạt tính ngng kết hồng cầu ConA (tõ C ensiformis), conG (tõ C gladiata) vµ ConM (từ C maritima) [5, 6] Tính chất điển hình lectin có khả liên kết với gốc đờng đơn gốc đờng nằm bề mặt tế bào [7] ứng dụng tính chất này, năm cuối kỷ XX, nhà khoa học đ sử dụng lectin để nghiên cứu biểu kháng thể kháng nguyên Vì việc sử dụng lectin ConM từ hạt đậu dao biển (Canavalia maritima, Aublet) để định lợng kháng thể huyết ngời điều cần thiết có ý nghĩa khoa học thực tiễn y học I phơng pháp nghiên cứu Phơng pháp Tinh chÕ kh¸ng thĨ IgG tõ hut b»ng cét sắc kí lực Protein A - Sepharose 4B cột ConM - Sepharose 4B tự tạo [3] Đánh giá mức độ tinh IgG đ tinh chế kỹ thuật điện di gel SDS-PAGE theo Laemmli, với nång ®é 12% [3] Sư dơng lectin ConM cã ®é tinh cao từ hạt đậu dao biển đ đợc tinh chế phơng pháp sắc kí lực theo Goldstein cộng (1986) để bớc đầu định lợng kh¸ng thĨ IgA hut b»ng kü tht LECTINELISA [3] C¸c ho¸ chÊt sư dơng cđa h ng Sigma (Mỹ), Merk (Đức), LKB (Thuỵ Điển): Protein chuẩn; Sepharose-ProteinA; SephadexG-G75; cộng hợp kháng IgG; chất OPD, hoá chất đạt mức độ tinh khiết cao II Kết nghiªn cøu Tinh chÕ IgG tõ huyÕt ng−êi khỏe Nguyên liệu Hạt đậu dao biển đợc thu hái khu vực chân núi Ngũ Hành, Quảng Nam Đà Nẵng, Nguyễn Đăng Khôi định loại Hồng cầu đợc viện Huyết học truyền máu Trung ơng cung cấp gồm nhóm máu A, B, O đợc rửa lần với muối sinh lý (NaCl 0,9%) Các mẫu huyết ngời khỏe bình thờng đ đợc chuẩn đoán lâm sàng đợc Viện Huyết học Truyền máu Trung ơng cung cấp Hình Điện di SDS-PAGE chế phẩm IgG tinh Ghi chú: Cột Các protein chuẩn cđa h ng SIGMA; Cét IgG tinh s¹ch tinh chÕ b»ng cét ConMSepharose 4B; Cét IgG tinh s¹ch tinh chế cột ConM-Sepharose 4B 63 Kết đ chứng tỏ lectin ConM liên kết đặc hiệu với kháng thể IgG mà không liên kết với thành phần khác huyết ngời Xây dựng đồ thị chuẩn IgG Kết chế phẩm IgG thu đợc hoàn toàn tinh sạch, biểu băng chuỗi nặng (53 kDa) chuỗi nhẹ (25 kDa) kiểm tra kỹ thuật SDS-PAGE (hình 1) Kháng thể IgG tinh sau tinh chế đợc sử dụng để xây dựng đồ thị chn cho kü tht xÐt nghiƯm ELISA KÕt qu¶ thu đợc hình OD 490nm IgG đợc tinh chế cột ConMSepharose 4B tự tạo cột Protein A - Sepharose 4B Chế phẩm IgG tinh đợc dùng để xây dựng đồ thị tiêu chuẩn cho kỹ thuật xét nghiệm LECTIN-ELISA dùng lectin ConM gắn 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Hàm lợng IgG (ng/ml) Hình Đồ thị chuẩn IgG Qua đồ thị chuẩn (hình 2) cho thấy mật độ quang nằm khoảng từ 0,196 đến 0,698 kết thực nghiệm thu đợc tơng đơng với kết lí thuyết Vì vậy, trình làm thực nghiệm cần lu ý ®é pha lo ng huyÕt cho kÕt đo mật độ quang nằm khoảng từ 0,196 đến 0,698 OD492nm Thăm dò nồng độ gắn ConM độ pha loãng huyết Huyết ngời bình thờng đợc pha lo ng 150, 200, 250 lần đệm blocking pH 7,6-7,8; ConM đợc gắn với nồng độ 1, 3, 5, 8, 10, 15 àg/1 giếng để bắt giữ IgG kỹ thuật Lectin-Elisa (hình 3) Kết hình cho thấy, để thích hợp cho việc định lợng IgG huyết đợc pha lo ng 200 lần nồng độ gắn ConM àg/giếng 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 10 15 Nồng độ ConM gắn (mg/giếng) 200 lần 250 lần 250 lần Hình Kết thăm dò độ pha lo ng huyết nồng độ gắn ConM 64 Bớc đầu sử dụng lectin ConM định lợng kháng thể IgG huyết ngời bình thờng với kết xét nghiệm Văn §×nh Hoa [1] hä sư dơng bé xÐt nghiƯm sinh phẩm nớc Kết xác định hàm lợng kháng thể IgG trung bình huyết ngời bình thờng sử dụng phơng pháp LECTIN-ELISA 12,7 mg/ml Kết hoàn toàn phù hợp với thông số ngời Việt Nam khoẻ bình thờng phù hợp với kết xét nghiệm Văn §×nh Hoa [1] hä sư dơng bé xÐt nghiƯm sinh phẩm nớc Điều đ chứng minh chế phẩm lectin từ hạt đậu dao biển hoàn toàn đáp ứng đợc yêu cầu cho điều chế sinh phÈm xÐt nghiƯm kh¸ng thĨ IgG b»ng kü tht LECTIN-ELISA Tài liệu tham khảo III Kết luận Lectin ConM đợc tinh từ hạt đậu dao biển (C maritima Aublet) đ đợc chứng minh có tính đặc hiệu liên kết với IgG ngời Hàm lợng lectin ConM đợc lựa chọn tối u cho gắn nhựa microtiter plate kỹ thuật ConM-ELISA để xác định hàm lợng IgG từ huyết àg/giếng Huyết gốc đợc pha lo ng 200 lần điều kiện thích hợp cho xét nghiệm xác định hàm l−ỵng IgG tõ hut b»ng kü tht ConM-ELISA Hàm lợng kháng thể IgG trung bình huyết ngời khỏe bình thờng định lợng phơng pháp ELISA-ConM 12,7 mg/ml Kết hoàn toàn phù hợp với thông số ngời Việt Nam phù hợp Văn Đình Hoa, Trần Thị Chính, 1996: Hàm lợng globulin miễn dịch IgG, IgA, IgM, IgE hut cđa ng−êi ViƯt Nam cã søc kháe b×nh thờng, Kỷ yếu chơng trình Hội nghị tiêu Sinh học ngời Việt Nam, Nxb Y học Hà Nội Nguyễn Đăng Khôi, 1979: Nghiên cứu thức ăn cho gia súc Việt Nam, tập 1, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đỗ Ngọc Liên, 2004: Thực hành Hoá sinh miễn dịch, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội Van der Macsen J G & Somantmadja S (Dơng Đức Huyến dịch), 1996: Tài nguyên thực vật Đông Nam á, Các đậu ăn hạt, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Decastle B R and Homer B B., 1973: Acta., 322:141-144 Goldstein I J and Poretz R D., 1986: Isolation, Physicochemical Characterization and Carbohydrate-Binding Specificity of Lectins: 185-188 Academic Press, Inc Strosberg A D., Dominique B., Mark L and Andrew F., 1986: Legume lectins: A large family of homologous protein: 251262 The lectin: properties, functions and applications in biology and medicine, Academic Press, INC Preliminary Using the lectin from maritima jackbean seeds (Canavalia maritima Aublet) for analysis of IgG from human serum by LECTIN-ELISA technique Tran Thi Phuong Lien, Truong Van Chau, Van Phuc, Ngoc Lien SUMMARY In recent investigation, we proved specific interaction between lectin ConM from Canavalia maritima of Vietnam and IgG from human serum In order to using the lectin for analysis IgG from human serum, we carried out the purification of IgG from healthy human serum by Protein A - Sepharose 4B and ConM- 65 Sepharose 4B column chromatography followed to prepare the ConM-ELISA biokit for analyzing IgG from human serum Results obtained showed that average concentration of IgG from healthy human serum was determined to be 12.7 mg/ml Using suitable concentration of ConM to be µg/well by ConM-ELISA technique with human serum diluted 200 times Ngµy nhËn bµi: 30-11-2007 66 ... lo ng huyết nồng độ gắn ConM 64 Bớc đầu sử dụng lectin ConM định lợng kháng thể IgG huyết ngời bình thờng với kết xét nghiệm Văn Đình Hoa [1] họ sử dụng xét nghiệm sinh phẩm nớc Kết xác định hàm... xác định hàm lợng IgG từ huyết àg/giếng Huyết gốc đợc pha lo ng 200 lần điều kiện thích hợp cho xét nghiệm xác định hàm lợng IgG từ huyết kỹ thuật ConM-ELISA Hàm lợng kháng thể IgG trung bình huyết. .. Tài liệu tham khảo III Kết luận Lectin ConM đợc tinh từ hạt đậu dao biển (C maritima Aublet) đ đợc chứng minh có tính đặc hiệu liên kết với IgG ngời Hàm lợng lectin ConM đợc lựa chọn tối u cho