Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khố luận tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận động viên giúp đỡ lớn nhiều cá nhân tập thể Trước hết xin gửi cảm ơn chân thành tất thầy giáo tồn trường thầy cô giáo khoa thú y giảng dạy giúp đỡ suốt năm mái trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, TS Nguyễn Bá Hiên, trưởng Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, người trực tiếp hướng dẫn thực đề tài Qua đây, xin phép gửi lời cảm ơn chân thành tới tất Cán cơng tác Trung tâm Chẩn Đốn Thú y Trung ương, đặc biệt ThS Nguyễn Tùng cô chú, anh chị làm việc Phòng Virus - Trung tâm Chẩn Đốn Thú y Trung ương tận tình bảo giúp đỡ tơi suốt thời gian thực tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ vượt qua khó khăn suốt q trình thực đề tài Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nôi, ngày 10 tháng 05 năm 2012 Sinh viên NGUYỄN THỊ ÁI i Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 MỤC LỤC Phần I: MỞ ĐẦU .1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 2.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM BỆNH CÚM GIA CẦM 2.2 LỊCH SỬ BỆNH CÚM GIA CẦM 2.2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm giới 2.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm Việt Nam 2.3 CĂN BỆNH BỆNH CÚM GIA CẦM 2.3.1 Cấu trúc chung virus cúm type A .7 2.3.2 Kháng nguyên virus .8 2.3.3 Độc lực virus 2.3.4 Khả biến chủng virus 10 2.3.5 Sức đề kháng virus 11 2.4 DỊCH TỄ HỌC BỆNH CÚM GIA CẦM .11 2.4.1 Loài vật mang virus 11 2.4.2 Động vật cảm nhiễm .12 2.4.3 Sự truyền lây 13 2.5 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH BỆNH CÚM GIA CẦM 13 2.5.1 Triệu chứng 13 2.5.2 Bệnh tích .14 2.6 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH CÚM GIA CẦM 15 2.6.1 Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng bệnh tích 15 2.6.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 15 2.7 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG VIRUS CÚM GIA CẦM 15 2.7.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 15 2.7.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 16 2.8 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM GIA CẦM 17 2.9 SỬ DỤNG VACXIN PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM GIA CẦM 18 2.9.1 Các loại vacxin dùng .18 ii Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 2.9.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm giới 19 2.9.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm Việt Nam 20 2.9.4 Những điểm ý sử dụng vacxin cúm gia cầm 21 Phần III: ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23 3.2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .23 3.2.1 Nguyên liệu 23 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 3.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 30 3.3 CHỈ TIÊU THEO DÕI VÀ ĐÁNH GIÁ 31 3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 32 Phần IV: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .33 4.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA GÀ, VỊT VÀ NGAN SAU KHI TIÊM VACXIN 33 4.2 KẾT QUẢ CÔNG CƯỜNG ĐỘC 36 4.1.1 Kết công cường độc gà .37 4.2.2 Kết công cường độc vịt 39 4.2.3 Kết công cường độc ngan .42 4.2.4 Tổng hợp kết công cường độc gà, vịt ngan: .44 4.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS BÀI THẢI SAU KHI CÔNG CƯỜNG ĐỘC 45 4.3.2 Mức độ thải virus sau công cường độc vịt .48 4.3.3 Mức độ thải virus sau công cường độc ngan 50 4.3.4 Tổng hợp kết mức độ thải virus sau công cường độc 52 4.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH SAU CÔNG CƯỜNG ĐỘC 53 Phần V: KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 55 5.1 KẾT LUẬN 55 5.2 ĐỀ NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 59 DANH MỤC CÁC BẢNG iii Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 Bảng 3.1 Công thức pha hỗn hợp gen cho Real time RT-PCR 29 Bảng 3.2 Sơ đồ thí nghiệm: 30 Bảng 3.3 Bảng theo điểm lâm sàng 31 Bảng 4.1 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng cúm sau tiêm vacxin gà phản ứng HI 33 Bảng 4.2 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng cúm sau tiêm vacxin vịt ngan phản ứng HI .33 Bảng 4.3 Kết công cường độc gà 38 Bảng 4.4 Kết công cường độc vịt 41 Bảng 4.5 Kết công cường độc ngan .43 Bảng 4.6 Tổng hợp kết CCĐ .45 Bảng 4.7 Điểm đánh giá mức thải virus thông qua giá trị Ct .46 Bảng 4.8 Mức độ thải virus sau công cường độc gà 47 Bảng 4.9 Mức độ thải virus sau công cường độc vịt 49 Bảng 4.10 Mức độ thải virus sau công cường độc ngan 51 Bảng 4.11 Tổng hợp kết thải virus sau công cường độc 53 Bảng 4.12 Hiệu giá kháng thể trung bình trước sau cơng cường độc 54 iv Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc virus cúm type A Hình 4.1: Hàm lượng kháng thể rung bình sau tiêm vacxin mũi 34 Hình 4.2: Tỷ lệ bảo hộ sau tiêm vacxin mũi 35 Hình 4.3 Hàm lượng kháng thể trung bình sau tiêm vacxin mũi 35 Hình 4.4 Tỷ lệ bảo hộ sau tiêm vacxin mũi 36 Hình 4.5.Tỷ lệ chết theo ngày gà 40 Hình 4.6: Tỷ lệ chết theo ngày vịt .42 Hình 4.7: Tỷ lệ chết theo ngày ngan 44 Hình 4.8: Mức độ thải virus gà sau công cường độc 47 Hình 4.9 Mức độ thải virus vịt sau công cường độc 50 Hình 4.10 Mức độ thải virus ngan sau cơng cường độc 52 Hình 4.11 Hiệu giá kháng thể trung bình trước sau cơng cường độc 55 v Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT RNA : Ribonucleic Acid CCĐ : Công cường độc VX : Vacxin TN : Thí nghiệm ĐC : Đối chứng GMT : Geometric Mean Titre – Hiệu giá kháng thể trung bình HA : Hemagglutination test – Phản ứng ngưng kết hồng cầu HI : Hemagglutination Inhibition test – Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu HPAI : Highly Pathogenic Avian Influenza – Bệnh cúm độc lực cao LPAI : Low Pathogenic Avian Influenza – Bệnh cúm độc lực thấp PBS : Photphat Buffered Saline RT- PCR : Reverse Transcription– Polymerase Chain Reaction RRT- PCR : Rea-time Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction Ct : Threshold cycle – chu kỳ ngưỡng vi Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 Phần I MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh cúm gia cầm mối quan tâm lớn giới nói chung Việt Nam nói riêng Bệnh gây hậu nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm để lại thiệt hại nặng nề kinh tế Đặc biệt virus cúm gia cầm chủng độc lực cao H5N1 không lây truyền bệnh cho gia cầm mà có khả lây truyền bệnh sang cho người gây tử vong Bệnh Virus cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, ARN virus có hệ gen phân đoạn, có khả đột biến mạnh tạo nên chủng virus Bệnh Tổ chức Dịch tễ giới (OIE) xếp vào bảng A - bệnh truyền nhiễm nguy hiểm Bệnh cúm gia cầm xuất Việt Nam từ cuối năm 2003, tới có nhiều đợt dich xảy với số lượng gia cầm bị chết bị tiêu hủy dịch ước tính lên tới hàng nghìn tỷ đồng Các biện pháp phòng chống dịch triển khai áp dụng, song việc tiêm phòng vaxcin cho tồn đàn gia cầm khuyến cáo biện pháp chủ động phòng chống dịch bệnh làm giảm thiệt hại bệnh gây ngành chăn nuôi gia cầm Nhưng việc tiêm phòng vacxin gặp khó khăn virus cúm gia cầm có biến đổi gen xuất nhánh virus Trong đó, virus thuộc nhóm kháng nguyên (clade) 2.3.2 lưu hành miền Bắc, duyên hải miền Trung Tây nguyên Clade 1.1 lưu hành tỉnh phía Nam phân lập vào khoảng cuối năm 2011 đầu năm 2012 (Lê Thị Bích Nga, Lê Thanh Hòa, 2012) Tiêm phòng cho đàn gia cầm Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồn vacxin nhập từ Trung Quốc Giai đoạn 2007-2010, Việt Nam sử dụng vacxin cúm gia cầm chủng RE-1 Trung Quốc sản xuất hiệu việc khống chế làm giảm thiệt hại dịch cúm gia cầm Tuy nhiên từ năm 2010 Trung Quốc Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 chuyển sang sản xuất vacxin cúm gia cầm chủng RE-5 kì vọng thay vacxin RE-1 Nhưng số nghiên cứu ngồi nước cho vacxin RE5 khơng cho hiệu mong đợi Hiện Việt Nam lưu hành số loại vacxin cúm khác (do Trung Quốc, Pháp, Hà Lan, Đức sản xuất), vacxin RE-1 cho kết tốt thực nghiệm thực tế Tuy nhiên điều kiện biến đổi virus cúm gia cầm nay, cần tiến hành nghiên cứu hiệu lực vacxin biến chủng virus cúm gia cầm loài gia cầm khác nhau, từ giúp cho cơng tác phòng chống dịch bệnh cúm gia cầm nước ta Chính chúng tơi thực đề tài: “ Đánh giá hiệu lực vacxin cúm A/H5N1 chủng RE-1 Trung Quốc sản xuất virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 gà, vịt ngan” 2.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Đánh giá hiệu lực vacxin cúm A/H5N1 chủng RE-1 Trung Quốc sản xuất virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 gà, vịt ngan Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM BỆNH CÚM GIA CẦM Bệnh cúm gia cầm bệnh truyền nhiễm gây virus cúm typ A thuộc họ Orthomyxoviridae Đây tác nhân gây bệnh dịch lớn, có tính chất khốc liệt gia cầm nói chung Trước đây, bệnh gọi bệnh dịch tả gà (Fowl plague) từ Hội nghị Quốc tế lần thứ bệnh cúm gia cầm Beltsville, Mỹ (1981) thay tên tên bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly pathogenic avian influenza-HPAI) (Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, 2004), để virus cúm typ A có độc lực mạnh, lây lan nhanh gây tỷ lệ tử vong cao loài mẫn cảm 2.2 LỊCH SỬ BỆNH CÚM GIA CẦM 2.2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm giới Bệnh cúm gia cầm xuất cách từ lâu Hippocrates mô tả từ năm 412 trước cơng ngun Trong 100 năm qua, có vụ đại dịch cúm xảy vào năm 1889, 1918, 1957, 1968 (Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, 2004) Năm 1878, Italia xảy bệnh gây tử vong cao đàn gia cầm gọi bệnh dịch tả gia cầm Năm 1901, Centanni Savunozzi đề cập đến ổ dịch xác định nguyên siêu nhỏ qua lọc yếu tố gây bệnh (filterable agent) Năm 1955, Schaffer xác định nguyên gây bệnh thuộc nhóm virus cúm type A (H7N7 H7N1) gây chết nhiều gà, gà tây, chim hoang Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Châu Phi, Trung Cận Đông (Phạm Sỹ Lăng cộng sự, 2004) Năm 1963, virus cúm type A phân lập Bắc Mỹ loài thuỷ cầm di trú dẫn nhập vào đàn gà Cuối thập kỷ 60, kết phân lập type H1N1 thấy lợn Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 có liên quan đến ổ dịch gà tây với triệu chứng đặc trưng đường hô hấp giảm đẻ Mối liên hệ lợn gà tây dấu hiệu virus cúm động vật có vú lây nhiễm gây bệnh gia cầm Những nghiên cứu cho thấy phân type H1N1 vịt truyền cho lợn Sự lây nhiễm từ chim hoang dã sang gia cầm có chứng từ trước năm 1970 công nhận xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm cao số loài thuỷ cầm di trú (Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ, 2004) Năm 1971, Beard mô tả kỹ virus gây bệnh đặc điểm lâm sàng gà ổ dịch cúm gà, gà tây xảy Bắc Mỹ gây chủng H7N1 Năm 1979, bệnh phát Canada, Mexico, Achentina (Phạm Sỹ Lăng, 2004) Những cơng trình nghiên cứu có hệ thống bệnh công bố Australia (1975), Anh (1979) Mỹ (1983-1984), Ailen (19831984) đặc điểm sinh học, bệnh học, dịch tễ học, phương pháp chẩn đốn miễn dịch biện pháp phòng chống Từ sau phát virus cúm type A, nhà khoa học thấy virus cúm có nhiều lồi chim hoang dã gia cầm nuôi vùng khác giới Bệnh xảy nghiêm trọng với gia cầm thuộc subtype H5 H7 Dịch cúm gia cầm bùng nổ liên tục khắp châu lục giới thúc đẩy hiệp hội chăn nuôi nhà khoa học tổ chức nhiều hội thảo chuyên đề bệnh cúm gia cầm Từ đến nay, hội thảo dịch tễ giới, bệnh cúm gia cầm nội dung coi trọng Năm 1997, Hồng Kông dịch cúm gà xảy virus cúm type A subtype H5N1 Toàn gia cầm lãnh thổ bị tiêu huỷ bệnh gây tử vong cho người (Nguyễn Hoài Tạo, Nguyễn Tuấn Anh, 2004) Từ cuối năm 2003-2005 có 11 nước vùng lãnh thổ xuất dịch cúm gia cầm H5N1 gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Quốc, Malaysia, Hồng Kơng Việt Nam Ngồi có nước vùng lãnh thổ khác có dịch cúm gia cầm chủng khác Pakistan, Hoa Kỳ, Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 Hình 4.10 Mức độ thải virus ngan sau cơng cường độc Từ bảng 4.10 hình 4.10 nhận thấy: - Ngày thứ sau công cường độc: Lơ ngan thí nghiệm có Ct trung bình 30.05 Lơ ngan đối chứng có Ct trung bình 22.47, có mức thải virus nhiều lơ thí nghiệm khoảng 190 lần (chênh lệch khoảng 7.58 Ct) so với lô tiêm vacxin - Ngày thứ 12 sau cơng cường độc: Ngan lơ thí nghiệm có Ct trung bình cao 34.6 với mức thải virus 0.56 điểm, cá biệt có ngan MD6 chết vào ngày thứ có mức thải virus cao 20.85 Lơ đối chứng ngan chết rải rác vào ngày thứ tới ngày thứ tới ngày thứ 12 khơng ngan sống sót với Ct trung bình 19.2, có mức thải virus nhiều Như vậy: Khi ngan tiêm vacxin có tác dụng làm giảm mức độ thải virus ngồi mơi trường nhiều so với không tiêm vacxin giảm dần từ ngày thứ tới ngày thứ 12 sau cơng (với Ct trung bình từ 30.05 ngày thứ lên tới 34.6 ngày thứ 12 sau cơng) 52 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 4.3.4 Tổng hợp kết mức độ thải virus sau công cường độc Bảng 4.11 Tổng hợp kết thải virus sau cơng cường độc Nhóm Gà Vịt Ngan Thí nghiệm Ct Ngày Ngày 12 Ngày chết 31.32 36.74 21.17 Đối chứng 18.52 Thí nghiệm 36.19 36.82 Đối chứng 27.34 32.88 19.90 Thí nghiệm 30.05 34.6 20.85 Đối chứng 22.47 19.20 : Từ bảng 4.11 cho thấy: mức độ chênh lệch lượng virus thải lô tiêm vacxin lô không tiêm vacxin tương đối lớn, đồng thời mức độ thải virus loài khác khác Mức thải virus chết nhiều với Ct trung bình từ 18.52 tới 21.17, sống sót lơ đối chứng lơ thí nghiệm mức thải giảm dần theo thời gian, đến ngày thứ 12 sau công cường độc, mức độ thải virus giảm nhiều so với thời điểm ngày sau công cường độc Gia cầm tiêm vacxin thải lượng nhỏ virus chí khơng thải Như vậy, dễ dàng nhận thấy hiệu vacxin việc hạn chế lượng virus thải từ thể mang virus cúm gia cầm ngồi mơi trường Điều quan trọng, tác dụng vacxin khơng bảo hộ lâm sàng mà làm giảm khả virus cúm gia cầm nhân lên thể bải thải ngồi mơi trường, làm giảm khả lây lan virus cúm gia cầm A/H5N1 53 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 4.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH SAU CÔNG CƯỜNG ĐỘC Với gà, vịt, ngan tiêm vacxin, có virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 cường độc xâm nhập vào thể, nguồn kháng nguyên bổ sung tạo miễn dịch thứ phát Để kiểm kiểm tra đáp ứng miễn dịch kháng lại virus công cường độc, tiến hành lấy máu vào ngày thứ 12 kiểm tra phản ứng HI: Bảng 4.12 Hiệu giá kháng thể trung bình trước sau cơng cường độc Lô HGKT Gà (log2) HGKH vịt (log2) HGKT ngan (log2) Ngày Ngày 12 Ngày Ngày 12 Ngày Ngày 12 Lơ thí nghiệm 4.8 8.25 5.8 6.9 4.5 6.89 Lô đối chứng N N 3.67 N 54 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 (Ghi chú: N = Negative – âm tính) Hình 4.11 Hiệu giá kháng thể trung bình trước sau công cường độc Qua bảng 4.12 hình 4.11 cho thấy: sau cơng cường độc tất gà, vịt, ngan sống sót lơ cho kết dương tính với kháng thể kháng virus cúm gia cầm A/H5N1, đồng thời hiệu giá kháng thể tiêm vacxin tăng cao so với trước công cường độc Những gà, vịt, ngan sống sót có q trình đáp ứng miễn dịch chống lại mầm bệnh lúc nhiễm virus cúm Ở lơ tiêm vacxin, gà có GMT trước công 4.8log2 virus cường độc xâm nhập vào thể làm kích thích hệ thống miễn dịch thể hoạt động tạo kháng thể đặc hiệu để trung hòa kháng nguyên virus, tạo thay đổi hàm lượng kháng thể thể đến ngày thứ 12 sau công hàm lượng kháng thể tạo cao nhiều so với trước cơng 8.25log Vịt có 55 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 GMT trước công 5.8log2 sau công tăng lên 6.9log Ngan có GMT tăng từ 4.5log2 trước công sau công tăng lên 6.89log2 Ở lô không tiêm vacxin: gà chết đồng loạt vào ngày thứ 2, ngan chết rải rác từ ngày thứ tới ngày thứ 6, vịt có số chết vào ngày thứ 4, thứ Còn vịt sống sót có q trình đáp ứng miễn dịch chống lại mầm bệnh lần tiếp xúc với virus cường độc Như vậy, rõ ràng vacxin giúp kích thích tạo kháng thể nhanh mạnh gà, vịt, ngan bị nhiễm virus cúm gia cầm A/H5N1 cường độc Phần V KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu khố luận, chúng tơi rút kết luận sau: Virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 phân lập từ ổ dịch Kiên Giang đầu năm 2012 có độc lực cao gây chết 100% gà, ngan 40% vịt khơng tiêm vacxin thí nghiệm Vacxin cúm A/H5N1 chủng Re-1 (dùng theo liều định) tạo đáp ứng miễn dịch với GMT gà tiêm mũi vacxin 4.9log 2, vịt 4.2log2 ngan 3.6log2 Đối với vịt sau mũi 6.1 log2 ngan 5.2log2 56 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 Thử nghiệm hiệu lực vacxin cúm A/H5N1 chủng RE-1 cho gà mũi lúc tuần tuổi, vịt ngan tiêm mũi lúc tuần tuổi tuần tuổi cho thấy: công cường độc với virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1, tỷ lệ bảo hộ gà 80%, vịt 100% ngan 90% Việc tiêm vacxin cúm A/H5N1 chủng Re-1 làm giảm rõ rệt mức độ thải virus ngồi mơi trường so với việc khơng tiêm vacxin Có thể tiếp tục sử dụng vacxin để phòng chống dịch bệnh virus cúm gia cầm độc lực cao thuộc Clade 1.1 gây với gà, vịt ngan 5.2 ĐỀ NGHỊ Từ kết luận rút bên chúng tơi có số đề nghị sau: Cần thực cách nghiên ngặt việc tiêm phòng cho đàn gia cầm để góp phần phòng chống dịch cúm gia cầm bảo vệ cộng đồng Cần tiếp tục có nhiều chương trình, đề tài nghiên cứu chuyên sâu đặc tính virus cúm gia cầm chủng độc lực cao, đặc biệt chủng phân lập nhằm phát kịp thời clade để việc sử dụng vacxin có hiệu Cần thường xuyên thực thí nghiệm đánh giá khả bảo hộ loại vacxin cúm gia cầm sử dụng có virus cúm H5N1 tiếp tục biến đổi có virus xuất để đưa định thích hợp phòng chống bệnh cúm 57 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 58 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Thanh Hòa (2012) “Xác định nhóm kháng nguyên 1.1 2.3.2.1 virus cúm A/H5N1 xuất Việt Nam qua phân tích đặc điểm di truyền phả hệ gen Hemagglutinin (H5) giai đoạn 20042005” Tạp chí khoa học kĩ thuật thú y Tập XIX-Số 2, tr 21 Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh (2004) “Bệnh cúm gia cầm biện pháp phòng chống” NXB Nông nghiệp, Hà Nội Phạm Sỹ Lăng, Tơ Long Thành, Cù Hữu Phú, Nguyễn Hồi Nam (2004) Bệnh gia cầm kỹ thuật phòng trị NXB Nông nghiệp, Hà Nội Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ (2004) Bệnh cúm gia cầm: Lưu hành bệnh, chẩn đốn kiểm sốt dịch bệnh Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y Tập XI-Số 3, tr.69 Phạm Sỹ Lăng (2004) Diễn biến bệnh cúm gia cầm Châu Á hoạt động phòng chống bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XI-Số 3, tr.91 Nguyễn Hoài Tạo, Nguyễn Tuấn Anh (2004) Một số thông tin dịch cúm gia cầm Chăn nuôi Số 3, tr.23 Vũ Thị Mỹ Hạnh, Tô Long Thành cộng (2008) Kiểm nghiệm vacxin cúm H5N1 Trung Quốc sử dụng giai đoạn 2006-2007 Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XV-Số 4, tr.25 Báo cáo tình hình dịch cúm gia cầm, hướng dẫn sử dụng vacxin cúm gia cầm giám sát sau tiêm phòng http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=&Itemi Bộ Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn (2005) Kế hoạch dự phòng chống dịch cúm gia cầm chủng độc lực cao Việt Nam 10 Báo cáo cơng tác phòng chống dịch cúm gia cầm http://www.dah.gov.vn/index.php?option=com_k2&view=item id 11 Chỉ thị việc tăng cường biện pháp cấp bách phòng, chống dịch cúm gia cầm http://www.cucthuy.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=&Itemi 59 Khóa luận tốt nghiệp 12 Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 Nguyễn Tiến Dũng (2008) Vài nét virus cúm gia cầm H5N1 Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y Tập XV-Số 4, tr 80 13 Mary J Pantin-Jackwood, Jenny Pfeiffer, Tô Long Thành, Nguyễn Tùng David Suarez (2008) Độc tính virus cúm gia cầm thể độc lực cao H5N1 Việt Nam gà vịt 14 Nguyễn Tiến Dũng cộng (2004) Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 Việt Nam năm 2003-2004 Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XI-Số 3, tr.6 15 Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2010) Giáo trình miễn dịch học Thú y NXB Nông nghiệp Hà Nội 16 Ken Inui (2008) Sự thay đổi virus cúm gia cầm thể độc lực cao H5N1 Việt Nam 17 Trương Văn Dũng (2008) Những kết nghiên cứu đạt bệnh cúm gia cầm Việt Nam Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XV-Số 4, tr 18 Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kì (2004) Bệnh cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn đốnn kiểm sốt dịch bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XI-Số 3, tr 69 19 Tô Long Thành (2005) Một số thông tin bệnh cúm gia cầm Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y Tập XII-Số 1, tr.84 20 Tô Long Thành (2007) Các loại vacxin cúm gia cầm đánh giá hiệu tiêm phòng Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XVI-Số 2, tr.84 21 Lê Văn Năm (2007) Đại dịch cúm gia cầm nguyên tắc phòng chống Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y Tập XIV-Số 2, tr.91 22 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn (2005) Tiêu chuẩn ngành-Quy trình chẩn đốn bệnh cúm gia cầm 23 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn (2005) Tiêu chuẩn ngành-Quy trình mổ khám gia cầm 25 Phạm Hùng Vân (2008) PCR Real-time PCR vấn đề băn ứng dụng thường gặp NXB Y học 26 Tơ Long Thành, Nguyễn Hồng Đăng, Hoàng Đăng Huyến (2008) Đáp ứng miễn dịch gà vịt tiêm vacxin phòng cúm gia cầm tỉnh Bắc Giang Tạp chí khoa học kĩ thuật Thú y Tập XV-Số 6, tr5 60 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp phát kháng nguyên HA Ứng dụng: Phát hiện, định lượng kháng nguyên chuẩn kháng nguyên (virus) phân lập từ bệnh phẩm Chuẩn độ kháng nguyên đơn vị HA dùng cho phản ứng HI Các bước tiến hành: - Cho 25l PBS vào 96 giếng đáy chữ V - Cho 25l kháng nguyên vào giếng cột - Pha loãng kháng nguyên cách chuyển 25l từ giếng sang giếng đến giếng 11 bỏ 25l Giếng 12 có PBS để làm đối chứng hồng cầu - Nhỏ thêm 25l PBS vào tất giếng - Nhỏ 25l hồng cầu gà 1% vào tất giếng - Lắc đĩa máy - Ủ đĩa phản ứng nhiệt độ phòng khoảng 40 phút - Phản ứng dương tính: phản ứng ngưng kết xảy ra, hồng cầu ngưng kết thành hạt lấm màu đỏ thành quầng đáy giếng Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên đánh giá độ pha lỗng cao có phản ứng ngưng kết xảy Phản ứng âm tính: Khơng có phản ứng ngưng kết xảy hồng cầu gà lắng xuống đáy thành cục màu đỏ, nước bên Phụ luc 2: Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI Huyết kiểm tra: huyết gà không cần xử lý RDE, huyết vịt, ngan xử lý RDE để chống tượng ức chế ngưng kết không đặc hiệu xử lý hồng cầu để chống tượng ngưng kết hồng cầu giả 61 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 a Nguyên liệu dụng cụ - Nguyên liệu: - Dung dịch PBS - Kháng huyết cần kiểm tra chắt từ hồng cầu gà trước sau công - Kháng nguyên chuẩn - Hồng cầu gà 1% - Dụng cụ: đĩa phản ứng 96 giếng đáy chữ V dụng cụ cần thiết phòng thí nghiệm b Chuẩn bị kháng nguyên - phản ứng ngưng kết hồng cầu HA xác định hiệu giá kháng nguyên Pha kháng nguyên HA/25l Tính lượng kháng nguyên cần dùng cho số mẫu huyết để đảm bảo lượng kháng nguyên dùng cho phản ứng Chuẩn độ kháng nguyên 4HA: sau pha, kháng nguyên 4HA phải chuẩn độ lại Tiến hành: - Nhỏ 25l PBS 0,01M vào đĩa 96 giếng đáy chữ V từ giếng đến giếng hàng - Cho 25l kháng nguyên 4HA vào giếng thứ - Pha loãng kháng nguyên cách chuyển 25l kháng nguyên 4HA từ giếng thứ sang giếng thứ đến giếng bỏ 25l - Nhỏ thêm 25l PBS vào giếng - Nhỏ 25l hồng cầu gà 1% vào tất giếng - Lắc đĩa máy - Ủ đĩa phản ứng nhiệt độ phòng khoảng 40 phút Pha chuẩn: kết ngưng kết xảy giếng đầu Pha không chuẩn: 62 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị - Lớp TYA - K52 - Kháng nguyên đặc: ngưng kết đến giếng thứ tức thừa kháng nguyên Như kháng ngun 8HA phải pha lỗng để có ngưng kết đến giếng thứ - Kháng nguyên loãng: ngưng kết đến giếng thứ tức thiếu kháng nguyên, thêm lượng kháng nguyên (bằng với lượng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngưng kết đến giếng thứ c Tiến hành phản ứng HI - Nhỏ 25l PBS vào giếng đĩa 96 giếng - Nhỏ tiếp 25l kháng huyết vào giếng - Pha loãng kháng huyết theo số 2, cách chuyển 25l kháng huyết từ giếng sang giếng đến giếng 11 bỏ 25l giếng cuối - Nhỏ 25l kháng nguyên 4HA chuẩn bị vào giếng từ giếng 1-`12 - Lắc đĩa ủ nhiệt độ phòng 30 phút - Nhỏ 25 l huyễn dịch hồng cầu vào tất giếng đĩa, lắc Đọc kết quả: - Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy Hiệu giá HI mẫu tính độ pha lỗng huyết cao có tượng ức chế ngưng kết hồng cầu Huyết coi dương tính có hiệu giá huyết ≥1/16 Huyết đối chứng âm tính phải có hiệu giá ≤1/4 - Phản ứng âm tính: hồng cầu bị ngưng kết Chú ý: kiểm tra huyết lồi khác khơng phải gà nên có giếng có huyết hồng cầu để kiểm tra tượng ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu Nếu phát thấy có ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu xảy với mẫu huyết cần xử lý lại mẫu huyết kiểm tra lại phản ứng HI 63 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 Phụ lục 3: Thành phần cách pha nguyên liệu dùng chẩn đoán cúm Dung dịch PBS 0,01M pH 7,2 Na2HPO4 1,096 g NaH2PO4.H2O 0,316 g Na Cl 8,5 g Nước cất lít Chỉnh pH = 7.2 NaOH 1N HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 40C không tuần Huyễn dịch hồng cầu gà 1% - Gà trống khoẻ mạnh, trưởng thành, khơng có kháng thể cúm newcastle - Dùng bơm tiêm 5-10ml hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống đông (Natri citrat 4%) lấy máu tĩnh mạch cánh, cho máu vào ống nghiệm - Ly tâm 1000-1500 vòng/phút, 15 phút, đổ bỏ huyết tương, cho thêm PBS 0,01M pH 7,2 vào hồng cầu, lắc Ly tâm 3-4 lần để rửa hồng cầu Sau lần ly tâm cuối hút bỏ nước - Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% cách pha 1ml hồng cầu với 99ml nước muối sinh lý - Bảo quản huyễn dịch hồng cầu nhiệt độ 4-80C Hồng cầu sau pha dùng 4-5 ngày (nếu hồng cầu bị dung huyết loại bỏ khơng dùng) 64 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 Phụ lục 4: Bảng trình tự chuỗi mẫu dò primer cho RRT-PCR phát cúm gia cầm Target Virus (Gene) PPP Name (Source) Influenza A virus (Matrix) M-4 (CDC) Mỹ Influenza A virus subtype H5 (HA2) H5-3S (AAHL+ Probe HA 2-3) (Úc) Influenza A virus subtype N1 (HA2) N1-2 (JVM) (Nhật) Primer/ Probe Sequence (5'-3') Probe Modification 5' 3' TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1 Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA HEX BHQ1 Probe TCAACAGTTGCGAGTTCTCTAGCA HEX BHQ1 Forward ACG TAT GAC TAC CCG CAG TAT TCA None None Reverse AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC None None Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1 Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None 63 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 Phụ lục 5: Bảng chu kỳ nhiệt bước phiêm mã ngược (RT) dùng cho Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian (giây) 50 900 Phiên mã ngược Biến tính Bám mồi kéo dài chuỗi Số chu kỳ 95 120 95 10 40 60 30 Phụ lục 6: Phương pháp xử lý huyết dùng phản ứng HI Xử lý với RDE (Receptor Destroying Enzyme): - Trộn phần RDE với phần huyết - Ử nhiệt độ 370C nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 56 0C/30 phút để vơ hoạt RDE dư - Huyết xử lý để nguội, cho thêm phần nước muốn sinh lý, độ pha loãng cuối kháng huyết 1/10 Xử lý với hồng cầu gà: Hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu giả xử lý cách hấp phụ huyết kiểm tra với hồng cầu gà Thêm 25l hồng cầu đặc vào 500l huyết thanh, lắc nhẹ để nhiệt độ phòng 30 phút, sau ly tâm tốc độ 8000 vòng/2-5 phút Thu lấy huyết xử lý 64 ... “ Đánh giá hiệu lực vacxin cúm A/H5N1 chủng RE-1 Trung Quốc sản xuất virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 gà, vịt ngan 2.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Đánh giá hiệu lực vacxin cúm A/H5N1 chủng RE-1 Trung. .. nuôi Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy phương - Vacxin cúm gia cầm tái tổ hợp vô hoạt subtyp H5N1 chủng Re-1 Trung Quốc sản xuất - Virus: virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 thuộc clade 1, Trung. .. Trung Quốc sản xuất virus cúm gia cầm A/H5N1 clade 1.1 gà, vịt ngan Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Aí - Lớp TYA - K52 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM BỆNH CÚM GIA CẦM Bệnh cúm gia cầm